吳慶俠，董海龍，朱洪云，劉忠艷(西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000)

大腸埃希菌O111黏附牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞致炎模型的建立

吳慶俠，董海龍，朱洪云，劉忠艷
(西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000)

為建立大腸埃希菌O111黏附牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的致炎模型，體外分離、培養(yǎng)牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后，加入大腸埃希菌O111，通過計(jì)算細(xì)胞上細(xì)菌的黏附數(shù)量研究細(xì)菌數(shù)量和孵育時(shí)間對黏附效果的影響，得到最佳黏附條件，通過ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的質(zhì)量濃度變化來鑒定模型。結(jié)果表明，大腸埃希菌為1×105CFU/mL、孵育時(shí)間為120 min是黏附的最佳條件。ELISA 法檢測結(jié)果表明，與對照組相比，60、90、120 min組TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度顯著升高，致炎效果明顯，表明致炎模型建立成功。

大腸埃希菌O111；牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；致炎模型

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后的常發(fā)病，大腸桿菌是其致病的一種重要的條件性致病菌，發(fā)病率在15%左右[1]，嚴(yán)重危害奶牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。大腸埃希菌O111是具有高致病力的菌株，王孝武等[2]研究表明，從患病奶牛子宮內(nèi)膜10 份樣本中分離出12 株細(xì)菌，其中7 株為大腸桿菌；杭蘇琴等[3]研究表明，從患有子宮內(nèi)膜炎的奶牛子宮黏液中分離大腸桿菌，血清學(xué)分型結(jié)果表現(xiàn)為O111型占41.84%，占有比例最高。

對于奶牛子宮內(nèi)膜炎的研究，國內(nèi)外普遍采用體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，建立相應(yīng)炎癥模型的方式[4]。目前，牦牛作為藏區(qū)牧民的主要生活資料，同樣面臨產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的困擾，臨床觀察統(tǒng)計(jì)，西藏林芝地區(qū)牦牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率已達(dá)到18%，尤其是胎衣不下所引起的子宮內(nèi)膜炎尤為多見。羊云飛[5]通過16S rRNA對藏區(qū)牦牛源大腸桿菌進(jìn)行分離、血清學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)O111所占比例較高，達(dá)到13.6%。然而體外建立O111菌株感染牦牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的致炎模型未見報(bào)道。

本研究通過體外分離、培養(yǎng)的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞為模型，分別評價(jià)大腸埃希菌O111的數(shù)量，以及子宮內(nèi)膜細(xì)胞孵育時(shí)間對該菌黏附性的影響，最后通過雙抗體夾心ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的質(zhì)量濃度變化，從而成功構(gòu)建模型，為進(jìn)一步研究其致病及抗病機(jī)制提供條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 牦牛子宮和菌種來源 牦牛子宮取自西藏林芝市巴宜區(qū)牦牛屠宰廠。大腸埃希O111(Escherichiacoli,ATCC43887)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王九峰教授惠贈。

1.1.2 菌種與試劑 D-MEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、膠原酶Ⅱ購自Gibco公司；TNF-α、IL-6、IL-1β檢測試劑盒均購自博士德生物；雙抗(青霉素和鏈霉素)為哈藥集團(tuán)生產(chǎn)；營養(yǎng)肉湯、PBS緩沖液均為自配。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備 6 孔和96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司)、酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)、倒置生物顯微鏡(Nikon公司)、離心機(jī)(Sigma公司)、雙人超凈工作臺(蘇凈凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 大腸埃希菌O111懸液制備 將大腸埃希菌O111于營養(yǎng)肉湯內(nèi)培養(yǎng)，37 ℃振蕩12 h后取出，3 000 r/min離心10 min，去上清液，使用無菌PBS緩沖液懸浮菌種，再次3 000 r/min離心10 min，去上清液，使用D-MEM/F12培養(yǎng)液將菌種重懸，并將其調(diào)至1×107CFU/mL，備用。

1.2.2 牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 參照吳慶俠等[6]的方法進(jìn)行，具體操作如下：將采取的牦牛子宮于含有雙抗的無菌PBS溶液中反復(fù)沖洗后剪開子宮角，剪取子宮內(nèi)膜層，把剪取好的子宮內(nèi)膜層用無菌PBS溶液反復(fù)沖洗，直至溶液清亮。將其放入空的血清瓶中，剪成肉糜狀以便消化，用無菌PBS溶液沖洗數(shù)次后使用2 g/L的膠原酶Ⅱ消化4 h，消化過程中注意每隔30 min搖動消化瓶1次，消化結(jié)束后，74 μm濾網(wǎng)過濾消化液，400 r/min離心5 min，收集沉淀(主要為上皮細(xì)胞)，無菌PBS溶液重懸后自然沉降，下方的沉降物即為純度較高的上皮細(xì)胞。去上清液，使用含φ= 5%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，移入到預(yù)先放置有無菌蓋玻片(22 mm×22 mm)的6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)5 d后，觀察細(xì)胞形態(tài)，爬滿蓋玻片時(shí)進(jìn)行黏附試驗(yàn)。

1.2.3 大腸埃希菌O111對牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的黏附 大腸埃希菌不同數(shù)量分組黏附：使用D-MEM/F12培養(yǎng)液，將“1.2.1”中備用的菌液調(diào)整細(xì)菌數(shù)量為1×107、1×106、1×105、1×104和1×103CFU/mL，D-MEM/F12培養(yǎng)液作為空白對照，依次加入到“1.2.2”中培養(yǎng)好的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行黏附試驗(yàn)。CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育結(jié)束后，取出蓋玻片，使用無菌PBS緩沖液沖洗5 次，去除雜質(zhì)和未黏附細(xì)菌等。自然晾干或低溫烘干，甲醇固定20 min，革蘭氏染色觀察大腸埃希菌O111對牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的黏附性。每組在顯微鏡下隨機(jī)挑選10 個視野，統(tǒng)計(jì)每個視野下每個細(xì)胞黏附細(xì)菌的數(shù)量。

孵育不同時(shí)間分組黏附：將“1.2.1”中備用的細(xì)菌數(shù)量為1×107CFU/mL的菌液，加入到“1.2.2”中培養(yǎng)好的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行黏附試驗(yàn)。孵育時(shí)間在30、60、90、120和150 min時(shí)分別取樣，同“大腸埃希菌不同數(shù)量分組黏附”試驗(yàn)中計(jì)算方法，計(jì)算細(xì)胞上細(xì)菌的黏附數(shù)量。1.2.4 黏附過程中TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度檢測 選取已培養(yǎng)好上皮細(xì)胞的6孔板2個，取其中10 孔取上清液，每孔取3 次，每次取0.1 mL，保證每個檢測因子有10 個待檢樣，將上清液移入到96 孔板中，作為對照組待測。將數(shù)量為1×107CFU/mL的菌液加入2 個培養(yǎng)好的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞6 孔板中進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間在60、90、120 min時(shí)選取其中10 孔采取上清液，每孔取3 次，每次0.1 mL，同樣保證每個檢測因子有10 個待檢樣，將上清液移入到96 孔板中待測，采用雙抗體夾心ELISA法測定上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度，檢測嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用 SigmaPlot 12.5軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

分離的上皮細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)18 h后開始貼壁，以細(xì)胞團(tuán)為中心向四周輻射生長(圖1)。5 d后，上皮細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部呈鋪路石樣排列生長(圖2)。上皮細(xì)胞純度較高，看不到明顯雜質(zhì)或其他細(xì)胞。

圖1 培養(yǎng)18 h后上皮細(xì)胞生長形態(tài)(100×)Fig.1 Growth morphology of epithelialcells after 18 h culture(100×)

2.2 不同細(xì)菌數(shù)量對黏附效果的影響

在染色前，通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著添加大腸埃希菌O111數(shù)量的增加，部分細(xì)胞變圓脫壁，脫壁細(xì)胞的數(shù)量隨著細(xì)菌數(shù)量的增加而增加；仍然貼壁的細(xì)胞形態(tài)上沒有明顯變化。大腸埃希菌對牦牛子宮內(nèi)膜上皮的黏附性，隨著細(xì)菌數(shù)量的增加，每個細(xì)胞上平均黏附的細(xì)菌數(shù)呈逐步增加(圖3和圖4)，大腸埃希菌數(shù)量為1×103、1×104、1×105CFU/mL時(shí)黏附細(xì)菌的數(shù)量差異顯著(P<0.05)，而大腸埃希菌數(shù)量為1×105、1×106、1×107CFU/mL時(shí)黏附細(xì)菌數(shù)量的組間差異不顯著(P>0.05)。提示細(xì)菌數(shù)量為1×105CFU/mL時(shí)，黏附細(xì)菌數(shù)開始穩(wěn)定，單個牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的黏附細(xì)菌數(shù)量已經(jīng)達(dá)到最大，使大腸埃希菌O111黏附量趨于飽和，因此最佳黏附效果的細(xì)菌數(shù)量為1×105CFU/mL。

2.3 不同孵育時(shí)間對黏附效果的影響

如圖5所示，隨著時(shí)間的增加，黏附細(xì)菌數(shù)量逐步增加，孵育時(shí)間為30、60、90和120 min時(shí)黏附細(xì)菌的數(shù)量差異顯著(P<0.05)，孵育120 min與150 min相比較，無顯著差異(P>0.05)，提示在孵育120 min時(shí)，黏附細(xì)菌數(shù)量趨于穩(wěn)定，黏附細(xì)菌量達(dá)到最大，因此最佳黏附的孵育時(shí)間為120 min。

圖2 培養(yǎng)5 d后上皮細(xì)胞生長形態(tài)(200×)Fig.2 Growth morphology of epithelialcells after 5 d culture(200×)

A～C.大腸埃希菌O111的數(shù)量依次為103、104、105CFU/mL Concentration ofEscherichiacoliO111is 103CFU/mL,104CFU/mL,105CFU/mL

圖3不同數(shù)量大腸埃希菌O111在牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的黏附(革蘭氏染色，1000×)
Fig.3AdhesionofEscherichiacoliO111onendometrialepitheliumcellsofyakatdifferentconcentrations(Gram’sstaining,1000×)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters are significantly differente at level ofP<0.05,the same below.

圖4不同數(shù)量的大腸埃希菌O111對牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞黏附效果
Fig.4EffectsofdifferentnumbersofEscherichiacoliO111onadhesiontoendometrialepitheliumcells

圖5 不同孵育時(shí)間的黏附效果Fig.5 Effects of different incubation time on adhesion

2.4ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度變化

由表1可知，90 和120 min組比較，上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度均差異不顯著(P>0.05)，而60、90、120 min組與對照組均差異顯著(P<0.05)，提示在大腸埃希菌的作用下，炎性反應(yīng)變化明顯。

表1 不同時(shí)間內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度Table 1 Mass concentration changes of TNF-, IL-6 and IL-1 in different time

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in the same column are significantly different at level ofP<0.05.

3 討 論

在生殖系統(tǒng)中，子宮占據(jù)著重要地位，其內(nèi)膜上皮直接接觸微生物，起到免疫作用，有研究表明，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞一樣，具有分泌和免疫應(yīng)答的功能[7]，能夠釋放炎癥介質(zhì)。近年來人們對牛子宮相關(guān)炎性疾病的研究都涉及到體外細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，本試驗(yàn)中，牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)參照吳慶俠等[6]的培養(yǎng)方法，得到純度較高的上皮細(xì)胞，并使用原代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

大腸埃希菌是子宮內(nèi)膜炎的重要致病菌，目前體外子宮內(nèi)膜致炎模型的建立，多是使用大腸桿菌脂多糖(LPS)進(jìn)行誘導(dǎo)，模型中LPS的致炎效果均很明顯，已成功建立的模型有人[8]、小鼠[9]、奶牛[10]、山羊[11]等，這些模型的建立有的是為揭示致炎癥發(fā)生過程中子宮內(nèi)膜細(xì)胞相關(guān)炎性因子的一系列表達(dá)變化[12]，有的是用于檢驗(yàn)藥物或者中藥提取物對子宮內(nèi)膜炎的抑制效果等。而直接使用細(xì)菌對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行黏附的試驗(yàn)很少，本試驗(yàn)直接使用大腸埃希菌對體外培養(yǎng)的牦牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行黏附建立致炎模型，主要是天然模擬大腸埃希菌感染細(xì)胞的過程，從而探討其定植機(jī)制。余抒等[13]研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌黏附HeLa細(xì)胞的最佳條件是加入細(xì)菌量為1×105CFU/mL，孵育時(shí)間為4 h，本試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳的加入細(xì)菌量也為1×105CFU/mL，與其結(jié)果一致，但孵育2 h即達(dá)到最佳效果，最佳孵育時(shí)間有所不同，分析可能是由于黏附的細(xì)胞對象不同所造成的，本試驗(yàn)所用細(xì)胞為原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，而余抒等[13]試驗(yàn)使用的是瘤細(xì)胞，瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面所表達(dá)的一系列因子水平與常規(guī)細(xì)胞相比有很大差異。

Fischer等[14]研究奶牛在產(chǎn)后一定時(shí)間內(nèi)，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中相關(guān)炎性因子基因表達(dá)變化與臨床型和隱性型子宮內(nèi)膜炎的關(guān)系，認(rèn)為炎性趨化因子(CXCL5)、IL-1β、IL-6和TNF的基因可作為隱性子宮內(nèi)膜炎診斷和治療監(jiān)測的標(biāo)志基因。Ghasemi等[15]對患有亞臨床型子宮內(nèi)膜炎的奶牛血液中TNF-α、IL-6等進(jìn)行檢測，結(jié)果其表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康奶牛，趙立香等[16]的試驗(yàn)表明，通過直接對奶牛子宮內(nèi)灌注大腸桿菌菌液導(dǎo)致TNF-α、IL-6、IL-1β等表達(dá)增多，于曉紅等[17]試驗(yàn)表明在LPS的作用下奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)量均有不同程度的增加。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，在大腸埃希菌的作用下，上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度與對照組相比均顯著升高(P<0.05)，與相關(guān)報(bào)道[16-17]一致。

本試驗(yàn)確定大腸埃希菌O111對體外培養(yǎng)的牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞黏附最佳條件，即細(xì)菌數(shù)量為1×105CFU/mL，孵育時(shí)間為120 min，同時(shí)使用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的質(zhì)量濃度變化，表明在大腸埃希菌的作用下，炎性反應(yīng)明顯，從而成功建立體外細(xì)菌黏附子宮內(nèi)膜致炎模型。該模型將進(jìn)一步用于大腸桿菌致牦牛子宮內(nèi)膜炎癥機(jī)理及益生菌防治牦牛子宮內(nèi)膜炎的研究。

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EstablishmentofInflammationModelsforEscherichiacoliO111AdheredtoYakEndometrialEpithelialCells

WU Qingxia,DONG Hailong,ZHONG Hunyun and LIU Zhongyan
(Xizang Agricultural and Animal Husbandry College，Linzhi Tibet 860000，China)

The yak endometrial epithelial cells were isolated and cultured in vitro to establish inflammation models caused byE.coliO111adhesion yak endometrial epithelial cells. After 5 days’ culture,EscherichiacoliO111was added in, the optimum condition was obtained by calculation of bacteria number to study the cell adhesion effect under different conditions of bacterial number and incubation time. The optimization model was identified by DAS-ELISA method to determine the content change of tumor necrosis alpha (TNF-α), leukocyte mediated IL-6 and IL-1 factors in cell culture supernatant. The results showed that the number ofE.coliwas 1×105CFU/mL, and the incubation time was 120 min, which was the best condition for adhesion. ELISA test results proved that the TNF-α, IL-6, IL-1β mass concentration increased significantly and had obvious inflammation effect in 60 min, 90 min and 120 min test groups than control group. The model of inflammation was established successfully after series of test.

EscherichiacoliO111; Yak endometrial epithelial cells; Inflammatory model

2016-07-05

2016-08-02

Tibet Natural Science Foundation(No.2015212-14-34);Funded by Key Lab Construction Program of Clinical Veterinary Medicine for Medical Universities and Colleges in Tibet.

WU Qingxia, female, associate professor. Research area:animal clinical disease.E-mail：goodwqx@163.com

S857.23

A

1004-1389(2017)09-1289-06

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

日期：2017-09-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.008.html

2016-07-05

2016-08-02

西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金(2015212-14-34)；西藏自治區(qū)臨床獸醫(yī)學(xué)高校重點(diǎn)試驗(yàn)室建設(shè)資助項(xiàng)目。

吳慶俠，女，副教授，從事動物臨床疾病研究。E-mail：goodwqx@163.com

董海龍，男，副教授，主要從事產(chǎn)科疾病相關(guān)研究。E-mail: 984718586@qq.com

CorrespondingauthorDONG Hailong, male, associate professor. Research area:animal obstetric diseases. E-mail：984718586@qq.com