王丹丹，張彥文，2

(1.遼東學院農學院，遼寧 丹東118003； 2.東北師范大學草地研究所，吉林 長春 130024)

軟棗獼猴桃栽培品種DNA 指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析

王丹丹1，張彥文1，2

(1.遼東學院農學院，遼寧 丹東118003； 2.東北師范大學草地研究所，吉林 長春 130024)

為了對軟棗獼猴桃栽培品種進行分子鑒別及分析不同品種間的親緣關系，采用對葉片直接進行PCR擴增的方法，利用EST-SSR分子標記技術構建了常見的42個軟棗獼猴桃品種的數字指紋圖譜和模式指紋圖譜數據庫(cluster project)，并進行了遺傳多樣性分析.結果表明：利用21對軟棗獼猴桃核心引物擴增所有品種的基因組，共檢測到132個等位位點，包括122個多態(tài)性位點，多態(tài)性比率為92.4%.每對引物擴增出的等位位點數為3～8個，平均每對引物擴增6.28個基因型，擴增條帶大小100～300 bp，多態(tài)信息含量(polymorphism information content，CPIC)為0.721，基因流為1.454，平均雜合率為0.691.其中，7對引物，即ACAR2，ACAR13，ACAR53，ACAR75，ACAR92，ACAR112和ACAR120可作為指紋圖譜構建的首選引物，利用其中的ACAR2，ACAR13，ACAR53和ACAR75以引物組合方式構建指紋圖譜可區(qū)分42個品種.聚類分析表明在遺傳距離0.64處42個品種被分為一類，在遺傳距離0.81處分為4類.聚類結果與品種的特性及來源具有較高的一致性.

軟棗獼猴桃；EST-SSR標記；指紋圖譜；遺傳多樣性；聚類分析

品種真實性和純度鑒定的方法主要有形態(tài)學鑒定法、生物化學法及分子標記鑒定法.由于受材料本身以及環(huán)境條件的影響，前兩種方法已很少作為品種真實性和純度鑒定的單一的評判標準.[12-15]而分子標記鑒定法 (expressed sequence tag-simple sequence repeats，EST-SSR)以其分子標記為共顯性、擴增的譜帶少、易識別、統(tǒng)計方便[15-17]，以及EST來自DNA編碼區(qū)其序列保守性相對較高等優(yōu)點，已成為品種真實性和純度鑒定的有效方法[18-19].我國已建立了多種植物的指紋圖譜以鑒定種質的真實性和純度，如《水稻品種鑒定DNA指紋法》NY/T1433-2007、《玉米品種鑒定DNA指紋法》NY/T1432-2007等[20-24]，而利用EST-SSR分子標記構建軟棗獼猴桃DNA指紋譜圖的研究尚未見報道[25-27].本研究采用EST-SSR分子標記技術建立了軟棗獼猴桃DNA指紋譜圖，為其種質資源的真實性和純度鑒定奠定了基礎.同時，在研究過程中，采用對葉片直接進行PCR擴增的方法，簡化了實驗程序、優(yōu)化了PCR體系.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗采用的42個軟棗獼猴桃栽培品種分別來自5個國家，具有不同的遺傳背景.種子由國內主要軟棗獼猴桃研究所或品種引進機構提供.春季或夏季采集生長旺盛的健康、幼嫩葉片于硅膠中干燥保存，以備提取基因組DNA.[28]實驗分析工作在遼東學院農學院進行.

1.2 葉片的堿處理

將葉片剪碎，大小不超過2 mm2，否則不宜進行后續(xù)的PCR擴增.將葉片放入含有40 μL 0.25 mol/L NaOH的Eppendorf管中，沸水煮30 s；加入40 μL 0.25 mol/L HCl和20 μL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH=8.0，含有0.25% 的Nonidet-P-40)，再次置于沸水中2 min，隨后取出葉片，直接進行PCR擴增.

1.3 EST-SSR PCR擴增

在50 μL PCR反應體系中加入1片經堿處理的葉片.反應液組成為：dNTPs (2.5 mmol/L ) 4 μL，引物(10 μmol/L)各1.8 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，MgCl2(1.5 mmol/L) 3 μL，10×緩沖液5.0 μL，加滅菌的ddH2O至總體積50 μL.PCR反應程序：94℃預變性10 min；94℃變性30 s，58℃～62℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min.產物4℃保存[29].

擴增產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色和圖譜分析[30].實驗所用的21對引物是作者從先前196對EST-SSR引物中篩選出來的[31]，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等特點(見表1).引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.4 數據處理

(4) 第四層時間服務：連接信號子網的網關A和網關B作為NTP服務的服務器端來提供時間服務，信號子網內的所有主機(包括ATC車載設備、ATC其它軌旁設備和DCS設備)作為NTP服務的客戶端來同步兩個網關的時間。

2 結果與分析

2.1 EST-SSR引物擴增

利用21對引物對42份軟棗獼猴桃進行擴增，部分引物擴增結果見圖1.實驗共獲得132個等位位點，包括122個多態(tài)性位點，多態(tài)性比率為92.4%.每對引物擴增出的等位位點數為3～8個，每對引物平均擴增6.28個基因型，擴增的條帶大小介于100～300 bp.多態(tài)信息含量(CPIC)是表示微衛(wèi)星DNA變異程度高低的一個指標，反映微衛(wèi)星DNA多態(tài)性高低，其大小取決于檢測的等位基因的數目和該基因的基因頻率分布，一般來說，CPIC>0.5，多態(tài)性較高；0.5≥CPIC≥0.25多態(tài)性適中；CPIC<0.25，多態(tài)性較低.而本研究21對EST-SSR引物的平均CPIC值為0.721(0.503～0.899，見表1)，表現出了較高的多態(tài)性；基因流(Nm)平均值為1.454(0.809～3.100，見表1)，FST平均值為0.158(0.077～0.236，P<0.05，見表1).

表1 EST-SSR引物在42份供試材料中的擴增情況

圖1 引物ACAR92對軟棗獼猴桃擴增的電泳圖譜

2.2 EST-SSR指紋圖譜的構建

由于同一引物在不同品種中擴增的條帶具有差異，同一電泳位置上有帶記為1，無帶記為0.將數據輸入Excel中，按照條帶從小到大的順序排列，同一豎排中進行數據排序，將0和1 分開以便于比對，再將此排中0或者1最少的一組單獨提出，隨即刪除第一排，而后再對第二排進行同樣的排序、比對，以此類推，便能逐步比對出與所有品種完全不同的0，1指紋及其所代表的品種，亦能找到指紋完全相同的品種.21對引物中有7對引物具有區(qū)別不同品種的能力，即ACAR2，ACAR13，ACAR53，ACAR75，ACAR92，ACAR112和ACAR120(見表2).ACAR2區(qū)別品種最多，為3，8，9，14，16，20，23，26，30，33，34，37和40號品種，其中4，15，27，29，32和35號品種帶型一致；17，25，31，41和42號品種帶型一致；5，11，22，28和39號品種帶型一致；10，13，19，21和24號品種帶型一致；18和36號品種帶型一致.

表2 基于7對EST-SSR引物區(qū)分42份品種的能力

根據7對引物的多態(tài)性，采用特殊引物法可鑒定32份軟棗獼猴桃品種，其余10種不能鑒定，即2，5，10，15，24，28，32，35，38和41號品種.因此，本研究采用引物組合法只需4對EST-SSR引物便可完全區(qū)分42份軟棗獼猴桃品種，指紋圖譜見表3.采用ClusterProject軟件對構建的指紋圖譜數據進行分析形成指紋模式圖譜(見圖2)，由此，應用兩種EST-SSR指紋分析方式共同建立了軟棗獼猴桃的指紋圖譜數據庫.

表3 軟棗獼猴桃品種的DNA數字指紋圖譜

圖242份軟棗獼猴桃品種的EST-SSR指紋模式圖譜

2.3 聚類分析

采用UPGMA進行聚類分析，構建了42份軟棗獼猴桃品種的遺傳關系樹狀圖(見圖3).42份軟棗獼猴桃品種被劃分為4個類群(見表4)，聚類結果與品種的特性、來源具有較高的一致性，即來源于同一地區(qū)(或國別)和形態(tài)特性相似的品種聚在一個類群.第一類群有28個品種，包括日本品種茂綠，該類群中大部分為綠果皮、綠果肉的品種；第二類群有10個品種，包括新西蘭的薩多瓦、烏克蘭的赤焰、庫庫瓦、維基、韋狄4個品種以及國內的LD1442、紅佳麗、天源紅、紅寶石星、LD1443的5個品種，表明它們的遺傳關系極為相近，這些品種基本上為紅果皮或紅肉系列.國外品種和國內品種聚在一起，表明很多國內品種具有國外品種的血統(tǒng)，是授粉系和優(yōu)良不育系反復使用的結果.第3類群有3個品種，即花之井、峰香和里泉，均來自于日本.第4類群僅有1個品種Chiak，與其他41個品種之間的平均遺傳距離為0.451，最大遺傳距離為0.871，為所有品種間遺傳距離最大的，表明該品種的遺傳基礎與其他品種差別較大.

圖3 42份軟棗獼猴桃品種遺傳關系樹狀圖

類群品種個數品種名稱Ⅰ28金香玉、綠珍珠、LD133、LD237、LD241、LD126、恒優(yōu)1號、珍玉1號、珍玉2號、珍玉3號、魁綠、8131、63?8、T4?5?2、T5?5?3、長江1號、茂綠、佳綠、9701、綠野12號、寶貝星、豐綠、8401、T9?4?2、T5?3?1、T6?4?1、14?6?2、S8?3?2Ⅱ10LD1442、紅佳麗、天源紅、紅寶石星、LD1443、韋狄、薩多瓦、庫庫瓦、赤焰、維基Ⅲ3花之井、峰香、里泉Ⅳ1Chiak

3 討論

本文研究的42個軟棗獼猴桃品種來自不同的國家，中國22個品種，新西蘭4個品種，烏克蘭1個品種，日本4個品種，韓國1個品種.聚類分析在遺傳距離0.64處將所有品種分為4類，這4類群基本上是以品種性狀和國別進行的類別劃分.此外，同一產地的品種聚在一起的較為普遍，比如產于遼寧丹東的珍玉1號、珍玉2號和珍玉3號，說明目前生產上同一地區(qū)反復使用同一授粉系或者不育系雜交配種的現象較普遍，導致群體內部基因流較大(Nm為1.454，基因流是基因在群體間的流動，是影響群體內部和群體之間遺傳變異程度的重要因素).觀測雜合度Ho都略低于期望雜合度He(雜合度的高低反映了居群基因型的一致性，見表1)，性狀相似現象亦較為普遍，造成同一地區(qū)遺傳基礎較差.此外，有些國產品種和國外品種聚在一起，親緣關系較近，說明了國際合作育種工作已有成效.為了避免我國軟棗獼猴桃遺傳基礎出現狹窄現象，未來通過加強國內外合作育種，雜交配成更加優(yōu)良的軟棗獼猴桃品種是非常有必要的.

目前，很多國家審定新品種都需要進行植物新品種測試(DUS測試)，證明新品種的特性以及與現有品種的不同，而部分品種僅僅是育種者提供品種，經過區(qū)域試驗后，對于達到要求的品種即可申請為新品種，而對于新品種的描述也只限于形態(tài)學的特征，造成品種同物異名和異物同名等現象.而利用EST-SSR為基礎的分子標記技術具有明顯的優(yōu)勢，如不含內含子，在各組織、各發(fā)育時期均可檢測到，且不受季節(jié)、環(huán)境等因素的限制；數量多可覆蓋整個基因組；多態(tài)性高，成共顯性，能夠鑒別出純合、雜合基因型等，即使品種間形態(tài)學差異較小，只要在遺傳基礎上仍有差異，EST-SSR就可發(fā)揮作用.

本研究采用對葉片直接進行PCR擴增的方法，簡化了PCR程序，篩選出適合鑒定真實性和純度的4對核心引物，構建了現有軟棗獼猴桃種質的DNA指紋數字圖譜和EST-SSR指紋模式圖譜數據庫，對解決軟棗獼猴桃出現的品種糾紛問題將有極大的幫助.隨著軟棗獼猴桃新品種的逐年出現，指紋圖譜構建工作仍需不斷加密，仍需要大量篩選出新的軟棗獼猴桃EST-SSR核心引物，以為新品種做指紋圖譜，保證我國軟棗獼猴桃產業(yè)健康有序的繁榮發(fā)展.

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(責任編輯：方林)

EstablishmentofDNAfingerprintingandanalysisofgeneticdiversityamongActinidiaargutacultivars

WANG Dan-dan1，ZHANG Yan-wen1，2

(1.College of Agriculture，Eastern Liaoning University，Dandong 118003，China； 2.Grassland Research Institute，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

In order to identify the cultivars ofActinidiaargutaand analyze the genetic relationship among different cultivars at a molecular level，we constructed the digital fingerprint and model fingerprint(ClusterProject)for 42 commonA.argutacultivars using EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeats) molecular markers.The 21 pairs of primers amplified a total of 132 alleles including 122 polymorphic alleles with a polymorphism rate of 92.4%.Each pairs of primers can amplify 3～8 alleles，with an average of 6.28 alleles per locus.The length of amplified products was 100～300 bp，with the mean value ofCPIC(polymorphism information content) being 0.721，Nm(gene flow) being 1.454，and the mean value ofHo(heterozygosity) being 0.691.Among the 21 primers，7 primers can be used as a preferred choice for fingerprinting，namely ACAR2，ACAR13，ACAR53，ACAR75，ACAR92，ACAR112 and ACAR120，in which 4 primers (ACAR2，ACAR13，ACAR53 and ACAR75) can be employed in combination to identify the 42 cultivars.Cluster analysis showed that the 42 cultivars can be divided into one group at a genetic distance of 0.64，and four groups at a distance of 0.81.The genetic relationship as indicated by the cluster completely reflected the characteristics and the source of the cultivars.

Actinidiaarguta；EST-SSR markers；fingerprinting；genetic diversity；cluster analysis

1000-1832(2017)03-0104-08

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.03.022

2016-09-23

國家自然科學基金資助項目(31370400)；丹東市2016科技攻關項目(2016KJ001)；遼東學院青年基金資助項目(2015QN006).

王丹丹(1982—)，女，碩士研究生，講師，主要從事分子生物學研究.

Q 663.4 [學科代碼] 180·5155

A