劉苗苗，程家慧，林海燕，沈志成，王志勇，林朝陽

(1.浙江大學植物保護系，昆蟲科學研究所，浙江 杭州 310058； 2.海南大學農(nóng)學院，海南 ?？?570228)

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米AG16分子特征和抗性鑒定

劉苗苗1，程家慧1，林海燕1，沈志成1，王志勇2，林朝陽1

(1.浙江大學植物保護系，昆蟲科學研究所，浙江 杭州 310058； 2.海南大學農(nóng)學院，海南 ?？?570228)

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米(Zeamays)能有效降低雜草防治成本，具有重要的應用前景。浙江大學轉(zhuǎn)基因抗蟲植物和生物安全實驗室前期通過農(nóng)桿菌介導法，以玉米Hi-Ⅱ品種為受體導入新型抗草甘膦基因G10evo，獲得不同的抗草甘膦玉米轉(zhuǎn)化系。在此基礎上，篩選了具有良好草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化系AG16。本研究利用PCR、Western雜交、Southern 雜交、ELISA等方法對AG16進行分子特征檢測，并對AG16的草甘膦抗性水平進行鑒定。結果表明，G10evo在AG16中為單拷貝插入；G10evo蛋白在AG16的根、莖和葉組織中表達；ELISA分析表明，草甘膦噴灑前，嫩莖中G10evo蛋白的表達量達到9.975 μg·g-1。溫室中草甘膦抗性測定結果顯示，AG16能抗4～8倍田間濃度的草甘膦，遠高于草甘膦在實際生產(chǎn)中的使用量。因此，AG16草甘膦抗性水平達到生產(chǎn)需求，具有產(chǎn)業(yè)應用潛力，為培育具有自主知識產(chǎn)權的抗草甘膦玉米提供了種質(zhì)資源。

G10evo基因；PCR檢測；Southern 雜交；Western雜交；蛋白定量；抗性鑒定；雜草防治

玉米(Zeamays)是全球主要的糧食作物之一，也是世界上產(chǎn)量最高的糧食作物之一[1]，同時，玉米生產(chǎn)過程中投入少，產(chǎn)出高，光合產(chǎn)物總量有50%～60%貯存于秸稈當中，是理想的飼料和工業(yè)原料[2-3]。自1990年第1株轉(zhuǎn)基因玉米問世以來，轉(zhuǎn)基因技術在玉米育種中發(fā)揮了巨大作用，定向改良抗病蟲、抗逆性、抗除草劑、雄性不育等性狀，在玉米遺傳改良方面展示出了良好的應用前景[4]。目前，玉米是世界上第二大規(guī)模的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物，2016年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達到1.85億hm2，轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積達到0.606億hm2，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的33%[5]，其中轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米發(fā)展最迅速，種植面積最廣泛，2014年抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的經(jīng)濟效益累計90.5億美元，為全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟效益[6-7]。

草甘膦是農(nóng)業(yè)上使用量最多的除草劑[8]，其有效化學成分為N-磷酸甲基甘氨酸[N-(phosphonomethyl)-glycine，H2O3P-CH2-NH-CH2-CO2H]。1974年首次在美國批準使用，商品名為Roundup，目前已在超過100種農(nóng)作物和近130個國家用于雜草防治[7]，草甘膦在植物中的毒性作用是通過抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶(EPSPS)實現(xiàn)的，該途徑僅在植物、細菌、真菌和一些寄生蟲中發(fā)現(xiàn)，對多種雜草具有高度活性，但對哺乳動物幾乎沒有影響，是一種環(huán)境友好型除草劑，具有低成本、易降解的特性[9]。因此，草甘膦仍然是應用40多年后使用最廣泛的除草劑。草甘膦是高效的滅生性除草劑，不能用于常規(guī)植物的選擇性除草，只能用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物的田間除草，具有時間和空間的限制。因為草甘膦的高除草效率和低成本優(yōu)勢，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米和大豆已經(jīng)推廣二十多年?？共莞熟⑿誀畛嗽谵r(nóng)作物上具有重要價值，在草坪草上的價值也越來越得到重視。草坪雜草防治是草坪養(yǎng)護的主要任務，常規(guī)草坪草一般使用選擇性除草劑進行除草，但是選擇性除草劑往往難以殺滅與栽培品種近緣的雜草，發(fā)展抗草甘膦轉(zhuǎn)基因草坪草，可以提高草坪雜草防治效率，降低草坪維護成本。近些年，已經(jīng)有國外生物技術企業(yè)研發(fā)和發(fā)展了抗草甘膦草坪草，如美國研發(fā)的抗草甘膦早熟禾(Poapratensis)已經(jīng)具備推廣應用條件[10]。

雖然從微生物和雜草中克隆出許多抗草甘膦EPSPS基因，但截至現(xiàn)在只有CP4EPSPS，玉米EPSPS突變體和GRG23突變體應用于商業(yè)化推廣的轉(zhuǎn)基因作物中，并被國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織(ISAAA)數(shù)據(jù)庫批準[11-18]。世界上商業(yè)化推廣最多的抗草甘膦基因主要是CP4EPSPS基因，該基因在多種作物上得到廣泛的應用。含兩個抗草甘膦CP4EPSPS基因表達框的NK603轉(zhuǎn)基因玉米在2016年已經(jīng)獲得26個國家及歐盟 28 國的54個批文[5]。G10evo是浙江大學轉(zhuǎn)基因抗蟲植物和生物安全實驗室自主克隆和改良后的抗草甘膦基因，具有對草甘膦的高度抗性，可同時作為抗草甘膦性狀和轉(zhuǎn)基因篩選標記應用于轉(zhuǎn)基因作物、牧草及草坪草等的研發(fā)中，是極有潛力投入應用的抗草甘膦基因。中國是玉米需求大國，2015年進口玉米達330萬t[19]。目前我國轉(zhuǎn)基因玉米尚未獲得商業(yè)化生產(chǎn)種植，發(fā)展轉(zhuǎn)基因玉米有利于提高我國玉米自主生產(chǎn)能力，尤其是發(fā)展具有我國自主知識產(chǎn)權的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米，對雜草防治，節(jié)約勞動成本，提高農(nóng)民收益具有重要意義。

本研究中的抗草甘膦EPSPS基因G10evo是浙江大學轉(zhuǎn)基因抗蟲植物和生物安全實驗室具有自主知識產(chǎn)權，來源于細菌DeinococcusradioduransR1，它與目前劃分出的EPSPS家族Ⅰ、Ⅱ類抗草甘膦基因親緣性很低，保守序列相差很大，既不屬于Class Ⅰ也不屬于Class Ⅱ[20-21]。該基因作為大豆轉(zhuǎn)化體系中的篩選基因和培養(yǎng)抗草甘膦大豆都具有較好的效果[22-23]。本研究通過抗性鑒定、分子生物學特征分析，明確抗草甘膦玉米AG16的分子特征和草甘膦抗性水平，以期為培育自主知識產(chǎn)權的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1植物材料

本研究使用的玉米轉(zhuǎn)化受體為Hi-Ⅱ品種，轉(zhuǎn)育用親本自交系為鄭 58(Z58)和昌7-2，種子由浙江大學轉(zhuǎn)基因抗蟲植物和生物安全實驗室保存并種植，對照組鄭單958是Z58和昌7-2雜交獲得的雜交種。轉(zhuǎn)化事件AG16 T0代與Z58雜交后，以Z58為輪回親本，回交4代，再自交2代，得到含有草甘膦抗性基因的自交系Z58-AG16，Z58-AG16與昌7-2雜交獲得的F1代雜交種用于本研究。

1.2目的基因PCR檢測

采用PCR擴增方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米AG16目的基因。采集5個Z58-AG16與昌7-2雜交獲得的F1代玉米葉片，CTAB法[24]提取玉米基因組，用NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)檢測所提取玉米基因組的質(zhì)量和濃度。根據(jù)目的基因設計引物G10evo-F(GACGCCCTGCCCGCCACCTTC)和G10evo-R(GGCGGTGGCCTCAGCGTACTCG)，擴增產(chǎn)物用含有1% EB的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并拍照。

1.3Southernblot分析

Southern blot[25]分析使用Roche的DIG DNA Labeling and Detection Kit Ⅱ試劑盒(Roche，Basel，Switzerland)。CTAB法提取玉米基因組，選擇適當?shù)膬煞N酶分別酶切100 μg玉米基因組，酶切片段用0.8%的瓊脂糖凝膠分離，分離后轉(zhuǎn)帶正電的尼龍膜(Amersham，UK)，轉(zhuǎn)膜20 h左右。利用PCR方法擴增合成雜交探針，擴增的目的片段使用DIG-High Prime DNA Labeling標記。轉(zhuǎn)膜結束后120 ℃烘烤尼龍膜，30 min后，將尼龍膜置于雜交管中，42 ℃預雜交30 min，傾盡預雜交液，加入含地高辛標記探針的雜交液，55 ℃雜交過夜。最后洗膜，化學曝光顯影20 min。

1.4Westernblot分析

采用Western blot[26]的方法來檢測轉(zhuǎn)基因玉米AG16的G10evo蛋白表達情況。采集玉米新鮮葉片0.1 g，液氮浸泡，研磨。磨碎的粉末中加入200 μL PBS，混勻離心，取上清，按體積比加入5×SDS-PAGE Loading Buffer。制備好的蛋白樣品用SDS-PAGE電泳分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再將膜封閉在含5%的脫脂奶粉的TBST溶液中，37 ℃搖床1 h。封閉完成后，換1%的脫脂奶粉的TBST溶液，向溶液中按1∶2 500的比例加入一抗，37 ℃搖床孵育1 h，再用TBST洗膜3次，每次5 min。一抗孵育后在1%的脫脂奶粉的TBST溶液中，按一定比例加入二抗，37 ℃搖床孵育1 h。最后洗膜，DAB顯色，顯色至出現(xiàn)條帶時用水清洗膜，晾干，拍照。

1.5轉(zhuǎn)基因玉米植株抗性測定

在溫室種植轉(zhuǎn)基因玉米AG16和非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958采用盆栽的方式，盆的大小為直徑(d)30 cm×高(H)50 cm，每盆4株，后期間苗，每盆保留兩株。每盆做好標簽，等到玉米生長到4-5葉期的時候，分別對其噴施不同濃度的草甘膦，每個濃度4個重復，一周后拍照記錄。本研究噴灑的草甘膦為美國孟山都公司生產(chǎn)的農(nóng)達(20150425，Monsanto，LaConner，USA)，是滅生性內(nèi)吸傳導型莖葉除草劑，通過植物綠色部位吸收。原產(chǎn)地馬來西亞，水劑型，有效成分含量30%，草甘膦異丙胺鹽含量41%，玉米田間推薦使用藥量為每畝150～250 mL，每畝合(666.67 m2)兌水30～40 L，約2.05 g·L-1，45 mL·m-2。將水劑農(nóng)達用水按體積比稀釋成有效質(zhì)量濃度為0、2.05 (1∶200)、4.10 (1∶100)，8.20 (1∶50)和16.40 g·L-1(1∶25)共5個梯度，分別噴灑在轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米上，每盆樣品的噴灑量為45 mL·m-2[17]。

1.6目的蛋白表達量測定

用ELISA試劑盒(YouLong Biotech，Shanghai)檢測轉(zhuǎn)基因玉米不同組織的G10evo蛋白表達情況。操作方法參考G10-EPSPS試劑盒使用手冊。從轉(zhuǎn)基因玉米AG16和非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958提取根、莖和葉片中的蛋白，葉片從新葉到老葉取4片葉片(Leaf 1，Leaf 2，Leaf 3，Leaf 4)分別提取蛋白，每個組織6個重復，在450 nm下測其吸光度[26]。

2 結果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因玉米PCR鑒定

任意采集5株轉(zhuǎn)基因玉米植株AG16和1株非轉(zhuǎn)基因鄭單958的葉片，用于PCR鑒定。用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米基因組，對載體1300-p35S-pUbi-G10evo(圖1)中的T-DNA中的目的基因G10evo進行鑒定，確定是否含有T-DNA。預計擴增G10evo基因目的條帶大小為1 311 bp， 用含有 1% EB的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。結果顯示，5株AG16轉(zhuǎn)基因玉米基因組中擴增出G10evo基因的目的片段均為1 300 bp左右，與陽性質(zhì)粒擴增出的條帶大小一致，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M沒有出現(xiàn)條帶，這說明5個F1代雜交后代中均含有G10evo基因(圖2)。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米G10evo PCR鑒定Fig. 2 PCR analysis of G10evo in GM-maize

2.2轉(zhuǎn)基因玉米拷貝數(shù)鑒定

用草甘膦篩選過的轉(zhuǎn)基因陽性玉米，進行DNA印記檢測(Southern blot)，以檢測T-DNA的拷貝數(shù)。根據(jù)G10evo基因序列設計合成探針的引物G10evo-PRB-F(GACGCCCTGCCCGCCACCTTC)和G10evo-PRB-R(GGCGGTGGCCTCAGCGTACTCG)。AG16基因組和玉米陰性對照分別用KpnⅠ和EcoRⅤ單酶切，陽性質(zhì)粒用KpnⅠ 單酶切，雜交溫度根據(jù)GC含量設定為55.5 ℃。陽性質(zhì)粒酶切片段大小4 536 bp，EcoRⅤ的酶切片段大小為5 000 bp左右，KpnⅠ的酶切片段大小為7 400 bp左右，均符合預期的大小。而且AG16的兩種酶切片段的Southern blot結果顯示G10evo在玉米基因組中為單拷貝(圖3)。

2.3轉(zhuǎn)基因玉米G10evo蛋白表達分析

用Western blot方法對抗草甘膦玉米轉(zhuǎn)化系AG16不同組織G10evo蛋白的表達分析結果顯示，抗草甘膦蛋白G10evo在根、莖和葉等組織中均有表達，目的蛋白分子與原核表達的G10evo大小一致，為48 kDa，且葉片和莖中G10evo的表達量明顯高于根部(圖4)。

2.4轉(zhuǎn)基因玉米植株草甘膦抗性測定

對生長在溫室條件下，4-5葉期的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩追謩e噴灑相當于大田推薦使用濃度的0、1、2、4和8倍的0、2.05、4.10、8.20和16.40 g·L-15個濃度的草甘膦，一周后觀察其表型差異。

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米AG16中G10evo的Southern blot分析Fig. 3 Southern blot of G10evo in AG16

圖4 Western blot分析檢測轉(zhuǎn)基因玉米G10evo蛋白表達Fig. 4 Western blot analysis of G10evo protein expression in GM-maize

在噴施2.05、4.10、8.20和16.40 g·L-1濃度的草甘膦1周后，非轉(zhuǎn)基因玉米對照組全部死亡；在噴灑2.05、4.10和8.20 g·L-1濃度的草甘膦1周后轉(zhuǎn)基因玉米，沒有明顯的藥害(圖5)，這說明轉(zhuǎn)G10evo基因玉米具有較高的草甘膦抗性。噴灑16.40 g·L-1濃度的草甘膦對轉(zhuǎn)基因玉米會產(chǎn)生一定的藥害，葉緣和葉尖枯黃、玉米生長緩慢，個別心葉有白斑，但持續(xù)2～3周后，藥害逐漸消除，轉(zhuǎn)基因玉米能恢復正常生長。8倍濃度的草甘膦噴施2～3 d后，轉(zhuǎn)基因玉米葉片上出現(xiàn)輕微的白斑，這可能是因為草甘膦的毒害作用，也有可能是因為8倍田間濃度的草甘膦中，異丙酰胺鹽濃度過高，使得轉(zhuǎn)基因玉米葉片因為滲透壓的作用受到傷害，導致葉片出現(xiàn)輕微白斑。

圖5 轉(zhuǎn)基因玉米AG16的草甘膦抗性Fig. 5 Glyphosate tolerance of GM AG16 maize

圖6 草甘膦噴灑前后AG16玉米不同組織的G10evo蛋白表達量Fig. 6 Concentration of G10evo in different tissues of AG16 maize before and after spraying glyphosate

2.5轉(zhuǎn)基因玉米抗草甘膦蛋白G10evo表達量

對生長在溫室條件下，4-5葉期的轉(zhuǎn)基因玉米AG16不同組織中G10evo蛋白含量進行ELISA定量檢測。結果顯示，在噴灑草甘膦前幼莖組織中G10evo蛋白表達量最高，為9.975 μg·g-1，其次是第4片葉，為8.750 μg·g-1；表達量最低的是新生第1和第2片葉，分別為2.152和2.163 μg·g-1。噴灑草甘膦后各組織中的G10evo蛋白表達量均有提高，但表達量最高的還是在幼莖組織中，為11.234 μg·g-1，增加12.6%，最少的為第1片葉，為3.315 μg·g-1，增加54.0%，第2片葉為3.524 μg·g-1，增加62.9%，其余增加量均小于10%(圖6)。這說明在草甘膦的刺激下，幼嫩組織能增加G10evo蛋白的表達量，以提高對草甘膦的耐受能力。

3 討論與結論

根據(jù)氨基酸保守序列和對草甘膦的敏感性，天然EPSPS被分為兩類，通常來自大多數(shù)植物和革蘭氏陰性細菌的Ⅰ類EPSPS被認為是對草甘膦敏感，但是由于某些氨基酸突變，它們因此對草甘膦產(chǎn)生耐受性[27]。 相比之下，來自根癌土壤桿菌的CP4菌株，無色桿菌LBAA菌株，假單胞菌屬 PG2982菌株，枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和奧氏嗜熱鹽絲菌 H168本身具有對草甘膦的耐受性，與Ⅰ類EPSPS相比同源性低于30%[28-31]。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些對草甘膦天然不敏感但具有接近于Ⅰ類EPSPS的保守序列的新型EPSPS，包括4G-1、GRG23、GRG51、AM79AroA、Gr5aroA和AroAJ.sp[32-36]，但是被批準商業(yè)化應用的草甘膦抗性基因卻很少[18]。本研究使用的G10evo基因是浙江大學轉(zhuǎn)基因抗蟲植物和生物安全實驗室獨立克隆和改造獲得的能夠高抗草甘膦的新基因，具有自主知識產(chǎn)權。其氨基酸序列與目前劃分出的EPSPS家族Ⅰ、Ⅱ類抗草甘膦基因親緣性很低，保守序列相差很大，既不屬于Class Ⅰ也不屬于 Class Ⅱ[20-21]，該基因在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)和大豆(Glycinemax)中均表現(xiàn)出良好的草甘膦抗性，用該基因培育的抗草甘膦大豆對草甘膦具有高抗性，能夠滿足生產(chǎn)需要[22]。

我國轉(zhuǎn)基因玉米新品種選育仍處于研發(fā)階段。本研究以玉米泛素蛋白基因的啟動子(pZmUbiquitin)作為G10evo基因的啟動子，同時以煙草花葉病毒 35S啟動子 (35S promoter)作為增強子，使用來源于玉米的乙酰羥基酸合酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)的信號肽，利用農(nóng)桿菌介導法將G10evo導入到玉米中，篩選得到高抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因玉米AG16，并從DNA、蛋白和功能性狀三個方面對轉(zhuǎn)基因玉米AG16進行分析檢測。

DNA分子檢測結果顯示，G10evo基因單拷貝插入到AG16基因組中，T-DNA的單拷貝插入有利于外源基因的穩(wěn)定遺傳，避免因為外源基因分離導致目的性狀不穩(wěn)定。Western blot結果顯示，G10evo蛋白在AG16植株的根、莖和葉中均有表達，外源蛋白大小與預期大小一致。ELISA定量分析結果顯示，G10evo蛋白在AG16組織中均有較高水平的表達，尤其是在嫩莖組織，噴灑草甘膦前后，表達量分別達到9.975和11.234 μg·g-1。草甘膦抗性試驗結果證明，AG16可以抗4～8倍田間用量的草甘膦(8.20～16.10 g·L-1)?？钩輨┦巧虡I(yè)化轉(zhuǎn)基因作物中最為重要的性狀之一，關于草甘膦抗性基因挖掘和應用的研究報道眾多，但是能夠商業(yè)化應用的卻很少。目前商業(yè)化應用的抗草甘膦主要有孟山都公司的CP4EPSPS、先正達公司玉米EPSPS突變改良基因和GRG23，其中又主要以CP4EPSPS應用最為廣泛。主要原因有以下幾方面，一是產(chǎn)權問題，孟山都公司以CP4EPSPS為中心，申請了一系列專利保護，將大多同源基因囊括在其保護群中；二是抗性水平問題，在生產(chǎn)應用中存在著重復噴施和農(nóng)藥錯誤配制的問題，因此推廣應用的抗草甘膦作物必須有較高的抗性，能夠降低用藥錯誤造成藥害的風險。本研究使用的抗草甘膦基因G10evo獲得的抗草甘膦玉米轉(zhuǎn)化系AG16中的外源T-DNA為單拷貝插入、遺傳背景清晰，抗草甘膦蛋白在玉米的各個組織中表達較高。AG16能夠抗4～8倍田間施用量的草甘膦，滿足生產(chǎn)推廣的需要，為我國抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米新品種培育提供了有價值的種質(zhì)資源。

G10evo基因作為高抗草甘膦的基因，除了應用于研發(fā)抗草甘膦大豆和玉米等作物中，還可以用于培育抗草甘膦牧草，如抗草甘膦苜蓿(Medicagosativa)。苜蓿被稱為牧草之王，其雜草的防治受時間、空間以及除草劑品種等多種因素的嚴格限制[37]。培育抗草甘膦苜蓿，可以提高苜蓿雜草防治效率，有效防止其它雜草對養(yǎng)分和空間的占用，提高牧草青貯的質(zhì)量和數(shù)量。抗草甘膦性狀在草坪草上同樣具有重要的應用價值，在草坪養(yǎng)護過程中尤其是像高爾夫球場等高質(zhì)量的草坪上，對同種、屬、科的其它雜草進行防除，傳統(tǒng)選擇性除草劑的防治效果有限，將抗草甘膦基因G10evo轉(zhuǎn)入到草坪草如狗牙根(Cynodondactylon)、結縷草(Zoysiajaponica)、假儉草(Eremochloaophiuroides)等常見草坪草中，可以簡化草坪雜草防治方法，提高雜草防治效率。

References：

[1] 閆貴龍,田樹飛,穆秀明,曹春梅,王瑞兵,陳哲凱.摘穗和收獲時間對甜玉米秸稈主要營養(yǎng)成分的影響.草業(yè)科學,2015,32(8):1323-1328. Yan G L,Tian S F,Mu X M,Cao C M,Wang R B,Chen Z K.Influence of ear stripping and stalk harvesting time on main nutrient components of sweet corn stalks.Pratacultural Science,2015,32(8):1323-1328.(in Chinese)

[2] 劉會芳,南志標,唐增,王麗佳.苜蓿、小麥、玉米經(jīng)濟效益比較——以甘肅省為例.草業(yè)科學,2016,33(5):990-995. Liu H F,Nan Z B,Tang Z,Wang L J.Comparison of economic benefit of alfalfa,wheat and maize——A case study in Gansu Province.Pratacultural Science,2016,33(5):990-995.(in Chinese)

[3] 李婧,李玲玲,張立健,陳亮亮,謝軍紅.氮肥用量對糧飼兼用玉米產(chǎn)量和飼用品質(zhì)形成的影響.草業(yè)科學,2015,32(3):442-449. Li J,Li L L,Zhang L J,Chen L L,Xie J H.Effects of nitrogen application on yield and forage quality of grain and forage maize.Pratacultural Science,2015,32(3):442-449.(in Chinese)

[4] 向柏菊,李成君,張建,羅藝,蔣安.CBFI基因轉(zhuǎn)化玉米SAUMAI提高抗寒性的研究.草業(yè)科學,2012,29(9)：1374-1378. Xiang B J,Li C J,Zhang J,Luo Y,Jiang A.Transformation ofCBF1 gene to maize grass SAUMZI improves its ability of cold resistance.Pratacultural Science,2012,29(9):1374-1378.(in Chinese)

[5] ISAAA.Global status of commercialized biotect/GM crops:2016.ISAAA Brief,2016,52:89-90.

[6] Brookes G,Barfoot P.Economic impact of GM crops:The global income and production effects 1996-2012.Biotechnology in Agriculture and the Food Chain,2014,5(1):65-75.

[7] Brookes G,Barfoot P.Global income and production impacts of using GM crop technology 1996-2014.Biotechnology in Agriculture and the food chain,2016,7(1):38-77.

[8] Benbrook C M.Trends in glyphosate herbicide use in the United States and globally.Environmental Sciences Europe,2016,28(1):3.

[9] Battaglin W A,Meyer M T,Kuivila K M,Dietze J E.Glyphosate and its degradation product AMPA occur frequently and widely in US soils,surface water,groundwater,and precipitation.Journal of the American Water Resources Association,2014,50(2):275-290.

[10] Heidi L.Transgenic grass skirts regulations.Nature,2011,475:274-275.

[11] Zhao T,Lin C,Shen Z.Development of transgenic glyphosateresistant rice withG6 gene encoding 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase.Agricutural Sciences in China,2011,10:1307-1312.

[12] Tian Y S,Xu J,Peng R,Xiong A S,Xu H,Zhao W,Fu X Y,Han H J,Yao Q H.Mutation by DNA shuffling of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromMalusdomesticafor improved glyphosate resistance.Plant Biotechnology Journal,2013,11:829-838.

[13] Tian Y S,Xu J,Xing X J,Zhao W,Fu X Y,Peng R H,Yao Q H.Improved glyphosate resistance of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromVitisviniferain transgenicArabidopsisand rice by DNA shuffling.Molecular Breeding,2015,35:148.

[14] Chhapekar S,Raghavendrarao S,Pavan G,Ramakrishna C,Singh V K,Phanindra M L,Dhandapani G,Sreevathsa R,Kumar P A.Transgenic rice expressing a codonmodified syntheticCP4-EPSPSconfers tolerance to broad-spectrum herbicide,glyphosate.Plant Cell Reports,2015,34:721-731.

[15] Yi S Y,Cui Y,Zhao Y,Liu Z D,Lin Y Z,Zhou F.A novel naturally-occurring Class Ⅰ 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromJanibactersp. confers high glyphosate tolerance to rice.Scientific Reports,2016,6:19104.

[16] Yu G R,Liu Y,Du W P,Song J,Lin M,Xu L Y,Xiao F M,Liu Y S.Optimization ofAgrobacteriumtumefaciens-mediated immature embryo transformation system and transformation of glyphosate-resistant gene 2mG2-EPSPSin maize(ZeamaysL.).Journal of Integrative Agriculture,2013,12(12):2134-2142.

[17] Zhang X P,Tang Q L,Wang X J,Wang Z X.Development of glyphosate-tolerant transgenic cotton plants harboring theG2-aroAgene.Journal of Integrative Agriculture,2017,16(3):551-558.

[18] ISAAA.GM Approval Datebase,2017.http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/

[19] James C.20th Anniversary of the Global Commercialization of Biotech Crops (1996 to 2015) and Biotech Crop Highlights in 2015.ISAAA Briefs,2016,51:6-10.

[20] 沈志成.一種抗草甘膦基因的用途.中國專利:200910098129X,2011-04-06. Shen Z C.One use of glyphosate resistant gene.China Patent:200910098129X,2011-04-06.(in Chinese)

[21] 李京.新型轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米的培育及轉(zhuǎn)基因玉米安全控制技術的研究.杭州:浙江大學博士學位論文,2013. Li J.Cultivation of new transgenic glyphosate-resistant maize and study on safety control technology of transgenic maize.PhD Thesis.Hangzhou:Zhejiang University,2013.(in Chinese)

[22] 譚苗苗.轉(zhuǎn)G10evo基因抗草甘膦大豆的研究.杭州:浙江大學碩士學位論文,2016. Tan M M.The study ofG10evoglyphosate-resistant transgenic soybean.Master Thesis.Hangzhou:Zhejiang University,2016.(in Chinese)

[23] 陸玲鴻,韓強,李林,周練,劉瑞芳,宋張悅,沈志成,壽惠霞.以草甘膦為篩選標記的大豆轉(zhuǎn)基因體系的建立及抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的培育.中國科學:生命科學,2014,44:406-415. Lu L H,Han Q,Li L,Zhou L,Liu R F,Song Z Y,Shen Z C,Shou H X.Establishment of an efficient transformation protocol for soybean using glyphosate as selective agent and the development of glyphosate-tolerant transgenic soybean lines.Scientia Sinica Vitae,2014,44:406-415.(in Chinese)

[24] 王芳,王漢寧,張金文,魚小軍.玉米基因組DNA的高效快速提取.草業(yè)科學,2006,23(12):65-66. Wang F,Wang H N,Zhang J W,Yu X J.Rapid and highly effective extraction of maize genomic DNA.Pratacultural Science,2005,23(12):65-66.(in Chinese)

[25] Sambrock J,Russel D W.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.3rd Ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001.

[26] Zhao Q,Liu M H,Tan M M,GaoJ H,Shen Z C.Expression of Cry1Ab and Cry2Ab by a polycistronic transgene with a selfcleavage peptide in rice.PLoS One,2014,9:e110006.

[27] Cui Y,Huang S,Liu Z,Yi S,Zhou F,Chen H,Lin Y.Development of novel glyphosate-tolerant Japonica rice lines:A step toward commercial release.Frontiers in Plant Science,2016,7:1218.

[28] Fitzgibbon J E,Braymer H D.Cloning of a gene fromPseudomonassp. strain PG2982 conferring increased glyphosate resistance.Applied and Environmental Microbiology,1990,56:3382-3388.

[29] Barrell P J,Conner A J.Facilitating the recovery of phenotypically normal transgenic lines in clonal crops:A new strategy illustrated in potato.Theoretical and Applied Genetics,2011,122:1171-1177.

[30] Priestman M A,Funke T,Singh I M,Crupper S S,Sch?nbrunn E.5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromStaphylococcusaureusis insensitive to glyphosate.FEBS Letters,2005,579:728-732.

[31] Tian Y S,Xu J,Xiong A S,Zhao W,Gao F,Fu X Y.Functional characterization of Class Ⅱ 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromHalothermothrixoreniiH168 inEscherichiacoliand transgenicArabidopsis.Applied Microbiology Biotechnology,2012,93:241-250.

[32] Sun Y C,Chen Y C,Tian Z X,Li F M,Wang X Y,Zhang J Xiao Z L,Lin M,Gilmartin N,Dowling D N.Novel AroA with high tolerance to glyphosate,encoded by a gene ofPseudomonasputida4G-1 isolated from an extremely polluted environment in China.Applied and Environmental Microbiology,2005,71:4771-4776.

[33] Peters C L,Hinson J,Hammer P E,van de Berg B,Schouten L C,CarrB.GRG23 andGRG51 Genes Conferring Herbicide Resistance.U.S.Patent:7,674,958B2,2010.

[34] Cao G Y,Liu Y J,Zhang S X,Yang X W,Chen R R,Zhang Y W,Lu W,Liu Y,Wang J H,Lin M.A novel 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase shows high glyphosate tolerance inEscherichiacoliand tobacco plants.PLoS One,2012.7:e38718.

[35] Wang J,Zuo K J,Lu W,Zhu Y,Ye C,Lin M,Tang K X.Over-expression of theGr5aroAgene from glyphosate-contaminated soil confers high tolerance to glyphosate in tobacco.Molecular Breeding,2014,33:197-208.

[36] Yi S Y,Cui Y,Zhao Y,Liu Z D,Lin Y Z,Zhou F.A novel naturally-occurring Class Ⅰ 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromJanibactersp. confers high glyphosate tolerance to rice.Scientific Reports,2016,6:19104.

[37] 王笛,李達,徐安凱,徐博,高陽.吉林中部地區(qū)紫花苜蓿地除草劑篩選試驗.草業(yè)科學,2016,33(5):956-962. Wang D,Li D,Xu A K,Xu B,Gao Y.Herbicides selection of alfalfa pasture in the central area of Jilin Province.Pratacultural Science,2016,33(5):956-962.(in Chinese)

(責任編輯 武艷培)

MolecularcharacterizationandefficacyevaluationofatransgeniccorneventAG16

Liu Miao-miao1, Cheng Jia-hui1, Lin Hai-yan1, Shen Zhi-cheng1, Wang Zhi-yong2, Lin Chao-yang1
(1.Department of Plant Protection, Institute of Insect Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2.College of Agronomy，Hainan University, Haikou 570228, China)

Glyphosate-resistant transgenic maize can significantly improve the efficiency of weed control. In previous studies, the newly glyphosate-tolerant geneG10evowas integrated into the genome of maize named Hi-Ⅱ byAgrobacterium-mediated transformation, and different glyphosate-tolerant maize events were obtained. In the study, transgenic maize AG16 was selected for molecular characterization by PCR, Western blot, Southern blot and ELISA. Southern blot analysis using probe forG10evoshowed that T-DNA was integrated in a single site in the maize genome. Western blot analysis showed that G10evo protein was expressed in leaf, stem and root of AG16. ELISA assay showed that the expression level of G10evo protein in the young stem reached 9.975 μg·g-1before glyphosate spraying. Glyphosate spray assay in the greenhouse showed that the AG16 is tolerant to glyphosate at concentrations up to 4 times of recommended field application level. Therefore, the transgenic maize AG16 has the potential of field application, which is expected to become completely independent research and independent intellectual property rights of domestic glyphosate-resistant corn.

G10evogene; PCR detection; Southern blot; Western blot; protein quantification; glyphosate-resistant evaluation; weed control

Lin Chao-yang E-mail：chylin@zju.edu.cn

S451.1;S513.034;Q943.2

：A

：1001-0629(2017)09-1830-08

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0375

劉苗苗,程家慧,林海燕,沈志成,王志勇,林朝陽.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米AG16分子特征和抗性鑒定.草業(yè)科學,2017,34(9)：1830-1837.

Liu M M,Cheng J H,Lin H Y,Shen Z C,Wang Z Y,Lin C Y.Molecular characterization and efficacy evaluation of a transgenic corn event AG16.Pratacultural Science，2017,34(9)：1830-1837.

2017-07-07接受日期：2017-08-20

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ棥踩D(zhuǎn)基因技術研究(2016ZX08010-003)

劉苗苗(1990-)，女，江西余干人，在讀碩士生，研究方向為植物保護與農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術。 E-mail：21416110@zju.edu.cn

林朝陽(1979-)，男，福建漳州人，講師，博士，研究方向為植物生物技術。E-mail：chylin@zju.edu.cn