李小橋，歐陽吳莉，武 煊，王永紅

(重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶 401120)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物殘留量的研究

李小橋，歐陽吳莉，武 煊，王永紅

(重慶市動物疫病預(yù)防控制中心，重慶 401120)

建立了牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物三氯苯唑酮?dú)埩袅康某咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，正己烷除脂，經(jīng)超高效液相色譜儀和C18色譜柱分離，以乙腈和5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫。加熱電噴霧負(fù)離子模式(HESI-)電離，選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：三氯苯噠唑和三氯苯唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液在5～500 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r2>0.99，方法檢測限為1 μg/kg，定量限為2 μg/kg。三氯苯噠唑和三氯苯唑酮在2～10 μg/kg添加水平范圍內(nèi)的回收率為72.3%～110%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于13.5%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

三氯苯噠唑；三氯苯唑酮；牛奶；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Abstract: An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the determining of triclabendazole(TCB) and its metabolite ketotriclabendazole(KTO-TCB) in milk. The sample was extracted by ethyl acetate and purified by hexane，and then separated by a C18 column with gradient elution solvent of 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile.The electrospray was operated in the negative ionization mode, TCB and KTO-TCB were identified under selected reaction monitoring (SRM). The method was quantified by external standard method.The results showed good linearity of TCB and KTO-TCB in the range of 5～500 μg/L with correlation coefficients(r2) above 0.99,The limit of detection was 1 μg/kg,and the limit of quantification was 2 μg/kg. The average recoveries of TCB and KTO-TCB at 2～10 μg/kg were 72.3%～110%,and the relative standard deviations of intra-and inter-batch were both less than 13.5%.The method is simple,rapid,sensitive and accurate.

Keywords: triclabendazole;ketotriclabendazole; milk; UPLC-MS/MS

三氯苯噠唑?qū)儆谛滦偷谋讲⑦溥蝾愹?qū)蟲藥，對牛、羊的肝片吸蟲、大片形吸蟲及前后盤吸蟲均有良好的殺滅效果，在我國廣泛應(yīng)用于反芻動物肝片吸蟲病治療[1-3]。為有效的控制其在動物性食品中的殘留，我國農(nóng)業(yè)部235號公告[4]規(guī)定了三氯苯噠唑殘留標(biāo)志物三氯苯唑酮在牛羊的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織的殘留限量。2014年6月20日，歐盟發(fā)布法規(guī)(EU)No676/2014[5]增加了三氯苯噠唑及其代謝物三氯苯唑酮在牛奶中殘留限量10 μg/kg，目前我國還未見到牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物殘留檢測方法的報道，因此，建立一種快速準(zhǔn)確的檢測方法十分必要。目前在動物性食品中提取三氯苯噠唑及其代謝物主要使用有機(jī)溶劑，如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等[1-3,6,7]。已報道檢測動物性食品中三氯苯噠唑及其代謝物的方法有HPLC-UV[1,6,8]和UPLC-MS/MS[3.9-11]法，HPLC-UV法前處理較為繁瑣、靈敏度低且定性不夠準(zhǔn)確，UPLC-MS/MS靈敏度高、定性準(zhǔn)確，適合牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物檢測。本文旨在建立一種牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物的UPLC-MS/MS檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：TSQ Quantum，美國Thermo Scientific公司；色譜柱：Thermo Gold C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.1 μm)，美國Thermo Scientific公司；電子天平：AE250，瑞士Mettler公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Laborota4000型，德國Heidolf公司；高速冷凍離心機(jī)：SIGMA-3K30，德國SIGMA公司；渦旋振蕩儀：SIR4，德國IKA公司；空氣搖床：KS260，德國IKA公司；氮吹儀：TTL-DCII型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司；甲醇、乙腈為色譜純，均購自Fisher公司；正己烷、乙酸乙酯為分析純，均購自重慶邁克公司。

對照品：三氯苯噠唑?qū)φ掌?，批號H0421108，含量99.8%，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；三氯苯唑酮對照品，批號281527，含量99.0%，購于德國WITEGA公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取三氯苯噠唑和三氯苯唑酮對照品10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分別配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃保存3個月。分別吸取三氯苯達(dá)唑和三氯苯唑酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存7 d。分析時再用流動相稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制：將7份空白牛奶樣品按照1.2.3項樣品前處理得基質(zhì)提取液，將濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用基質(zhì)提取液稀釋成濃度為5、10、20、50、100、200、500 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2 儀器分析條件

1.2.1 液相色譜 色譜柱為Thermo Hypersll Gold C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相A相為乙腈；B相為5 mmol/L乙酸銨溶液；流動相梯度洗脫程序：0～1.5 min，A相由55%變?yōu)?0%，1.5～4 min為80%，4.1～7 min保持為55%；流速為0.25 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 加熱電噴霧負(fù)離子源(HESI-)；噴霧電壓-2500 V；離子傳輸管溫度350 ℃；蒸發(fā)氣溫度280 ℃；鞘氣壓力：30 Arb；輔氣壓力：25 Arb。選擇反應(yīng)監(jiān)測三氯苯噠唑和三氯苯唑酮定性離子對，透鏡電壓和碰撞能量見表1，一級質(zhì)譜圖見圖1。

1.2.3 樣品前處理 稱取試樣(5±0.05)g于50 mL塑料離心管中，加入乙酸乙酯20 mL，渦旋混勻后，高速振蕩10 min，10000 r/min離心8 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中，重復(fù)提取一次，合并上清液于45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。向雞心瓶中依次加入1 mL甲醇和3 mL甲醇飽和的正己烷，充分溶解，將溶解液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，重復(fù)一次，合并兩次溶解液，中速振蕩5 min，5000 r/min離心5 min，棄掉上層溶液，下層溶液于45 ℃下氮?dú)獯蹈?，加? mL流動相(A∶B=55∶45)溶解，過0.22 μm微孔濾膜后供UPLC-MS/MS分析。

表1 三氯苯噠唑和三氯苯唑酮的定性、定量離子對、透鏡電壓和碰撞能量Tab 1 Confirmation and quantification ions,Tube lens voltage and cllision energy of Triclabendazole and Ketotriclabendazole

*quantification ions

圖1 三氯苯噠唑和三氯苯唑酮在ESI—條件下一級質(zhì)譜圖Fig 1 the Q1 Mass Spectrometry of Triclabendazole and Ketotriclabendazole in negative ion mode

2 結(jié)果和分析

2.1 線性范圍 將1.1項中配制的線性范圍為5～500 μg/L基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上機(jī)測定，以定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對照溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線A三氯苯噠唑=21462.5+8481.61C，相關(guān)系數(shù)r=0.9971，A三氯苯唑酮=1264.63+620.622C，相關(guān)系數(shù)r=0.9938。

2.2 方法回收率與精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶中添加2、5、10 μg/kg濃度的三氯苯噠唑及三氯苯唑酮進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，考察方法的準(zhǔn)確性和精密度，每批次同一濃度做5次平行實驗，重復(fù)3次，結(jié)果見表2。本方法在空白牛奶中的平均回收率為72.3%～110%， 批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤13.5%。

表2 牛奶中三氯苯噠唑和三氯苯唑酮回收率試驗結(jié)果(n=5)Tab 2 Spiked recoveries and RSD of Triclabendazole and Ketotriclabendazole in milk(n=5)

2.3 檢測限與定量限 采用空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法, 以特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N>3為方法檢測限，S/N>10為方法定量限。牛奶中三氯苯噠唑和三氯苯唑酮檢測限均為1 μg /kg，定量限均為2 μg/kg，空白牛奶及其添加檢測限濃度色譜圖見圖2。

3 討論與小結(jié)

3.1 前處理方法優(yōu)化 三氯苯噠唑?qū)儆谌鯄A性藥物，溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。本實驗選擇乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑，二者回收率相當(dāng)，雖然乙腈提取牛奶時油脂較少，但由于牛奶中水分較多，需要在牛奶中加氯化鈉等進(jìn)行鹽析分層，否則乙腈提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中很難蒸發(fā)至干，步驟較為繁瑣，因此選擇乙酸乙酯作為提取液。三氯苯噠唑及其代謝物常用凈化方法有液液萃取和液固萃取法，李丹[6]等發(fā)現(xiàn)三氯苯噠唑和三氯苯唑酮極性差異較大，在C18、HLB、MCX、氰基柱(CN-E)和硅膠柱等固相萃取柱上保留效果均不理想。仲鋒[1]等在羊肌肉、肝臟、腎臟中使用乙酸乙酯作為提取溶劑，脂肪組織使用乙腈進(jìn)行提取。凈化方法目前有液液萃取和液-固萃取，李丹[6]等發(fā)現(xiàn)三氯苯噠唑和三氯苯唑酮極性差異較大，常用固相萃取柱對二者回收率不能兼顧。因此，本研究采用液液萃取法，利用甲醇飽和的正己烷進(jìn)行凈化除脂，簡便快捷，回收率和凈化效果均比較理想。

3.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 稱取5份空白樣品按1.2.3項方法處理后，加入10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，再與對應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)進(jìn)行測定。比較發(fā)現(xiàn)兩種藥物均為基質(zhì)減弱效應(yīng)，其中，三氯苯唑酮峰面積降低約50%，三氯苯噠唑降低約20%，這是本方法選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液作為校準(zhǔn)結(jié)果的目的。

3.3 液相色譜條件優(yōu)化 在HESI-條件下，一般選擇乙酸銨溶液或純水作為流動相，本方法在乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液條件下，兩種化合物靈敏度和峰形最好。由于三氯苯噠唑和三氯苯唑酮極性差異較大，本實驗考察了兩種化合物在C18色譜柱上保留情況，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，三氯苯噠唑極性較小，當(dāng)有機(jī)相高達(dá)80%時才能較快地將三氯苯噠唑洗脫。

3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 Cai[3]等報道在ESI+條件下，三氯苯噠唑及其代謝物三氯苯唑砜、三氯苯唑亞砜和三氯苯唑酮均能獲得較高響應(yīng)值。本實驗分別注射1 μg/mL三氯苯噠唑和三氯苯唑酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，在加熱電噴霧正離子HESI+條件下，三氯苯噠唑響應(yīng)值可達(dá)E6，但是，三氯苯唑酮響應(yīng)值較差，兩者相差近1000倍，這與Cai等研究結(jié)果差異較大。但在加熱電噴霧負(fù)離子源HESI—條件下，三氯苯噠唑和三氯苯唑酮均能獲得較高響應(yīng)值，與Jedziniak P[12]等報道結(jié)果一致。分析原因可能是三氯苯唑酮分子中含有三個氯離子，在負(fù)離子模式下響應(yīng)值增強(qiáng)。

圖2 空白牛奶中添加1μg/kg濃度水平(A)和空白牛奶(B)中三氯苯噠唑和三氯苯唑酮色譜圖Fig 2 Chromatographic trace of Triclabendazole and Ketotriclabendazole in negative milk spiked at 1μg/kg(A) and negative milk(B)

三氯苯噠唑和三氯苯唑酮分子式中均含有三個氯離子，而氯元素在自然界有兩種天然同位素35Cl(75.77%)和37Cl(24.23%)[13]，從三氯苯噠唑和三氯苯唑酮的一級質(zhì)譜圖可以看出，兩種化合物母離子有幾處相對豐度較高，因此本實驗選擇三氯苯噠唑356.7和358.6為母離子，通過二級質(zhì)譜打碎后得356.7>341.8和358.6>343.7，鑒定積分為5，完全滿足歐盟2002/657/EC[14]技術(shù)文件對獸藥殘留確證提出的鑒定積分要求。同理，三氯苯唑酮采用相同方法。

本文建立了牛奶中三氯苯噠唑及其代謝物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷除脂，在HESI-下選擇反應(yīng)監(jiān)測模式檢測樣品。三氯苯噠唑和三氯苯唑酮在2、5、10 μg/kg加標(biāo)水平下平均回收率在72.3%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤13.5%，方法檢測限為1 μg/kg，表明該方法靈敏度高，穩(wěn)定可行，前處理過程簡便快捷，滿足我國有關(guān)食品檢測法規(guī)要求。

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(編輯：侯向輝)

DeterminationofTriclabendazoleandItsMetabolitesResiduesinMilkbyUltraPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

LI Xiao-qiao,OU YANG Wu-li,WU Xuan,WANG Yong-hong

(ChongqingAnimalDiseaseControlCenter,Chongqing401120,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.08

2017-04-04

A

1002-1280 (2017) 09-0043-06

S859.84

李小橋，碩士，獸醫(yī)師，從事獸藥殘留分析研究。E-mail：lixiaoqiao008@163.com