黃 程， 雷艷萍， 李曉媚， 林 瑗， 肖 欽， 熊 燕

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣州蛇毒研究所， 廣東 廣州 511436)

內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物在糖尿病大鼠勃起功能障礙中的作用*

黃 程， 雷艷萍▲， 李曉媚， 林 瑗， 肖 欽， 熊 燕△

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣州蛇毒研究所， 廣東 廣州 511436)

目的： 探討內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸(ADMA)在糖尿病大鼠勃起功能障礙中的作用及其機(jī)制。方法： 采用高脂飼養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)8周病程的2型糖尿病大鼠模型；麻醉下分離大鼠陰莖海綿體，用器官浴槽方法檢測(cè)海綿體對(duì)乙酰膽堿的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)以反映其勃起功能；檢測(cè)血清ADMA含量；檢測(cè)海綿體組織NOS活性及一氧化氮(NO)和環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)含量；用Western blot檢測(cè)海綿體ADMA信號(hào)通路蛋白和磷酸二酯酶5(PDE5)的表達(dá)；檢測(cè)超氧化物歧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛含量以評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激。結(jié)果： 糖尿病大鼠血糖升高，胰島素敏感性降低，表明糖尿病大鼠模型建立成功；與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠海綿體舒張功能明顯降低，血清ADMA濃度升高，海綿體組織NOS活性及NO和cGMP含量降低，ADMA生成酶蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1表達(dá)上調(diào)，ADMA代謝酶二甲基精氨酸二甲胺水解酶1、2及ADMA靶酶內(nèi)皮型NOS和神經(jīng)元型NOS表達(dá)下調(diào)，PDE5蛋白表達(dá)上調(diào)，氧化應(yīng)激增加；體外用ADMA孵育正常大鼠離體海綿體，亦可產(chǎn)生與糖尿病大鼠海綿體相似的舒張功能障礙及NO和cGMP含量減少。結(jié)論： 內(nèi)源性NOS抑制物ADMA蓄積是導(dǎo)致糖尿病大鼠勃起功能障礙的重要原因，其機(jī)制可能與減少NO生成、增加氧化應(yīng)激有關(guān)。

糖尿??； 非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸； 勃起功能障礙； 陰莖海綿體； 一氧化氮

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是嚴(yán)重危害人們健康的常見(jiàn)病[1]，糖尿病易并發(fā)性功能障礙，在男性主要表現(xiàn)為陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED；俗稱(chēng)陽(yáng)痿)。臨床調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，50%以上男性糖尿病患者伴有ED，糖尿病患者罹患ED的風(fēng)險(xiǎn)為非糖尿病個(gè)體3倍，并比非糖尿病個(gè)體提前10～15年發(fā)生；有研究預(yù)計(jì)到2025年全球ED患者將達(dá)到3.22億[2]。雖然糖尿病性功能障礙沒(méi)有糖尿病心血管并發(fā)癥的高致死率，但嚴(yán)重影響人們的身心健康與生活質(zhì)量。隨著人們對(duì)生活水平和質(zhì)量要求的不斷提高，闡明糖尿病性功能障礙的發(fā)生機(jī)制，研發(fā)有效的靶向藥物以及治療糖尿病性功能障礙已引起病人、家庭和社會(huì)的普遍重視與廣泛關(guān)注。

陰莖勃起實(shí)際上是神經(jīng)調(diào)節(jié)的血管活動(dòng)，主要依賴(lài)于海綿體神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞合成、釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)，后者通過(guò)活化海綿體平滑肌細(xì)胞中鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，催化三磷酸鳥(niǎo)苷轉(zhuǎn)化成環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)，從而使陰莖海綿體動(dòng)脈平滑肌舒張、海綿體血竇充血使陰莖脹大勃起[3-4]；隨后腹下神經(jīng)的交感神經(jīng)纖維興奮，激活海綿體平滑肌細(xì)胞磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5，PDE5)促使cGMP降解，引起海綿體平滑肌收縮，阻止動(dòng)脈血流入陰莖而使勃起終止。由此可見(jiàn)，陰莖勃起與其海綿體平滑肌舒張功能密切相關(guān)，而NO釋放量和PDE5活性是影響其勃起功能的重要因素。已知PDE5抑制劑是臨床上治療ED的一線(xiàn)藥物，但近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，PDE5抑制劑對(duì)糖尿病ED患者的療效并不理想[5],提示糖尿病ED可能不是由于cGMP的降解加快所致，而是由于NO的合成、釋放減少導(dǎo)致cGMP來(lái)源不足所引起。研究表明內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)催化合成的NO在陰莖勃起功能調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用。機(jī)體內(nèi)存在一種調(diào)節(jié)NO合成的內(nèi)源性機(jī)制： L-精氨酸的同系物非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)可與L-精氨酸競(jìng)爭(zhēng)NOS結(jié)合位點(diǎn)，抑制NOS，減少NO生成；因此，ADMA被公認(rèn)為機(jī)體內(nèi)主要的內(nèi)源性NOS抑制物[6]。ADMA抑制NOS，不僅可減少NO合成，還可使NOS解偶聯(lián)，增加超氧陰離子生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加[7]。體內(nèi)ADMA主要是由蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(protein arginine methyltransferase 1，PRMT1)催化含精氨酸殘基蛋白質(zhì)甲基化，再經(jīng)蛋白水解作用而釋放，并主要經(jīng)二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)代謝；因此，PRMT1和DDAH是體內(nèi)調(diào)節(jié)ADMA水平的重要因子[8]。我室和國(guó)內(nèi)外學(xué)者大量研究表明，糖尿病患者和動(dòng)物血清內(nèi)源性ADMA水平明顯升高，血管性和老齡性ED患者和動(dòng)物血清內(nèi)源性ADMA濃度也明顯升高[9-12]，提示內(nèi)源性ADMA蓄積可能參與了ED的病理生理過(guò)程。因此，本研究擬在8周糖尿病大鼠模型揭示糖尿病ED與內(nèi)源性ADMA蓄積的相關(guān)性；再在正常大鼠離體海綿體，觀(guān)察內(nèi)源性NOS抑制物ADMA對(duì)海綿體平滑肌舒張功能的直接影響，證明內(nèi)源性ADMA蓄積在糖尿病ED中的重要作用，為闡明糖尿病ED的發(fā)生機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1主要試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、ADMA、Nω-硝基-L-精氨酸(Nω-nitro-L-arginine,L-NNA)、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)和乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)均購(gòu)自Sigma；抗PRMT1、DDAH1和DDAH2多克隆抗體購(gòu)自Abcam；抗eNOS、nNOS、 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和β-actin多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；NO含量、NOS活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒及RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自Beyotime； ELISA檢測(cè)cGMP試劑盒購(gòu)自上海研吉生物科技有限公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2動(dòng)物模型制備及分組

體重為180～200 g雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SYXK(粵)2010-0104。2型糖尿病大鼠模型制備采用我室已建立的高脂飼養(yǎng)加小劑量STZ誘導(dǎo)的方法[13]，大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組和糖尿病(DM)組，每組5只。Control組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)、自由進(jìn)食及飲水；DM組大鼠采用高脂飼料(基礎(chǔ)飼料79%、豬油10%、蛋黃10%、膽固醇1%和膽汁酸鹽0.1%)飼養(yǎng)4周，再給予一次性腹腔注射小劑量STZ(30 mg/kg，溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液)，STZ注射后連續(xù)3 天檢測(cè)尿糖為強(qiáng)陽(yáng)性者再行連續(xù)2次隔日檢測(cè)隨機(jī)血糖≥16 mmol/L 則認(rèn)為糖尿病大鼠模型成立，繼續(xù)高脂飼養(yǎng)8周，以制備病程為8周的糖尿病大鼠模型。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1口服糖耐量試驗(yàn) 在大鼠飼養(yǎng)結(jié)束前行口服糖耐量試驗(yàn)以評(píng)價(jià)胰島素敏感性，按我室已建立的方法[13]，將大鼠禁食12 h后經(jīng)尾靜脈采血，測(cè)定空腹血糖值(即BG0 min)，然后一次性灌胃給予40%葡萄糖溶液(2 g/kg)，并分別在灌胃后30、60、90和120 min測(cè)定血糖值；繪制血糖-時(shí)間曲線(xiàn)，根據(jù)梯形法計(jì)算曲線(xiàn)下面積(area under the curve，AUC)，計(jì)算公式為：AUC (mmol·L-1·min-1)=1/2×(BG0 min+BG30 min)×30 min+1/2×(BG30 min+BG60 min)×30 min+1/2×(BG60 min+BG90 min)×30 min+1/2×(BG90 min+BG120 min)×30 min。

3.2血清ADMA濃度測(cè)定 大鼠血清ADMA濃度按以前建立的方法[14]，用高效液相色譜測(cè)定。取0.1 mL血清，加入5-磺基水楊酸2 mg混勻后冰上靜置10 min，在4 ℃下離心15 min (2 000×g)以沉淀蛋白；取上清10 μL與100 μL衍生試劑鄰苯二醛混勻，室溫靜置3 min后進(jìn)行熒光檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為338 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為425 nm，通過(guò)比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積計(jì)算樣品中ADMA濃度。

3.3海綿體舒張功能測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠離體海綿體對(duì)ACh的舒張反應(yīng)以反映陰莖勃起功能。大鼠在麻醉(水合氯醛 300 mg/kg，ip)下，經(jīng)頸動(dòng)脈插管收集血標(biāo)本后迅速摘除陰莖，置于預(yù)冷的Krebs-Henseleit(K-H)液中，持續(xù)充以95% O2和5% CO2混合氣體；按照文獻(xiàn)介紹方法[15]，將陰莖海綿體一端固定于盛有5 mL K-H液的器官浴槽中，另一端連接張力換能器和生理信號(hào)記錄儀；保持浴槽內(nèi)K-H液37 ℃恒溫，并持續(xù)充以95% O2和5% CO2混合氣體，平衡后先用3 μmol/L 的PBS-EDTA(PE)溶液預(yù)收縮海綿體，待張力達(dá)坪值后分別依次加入累積濃度為10-7～10-3mol/L的 ACh舒張海綿體，記錄各濃度點(diǎn)海綿體張力，并計(jì)算海綿體在藥物處理前的舒張百分率。在正常大鼠的離體海綿體實(shí)驗(yàn)，記錄第一次海綿體對(duì)ACh的舒張反應(yīng)后，分別加入濃度為10、30和100 μmol/L的ADMA孵育15、30和 45 min，再觀(guān)測(cè)海綿體在ADMA處理后對(duì)ACh的舒張百分率；并用ADMA孵育前后兩次最大舒張百分率的比值以評(píng)價(jià)ADMA對(duì)離體海綿體舒張功能的影響。

3.4海綿體組織蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用Western blot檢測(cè)海綿體組織PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路蛋白表達(dá)。按已建立的方法[16]，取20 mg海綿組織，加入10倍體積的RIPA裂解液，剪碎，用勻漿機(jī)(BBY24M, Next Advance)間隙勻漿 2 min，4 ℃下離心10 min(15 000×g)，取上清用BCA法測(cè)定蛋白濃度；取30 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后依次加入Ⅰ抗和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，用凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTMXRS+Imaging System, Bio-Rad)采集圖像，用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像灰度掃描。

3.5海綿體組織生化指標(biāo)測(cè)定 采用NOS檢測(cè)試劑盒熒光探針DAF-FM DA法測(cè)定海綿體組織NOS活性，并檢測(cè)海綿體組織NO的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽含量以反映NO生成；用cGMP ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定大鼠海綿體組織cGMP含量以反映NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；用WST-8顯色法測(cè)定海綿體組織SOD活性;用硫代巴比妥酸法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，以反映氧化應(yīng)激；采用BCA法測(cè)定海綿體組織勻漿蛋白含量，用于標(biāo)化上述生化指標(biāo)[16]。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，兩組間比較采用雙向非配對(duì)Studentt檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1糖尿病大鼠口服糖耐量降低

糖尿病大鼠的空腹血糖較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，給予葡萄糖灌胃(2 g/kg)后糖尿病大鼠血糖水平迅速上升，各時(shí)點(diǎn)的血糖水平均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)；糖尿病大鼠的AUC明顯大于正常對(duì)照組(P<0.01)，提示糖尿病大鼠口服糖耐量降低,見(jiàn)圖1。

Figure 1. Increases in plasma glucose level and area under curve (AUC) in diabetic rats. A: the plasma glucose level; B: the AUC of plasma glucose. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖1糖尿病大鼠口服糖耐量降低

2糖尿病大鼠海綿體舒張功能障礙

如圖2所示，糖尿病大鼠離體海綿體對(duì)ACh(10-7～10-3mol/L)的舒張反應(yīng)明顯低于正常對(duì)照組，表現(xiàn)為最大舒張反應(yīng)(Emax)降低(P<0.01)，半數(shù)有效濃度(EC50)升高(331.60 μmol/Lvs87.42 μmol/L,P<0.01)，提示糖尿病大鼠海綿體舒張功能受到抑制,陰莖勃起功能出現(xiàn)障礙。

3糖尿病大鼠血清ADMA濃度、海綿體NOS活性、NO含量和cGMP含量的變化

與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠血清ADMA濃度顯著升高(P<0.01)，海綿體組織NOS活性明顯抑制(P<0.05)，NO和cGMP含量均明顯降低(P<0.01),見(jiàn)圖3。

Figure 2. Impairment of relaxation response to acetylcholine of corpus cavernosum in diabetic rats. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖2糖尿病大鼠海綿體對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)降低

Figure 3. Changes of serum ADMA level (A), and NOS activity (B), NO content (C) and cGMP content (D) in the corpus cavernosum of diabetic rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3糖尿病大鼠血清ADMA水平及海綿體NOS活性、NO含量和cGMP含量的變化

4糖尿病大鼠海綿體組織氧化應(yīng)激增加

糖尿病大鼠海綿體組織抗氧化酶SOD活性顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平則明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，提示糖尿病大鼠海綿體組織氧化應(yīng)激增加,見(jiàn)圖4。

Figure 4. Increase in oxidative stress in the corpus cavernosum of diabetic rats. Increased oxidative stress was reflected by the suppresion of superoxide dismutase (SOD) activity (A) and the elevation of malondialdehyde (MDA) content (B). Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4糖尿病大鼠海綿體組織氧化應(yīng)激增加

5血清ADMA濃度與海綿體舒張功能障礙關(guān)鍵指標(biāo)的相關(guān)性分析

將大鼠血清ADMA濃度分別與其海綿體對(duì)ACh的最大舒張反應(yīng)、海綿體組織NO和cGMP含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠血清ADMA濃度與其海綿體最大舒張反應(yīng)(r=-0.766，P<0.01)、NO含量(r=-0.810，P<0.01)和cGMP含量(r=-0.963，P<0.01)呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān),提示糖尿病大鼠ADMA蓄積與其海綿體舒張功能障礙密切相關(guān),見(jiàn)圖5。

Figure 5. Linear correlation analysis between serum ADMA level and the maximal relaxation response to acetylcholine (A), NO content (B) and cGMP content (C) in the corpus cavernosum of control and diabetic rats. The Pearson correlation coefficients were -0.766 (P<0.01), -0.810 (P<0.01) and -0.963 (P<0.01), respectively.

圖5血清ADMA濃度與海綿體最大舒張反應(yīng)、NO含量和cGMP含量的相關(guān)性分析

6糖尿病大鼠海綿體PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路蛋白表達(dá)變化

與正常對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠海綿體ADMA生成酶PRMT1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，ADMA主要代謝酶DDAH1和DDAH2蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)，ADMA作用靶酶eNOS和nNOS的表達(dá)也降低(P<0.05)，而cGMP降解酶PDE5的蛋白表達(dá)則顯著增加(P<0.01),提示糖尿病時(shí)海綿體PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路蛋白表達(dá)紊亂,見(jiàn)圖6。

7體外ADMA孵育對(duì)正常大鼠離體海綿體舒張功能的影響

為了觀(guān)察NOS抑制物ADMA對(duì)大鼠海綿體舒張功能的直接影響，在體外用不同濃度(10 μmol/L、30 μmol/L 和100 μmol/L)的ADMA孵育正常大鼠離體海綿體不同時(shí)間(15 min、30 min和 45 min)后，檢測(cè)了對(duì)海綿體舒張反應(yīng)影響的量效和時(shí)效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，用10～100 μmol/L的ADMA孵育正常大鼠離體海綿體30 min均可明顯抑制對(duì)ACh的舒張反應(yīng)(P<0.05)；用30 μmol/L的ADMA孵育正常大鼠離體海綿體15～45 min呈時(shí)間依賴(lài)性抑制對(duì)ACh的舒張反應(yīng)(P<0.05 at 30 min,P<0.01 at 45 min),提示ADMA對(duì)大鼠海綿體舒張功能具有直接的抑制作用，見(jiàn)圖7。

Figure 6. The protein expression of PRMT1/DDAH/NOS/PDE5 pathway-related molecules in the corpus cavernosum of diabetic rats detected by Western blot. Mean±SD.n=3～4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6糖尿病大鼠海綿體PRMT1/DDAH/NOS/PDE5通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

Figure 7. Dose-dependent (A) and time-dependent (B) effects of NOS inhibitor ADMA on relaxation function of isolated corpus ca-vernosum from normal rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖7體外ADMA孵育對(duì)正常大鼠離體海綿體舒張功能的時(shí)效和量效影響

8體外ADMA孵育對(duì)正常大鼠離體海綿體NO及cGMP含量的影響

在體外用30 μmol/L ADMA孵育正常大鼠離體海綿體30 min，不僅明顯抑制對(duì)ACh的舒張反應(yīng)(P<0.05)，也顯著降低海綿體組織NO和cGMP含量(P<0.01),提示ADMA對(duì)海綿體組織NO產(chǎn)生和cGMP形成具有直接的抑制作用,見(jiàn)圖8。

討 論

本研究首次發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠海綿體對(duì)ACh誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)顯著降低，并伴隨血清內(nèi)源性NOS抑制物ADMA濃度明顯升高以及海綿體組織PRMT1/ADMA/DDAH/NOS/NO/cGMP/PDE5信號(hào)通路紊亂，相關(guān)分析揭示糖尿病大鼠海綿體舒張功能障礙與ADMA 蓄積及其信號(hào)通路紊亂密切相關(guān)。這些結(jié)果表明，糖尿病大鼠內(nèi)源性ADMA蓄積是導(dǎo)致糖尿病ED的重要因素。意大利學(xué)者Paroni 等[9]研究報(bào)道，在排除了吸煙、糖尿病、高血壓、冠心病、充血性心衰、腎衰、惡性腫瘤和全身性炎癥疾病以外，年齡為36～53歲的男性動(dòng)脈性ED患者，其血漿ADMA濃度明顯升高，并與陰莖勃起功能呈負(fù)相關(guān)；希臘學(xué)者Ioakeimidis等[10]研究報(bào)道，在排除了急性感染、腎衰等疾病以及在兩月內(nèi)使用過(guò)抗菌、抗炎藥物治療的病人以外，年齡為(56±9)歲的吸煙、高脂和高血壓的ED患者，其血清ADMA濃度也顯著升高，并與刺激后陰莖勃起功能呈負(fù)相關(guān)；這些研究結(jié)果都支持我們認(rèn)為內(nèi)源性ADMA升高是導(dǎo)致糖尿病ED重要因素的觀(guān)點(diǎn)。其他學(xué)者在伴有ED的老齡大鼠模型[11]和皮下注射香煙煙霧抽提物致ED的日本白兔模型[12]也測(cè)得海綿體組織ADAM含量增加而cGMP含量降低；以及在糖尿病ED大鼠模型測(cè)得海綿體組織的cGMP含量也顯著低于正常對(duì)照組[17]。這些結(jié)果都不同程度地支持我們的觀(guān)點(diǎn)。

Figure 8. The effects of NOS inhibitor ADMA on NO (A) and cGMP (B) contents in isolated corpus cavernosum from normal rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖8體外ADMA孵育對(duì)正常大鼠海綿體NO和cGMP含量的影響

內(nèi)源性ADMA蓄積不僅可競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS，減少NO合成；還可使NOS解偶聯(lián)，增加超氧陰離子生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[7]。因此，本研究檢測(cè)海綿體組織SOD的活性以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量以反映氧化應(yīng)激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠海綿體組織MDA含量明顯高于正常對(duì)照組，而SOD活性則顯著低于正常對(duì)照組，提示糖尿病大鼠海綿體組織氧化應(yīng)激增加；該結(jié)果與我室以前在2型糖尿病大鼠肝臟組織檢測(cè)到的結(jié)果以及其他學(xué)者在老齡大鼠海綿體組織檢測(cè)到的結(jié)果一致[11,13]。氧化應(yīng)激或超氧陰離子生成增加可加快NO滅活，使ED加重。最近有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過(guò)增加海綿體組織SOD活性、降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量，從而改善糖尿病大鼠ED[18]。

為了確定糖尿病大鼠海綿體組織中是否存在ADMA蓄積，本研究檢測(cè)了海綿體組織ADMA的主要生成酶PRMT1以及ADMA主要代謝酶DDAH1和DDAH2的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠海綿體組織PRMT1表達(dá)顯著上調(diào)，DDAH1和DDAH2表達(dá)明顯下調(diào)。這些結(jié)果提示糖尿病大鼠海綿體組織中也存在內(nèi)源性ADMA蓄積。相似的研究結(jié)果最近也被發(fā)現(xiàn)在伴有ED的老齡大鼠模型海綿體組織[11]。為了進(jìn)一步查明糖尿病大鼠海綿體組織NO和cGMP含量降低的原因，本研究還檢測(cè)了ADMA作用的靶酶eNOS和nNOS以及促進(jìn)cGMP降解的PDE5蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠比較，糖尿病大鼠海綿體eNOS和nNOS表達(dá)下調(diào)，而PDE5表達(dá)明顯上調(diào)；該結(jié)果與Bai等[17]在糖尿病大鼠海綿體組織的研究結(jié)果一致。這些結(jié)果提示，糖尿病大鼠海綿體NO含量降低不僅由于ADMA升高，直接抑制NOS活性，還可能是由于eNOS和nNOS的表達(dá)降低所致；糖尿病大鼠海綿體cGMP含量減少不僅是由于NO合成釋放減少，使cGMP形成減少，也可能是由于PDE5的表達(dá)增加，使cGMP降解加快所致。

為了確定糖尿病時(shí)蓄積的內(nèi)源性ADMA與勃起功能障礙的因果關(guān)系，本研究在正常大鼠的離體海綿體觀(guān)測(cè)了ADMA對(duì)海綿體舒張功能的直接影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用10、30、100 μmol/L 的ADMA孵育正常大鼠離體海綿體30 min均可明顯抑制海綿體對(duì)ACh的舒張反應(yīng)，并呈時(shí)間依賴(lài)性；此外，還明顯降低海綿體組織NO含量及其效應(yīng)分子cGMP的生成。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，糖尿病時(shí)蓄積的ADMA是導(dǎo)致陰莖勃起功能障礙的重要因子，它通過(guò)抑制NO合成、降低cGMP生成所致。

總之，本研究在病程為8周的糖尿病大鼠揭示，海綿體的最大舒張功能與血清ADMA濃度呈高度負(fù)相關(guān)，并伴有海綿體組織PRMT1/DDAH/NOS/NO/cGMP/PDE5信號(hào)通路紊亂，提示糖尿病時(shí)內(nèi)源性NOS抑制物ADAM蓄積是導(dǎo)致陰莖勃起功能障礙的重要因子，其機(jī)制與增強(qiáng)氧化應(yīng)激、抑制NOS活性與表達(dá)、減少NO合成與cGMP生成有關(guān)。這些結(jié)果為闡明糖尿病ED發(fā)生機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其臨床防治及藥物研發(fā)提供新的啟示。

[1] Xu Y, Wang L, He J, et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J]. JAMA, 2013, 310(9):948-959.

[2] Lo WH, Fu SN, Wong CK, et al. Prevalence, correlates, attitude and treatment seeking of erectile dysfunction among type 2 diabetic Chinese men attending primary care outpatient clinics[J]. Asian J Androl, 2014, 16(5):755-760.

[3] Dashwood MR, Crump A, Xu XW, et al. Identification of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in human penis: a potential role of reduced neuronally-derived nitric oxide in erectile dysfunction[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12(9):1316-1321.

[4] Bivalacqua TJ, Champion HC, Usta MF, et al. RhoA/Rho-kinase suppresses endothelial nitric oxide synthase in the penis: a mechanism for diabetes-associated erectile dysfunction[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(24):9121-9126.

[5] González-Corrochano R, La Fuente J, Cuevas P, et al. Ca2+-activated K+channel (KCa) stimulation improves relaxant capacity of PDE5 inhibitors in human penile arteries and recovers the reduced efficacy of PDE5 inhibition in diabetic erectile dysfunction[J]. Br J Pharmacol, 2013, 169(2):449-461.

[6] Vallance P, Leone A, Calver A, et al. Endogenous dimethylarginine as an inhibitor of nitric oxide synthesis[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 1992, 20(Suppl 12):S60-S62.

[7] Winnica D, Que LG, Baffi C, et al. L-citrulline prevents asymmetric dimethylarginine-mediated reductions in nitric oxide and nitrosative stress in primary human airway epithelial cells[J]. Clin Exp Allergy, 2016, 47(2):190-199.

[8] Onozato ML, Tojo A, Leiper J, et al. Expression ofNG,NG-dimethylarginine dimethylaminohydrolase and protein arginineN-methyltransferase isoforms in diabetic rat kidney: effects of angiotensin II receptor blockers[J]. Diabetes, 2008, 57(1):172-180.

[9] Paroni R, Barassi A, Ciociola F, et al. Asymmetric dimethylarginine (ADMA), symmetric dimethylarginine (SDMA) and L-arginine in patients with arteriogenic and non-arteriogenic erectile dysfunction[J]. Int J Androl, 2012, 35(5):660-667.

[10] Ioakeimidis N, Vlachopoulos C, Rokkas K, et al. Relationship of asymmetric dimethylarginine with penile Doppler ultrasound parameters in men with vasculogenic erectile dysfunction[J]. Eur Urol, 2011, 59(6):948-955.

[11] Chen D, Zhang KQ, Li B, et al. Epigallocatechin-3-gallate ameliorates erectile function in aged rats via regulation of PRMT1/DDAH/ADMA/NOS metabolism pathway[J]. Asian J Androl, 2017, 19(3): 291-297.

[12] Imamura M, Waseda Y, Marinova GV, et al. Alterations of NOS, arginase, and DDAH protein expression in rabbit cavernous tissue after administration of cigarette smoke extract[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007, 293(5):R2081-R2089.

[13] Leng YP, Qiu N, Fang WJ, et al. Involvement of increased endogenous asymmetric dimethylarginine in the hepatic endoplasmic reticulum stress of type 2 diabetic rats[J]. PLoS One, 2014, 9(2):e97125.

[14] 邱 霓，方偉進(jìn)，李 聰，等. 內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物上調(diào)4周運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌收縮功能和線(xiàn)粒體生物合成[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(7):1259-1265.

[15] Lizarte FS, Morgueti M, Tirapelli CR, et al. Chronic alcoholism associated with diabetes impairs erectile function in rats[J]. BJU Int, 2010, 105(11):1592-1597.

[16] 邱 霓，李 聰，方偉進(jìn)，等. 限食8周對(duì)大鼠不同類(lèi)型骨骼肌收縮功能及線(xiàn)粒體生物合成的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(2):193-200.

[17] Bai Y, An R. Resveratrol and sildenafil synergistically improve diabetes-associated erectile dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Life Sci, 2015, 135:43-48.

[18] Yu W, Wan Z, Qiu XF, et al. Resveratrol, an activator of SIRT1, restores erectile function in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Asian J Androl, 2013, 15(5): 646-651.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of endogenous nitric oxide synthase inhibitor in erectile dysfunction of diabetic rats

HUANG Cheng, LEI Yan-ping, LI Xiao-mei, LIN Yuan, XIAO Qin, XIONG Yan

(Guangzhou Institute of Snake Venom Research, School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, China. E-mail: xiongyan2001@yahoo.com)

AIM: To investigate the role of nitric oxide synthase (NOS) inhibitor asymmetric dimethylarginine (ADMA) in erectile dysfunction of diabetic rats.METHODS: Type 2 diabetic rat model was established by 4 weeks of high-fat diet plus a single intraperitoneal injection of streptozotocin and continued high-fat diet feeding for 8 weeks. Corpus cavernosum was isolated from the rats under anesthetization， and the endothelium-dependent relaxation response to acetylcholine (ACh) was tested in an organ chamber to reflect erectile function. The level of ADMA in serum was detected. The NOS activity, nitric oxide (NO) content and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) content in corpus cavernosum were measured. The protein expression of ADMA-NOS-NO pathway-related molecules and phosphodiesteras 5 (PDE5) in the corpus cavernosum was detected by Western blot. Superoxide dismutase activity and malondialdehyde content were analyzed to evaluate oxidative stress.RESULTS: Elevated blood glucose and lowered insulin sensitivity were observed in the diabe-tic rats, indicating that type 2 diabetic rat model was successfully established. Compared with control group, the relaxation response to ACh of corpus cavernosum from diabetic rats was significantly decreased, which was accompanied with the elevation of serum ADMA level and reduction of NOS activity, NO content and cGMP content in the corpus cavernosum. The protein expression of ADMA-generating enzyme protein arginine methyltransferase 1 was up-regulated, while ADMA-metabolic enzymes dimethylarginine dimethylaminohydrolases 1 and 2, and ADMA-targeting enzymes endothelial NOS and neuronal NOS were down-regulated. The protein expression of PDE5 was up-regulated, accompanied with an increase in oxidative stress in the corpus cavernosum of diabetic rats. Incubation of isolated corpus cavernosum from normal rats with NOS inhibitor ADMA induced the similar relaxation dysfunction of corpus cavernosum response to ACh and decreased NO and cGMP contents in diabetic rats.CONCLUSION: Elevated endogenous NOS inhibitor ADMA plays an important role in erectile dysfunction of diabetic rats. The underlying mechanism may be related to the reduction of NO production and the increase in oxidative stress.

Diabetes mellitus; Asymmetric dimethylarginine; Erectile dysfunction; Corpus cavernosum; Nitric oxide

1000- 4718(2017)09- 1654- 08

2016- 11- 16 [

] 2017- 07- 17

廣東省科技計(jì)劃(No.2013B021800098)；廣州市科技計(jì)劃(No.2014J4100067)

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.020

△通訊作者 Tel: 020-37103273; E-mail: xiongyan2001@yahoo.com

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