劉春龍

摘 要：近年來，隨著科技的發(fā)展，廣譜抗生素及免疫抑制劑在臨床被廣泛使用，免疫缺陷患者、癌癥患者、器官移植患者及血液病患者等感染侵襲性真菌病概率急劇升高。真菌病感染如果不能早期治療，死亡率極高。其中，曲霉特別是煙曲霉（Aspergillus fumigatus）已經(jīng)逐漸成為臨床上一種重要的致病真菌。目前傳統(tǒng)的侵襲性曲霉菌感染檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是無菌體液培養(yǎng)和組織活檢。但傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法陽性率低、周期長，極大的貽誤病情，因此，檢測煙曲霉抗原是目前臨床公認(rèn)的快速早期診斷煙曲霉菌感染的有效方法。煙曲霉菌的主要抗原成分是半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM），所以血清中GM抗原檢測是一種快速、高效、特異性的早期診斷曲霉菌感染的方式。目前國內(nèi)對曲霉菌半乳甘露聚糖提取純化的研究不多，本次研究以煙曲霉的菌體為原料，研究了GM抗原的提取工藝及后期純化的方式。通過液氮研磨、超聲等方式對曲霉菌半乳甘露聚糖進(jìn)行提取，獲得粗提物后用無水乙醇以及水肼和亞硝酸處理。并將上述處理得到的溶液用MonoQ層析柱及超濾技術(shù)進(jìn)行抗原純化，最終獲得了GM抗原純品。通過紫外分光光度及液相色譜等技術(shù)對提取的抗原進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)化曲霉菌半乳甘露聚糖提取工藝制備得到的半乳甘露聚糖抗體的得率較高且純度較好。

關(guān)鍵詞：曲霉菌；半乳甘露聚糖；侵襲性真菌?。粌?yōu)化工藝；生物活性

中圖分類號：R44 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）27-0052-02

常見的真菌比細(xì)菌大幾倍甚至幾十倍，因此結(jié)構(gòu)也比細(xì)菌要復(fù)雜得多。真菌與細(xì)菌相比，細(xì)胞壁較厚，約占干重的30%以上，但真菌細(xì)胞壁缺乏黏肽，而是由結(jié)構(gòu)不同的多糖如甘露糖、葡聚糖、脫乙酰殼多糖及幾丁質(zhì)等組成，部分還含有蛋白質(zhì)及類脂體成分[1]。

GM抗原廣泛存在于曲霉菌屬的菌絲及孢子中，在部分植物中也會存在這種成分，比如大豆，GM抗原干粉的外觀為白色、粉末狀，在酸、鹽環(huán)境下有極好的耐受性，比較耐熱，在水中溶解度非常大，可形成透明溶液，GM抗原是一種以甘露聚糖為主鏈，以呋喃半乳糖為側(cè)鏈的多糖。

根據(jù)不同的GM抗原中甘露聚糖與呋喃半乳糖的比例不同，從不同植物或真菌提取的抗原有很多不同的應(yīng)用[2]。提取自豆類等植物中的半乳甘露聚糖具有很低的熱量，常被用于食品行業(yè)生產(chǎn)中作為黏稠劑和穩(wěn)定劑使用，而且半乳甘露聚糖還具有很多生理功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和美容中。在煙曲霉整個生產(chǎn)周期中，GM抗原最早在穩(wěn)定期出現(xiàn)，從菌絲端進(jìn)行釋放，GM抗原也是最早釋放的曲霉菌的抗原，而GM抗原也是煙曲霉菌細(xì)胞壁獨有的組成部分，它還是一種致病性抗原，常作為臨床檢測和診斷的標(biāo)志物[3]。

鑒于煙曲霉主要細(xì)胞壁成分為半乳甘露聚糖，其他種類的多糖量很少，因此考慮通過液氮及超聲波處理提高煙曲霉粗提物的得率。在利用超濾技術(shù)可有效去除溶液體系中特定分子量以下的高分子有機物[4]。對煙曲霉抗原粗提物進(jìn)行純化，從而獲得了純度在93%以上的半乳甘露聚糖抗原。本方法原理簡單，操作時間短，條件易掌控，便于批量生產(chǎn)，非常有利于作為抗體生產(chǎn)過程的免疫原制備。

1 材料與方法

1.1 材料

本論文所采用的煙曲霉菌株購買自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙曲霉菌活化及培養(yǎng)

配制沙氏液體培養(yǎng)基及配制沙氏固體培養(yǎng)基：之后將液體培養(yǎng)基趁熱倒入干燥無菌的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿倒15ml；在室溫下，生物安全柜中融化-20℃保存的菌液，每塊培養(yǎng)皿涂50μL，涂2塊，用封口膜封好，30℃培養(yǎng)2-3天。

待平板上菌體長大變綠之前，在平板上劃線轉(zhuǎn)接，用封口膜封好，30℃培養(yǎng)2-3天；待平板上菌體長大變綠之前，將長有新生菌絲的培養(yǎng)基取小塊，倒置轉(zhuǎn)接到6個平板上，30℃培養(yǎng)2-3天[5]。

1.2.2 半乳甘露聚糖粗提物提取

從曲霉菌平板上取帶有新生菌絲的小塊培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接在沙氏液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天； 在沙氏液體培養(yǎng)基中加入甲醛溶液，使甲醛終濃度為3.7%，于4℃放置24小時滅活菌體；后用滅菌紗布過濾，用預(yù)冷的生理鹽水重懸菌體后，反復(fù)洗滌6-10次；在離心后的沉淀物中加入液氮，用滅菌的研缽研磨破碎5次，加水（20倍），冰浴下使用探頭式超聲破碎儀，破碎30min，破碎液在-20℃冰箱中保存。

1.2.3 半乳甘露聚糖濃度的測定[3]

（1）配制5%苯酚溶液：量取一定量苯酚（AR），并對它進(jìn)行高溫蒸餾，在180℃進(jìn)行收集餾分，再稱取上述液體50g，用水溶解，最后定容于1000ml棕色容量瓶中，冷卻避光保存。（2）配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（200mg/L）：精稱110℃恒重的葡萄糖20mg，用水溶解，定容至100ml；再精密吸取2.0，4.0，8.0，10.0ml分別置于100ml量瓶中加水定容至刻度，搖勻即得葡萄糖稀釋液。（3）樣品的測定：加入2mL上述葡萄糖稀釋液，加至25ml比色管中，加入1mL配制好的苯酚溶液，并立即加入5.0ml濃硫酸，充分搖勻，并在常溫放置30min，各樣品分別做兩組平行。（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：以上述2.0ml水的空白溶液做對照組，用紫外分光光度計在490nm波長處測定各樣品吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 半乳甘露聚糖純化

將所得粗提物轉(zhuǎn)移至潔凈燒杯中，按照體積比加入4倍體積無水乙醇。并放置在4℃冰箱進(jìn)行過夜純沉。對純沉物進(jìn)行收集，并溶于去離子水中。按照體積比加入4倍體積無水乙醇，靜置1小時。對沉淀物再次進(jìn)行收集，沉淀物用無水乙醇洗滌三次。離心并棄去上清。將所得沉淀物用去離子水溶解，并將活性炭加入到上述溶液中，用磁力攪拌器進(jìn)行混勻3h。endprint

室溫抽濾，除去活性炭顆粒。所得溶液經(jīng)過0.22μm濾膜進(jìn)行過濾。濾液轉(zhuǎn)移至10KD離心超濾管，5000g離心10分鐘。即得到半乳甘露聚糖純品。

2 結(jié)果分析

半乳甘露聚糖提取實驗影響因素分析。

（1）半乳甘露聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗結(jié)果如圖1，其線性回歸方程為Y=0.0577X-0.1506，R2=0.9961。

圖1 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）用Dubois-硫酸苯酚法對本發(fā)明的制備方法得到的半乳甘露聚糖抗原純化樣品進(jìn)行多糖含量測定，結(jié)果從5g煙曲霉菌體最終可得到150mg 半乳甘露聚糖抗原純品。

（3）對本論文的制備方法得到的GM抗原純化樣品進(jìn)行紫外吸收檢測。分別在UV260納米、UV280納米、UV320納米波長下檢測樣本，檢測結(jié)果抗原濃度為1.35mg/mL含量占比93.18%，蛋白質(zhì)濃度為87.64μg/mL含量占比為6.49%，DNA含量占比為0.33%?？梢娍乖兌容^高，能夠達(dá)到93%以上。

對本論文的制備方法得到的GM抗原純化樣品進(jìn)行HPLC檢測。檢測器為示差折光檢測器，樣品出峰單一，尖窄，并無明顯雜峰出現(xiàn)，說明所含物質(zhì)大小均一，純度較高。

3 結(jié)束語

GM抗原是侵襲性曲霉菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)中重要的微生物學(xué)依據(jù)，對實現(xiàn)侵襲性曲霉菌感染的早期診斷，給臨床提供輔助依據(jù)，同時動態(tài)監(jiān)測血清水平GM變化有助于判斷抗真菌治療的效果?？梢?，擁有一套完整且高效提取半乳甘露聚糖抗原的工藝流程是廣泛生產(chǎn)并應(yīng)用ELISA檢測試劑盒的關(guān)鍵，同時，半乳甘露聚糖具有生物活性，是醫(yī)學(xué)上IFD體外診斷試劑開發(fā)的優(yōu)質(zhì)實驗材料。

本實驗通過對傳統(tǒng)曲霉菌半乳甘露聚糖提取工藝流程優(yōu)化改進(jìn)，使半乳甘露聚糖的提取效率更加高效，增加生產(chǎn)的優(yōu)勢；用時短，易取材，操作簡便。用該方法純化的煙曲霉半乳甘露聚糖抗原能達(dá)到較高純度。因此，這套工藝可用于血清半乳甘露聚糖檢測試劑盒的研發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]王麗.煙曲霉基因組與致病機制[J].中國真菌學(xué)雜志，2011，6（1）：1-2.

[2]廖萬青.深部真菌感染主要病原菌的致病機理研究進(jìn)展[A].2005全國首屆深部真菌感染學(xué)術(shù)會議論文集[C].2005.

[3]徐杰偉，李啟欣，何艷嫦.檢測患者血清半乳甘露聚糖用于曲霉菌感染診斷的應(yīng)用評價[J].檢驗與臨床，2012，50（20）：74-75.

[4]車小燕，等.1組曲霉單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國真菌學(xué)雜志.2008，3（3）：129-133.

[5]DIRK STYNEN，等.INFECION AND IMMUNITY.1992，60（6）：2237-2245.endprint