成 楊，劉 振，楊 陽，羅軍武

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心湖南分中心，湖南 長沙 410125）

江華苦茶不同單株間親緣關(guān)系的cpDNA序列分析

成 楊1,2，劉 振2，楊 陽2，羅軍武1*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心湖南分中心，湖南 長沙 410125）

DNA序列分析在物種的系統(tǒng)進化、分類和鑒定等方面展示出了強大的生命力，其中cpDNA序列分析因具有基因組小、進化速率適中、母系遺傳等特點，已被大量用于系統(tǒng)進化研究。本研究采用4對cpDNA引物對收集來的32份江華苦茶資源進行了親緣關(guān)系研究，其中有3對測序成功。擴增序列長度分別為634（1F-724R）、499（rbcla-rev）、532（rbcla-ajf634）。變異位點數(shù)量分別為5（1F-724R）、4（rbcla-rev）、4（rbcla-ajf634）。變異率從高到低分別是rbcla-rev（0.80%）、1F-724R（0.79%）、rbcla-ajf634（0.75%）。將3對引物測序得到的序列拼接，按照MP法構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹，將參試的32份茶樹資源分為4大類。本研究為江華苦茶親緣關(guān)系研究開辟了一條新途徑，為江華苦茶資源的應(yīng)用和保護研究提供理論參考。

江華苦茶 ；cpDNA；DNA序列分析

茶[Camellia sinensis (L.) O.Kuntze]屬于山茶屬（Camellia）茶組（Sect.Thea），為多年生常綠木本植物，起源于我國云南地區(qū)。由于世代異花授粉和人類的選擇性種植，茶樹種質(zhì)資源的變異體繁多，親緣關(guān)系較難確定[1-2]。

江華苦茶作為湖南四大典型地方茶樹資源[3]，茶多酚物質(zhì)含量豐富，具有很高的開發(fā)利用價值[4]。但由于受交通、經(jīng)費等因素的制約，江華苦茶入圃保存的資源量仍非常有限。隨著人類生產(chǎn)活動的不斷擴大，江華苦茶資源的入圃保存已非常必要。但是種質(zhì)資源保護的前提是要了解各單株的遺傳背景，以便以盡可能少的資源量保存最多的遺傳多樣性。

分子生物技術(shù)的發(fā)展為資源親緣關(guān)系研究提供了更加便捷可靠的方法，而DNA序列分析是區(qū)分個體間遺傳差異最直接的方法，可提供基因組特異區(qū)的完全遺傳信息，為植物鑒定、分類等研究提供快捷的方法[5]，并且已經(jīng)在多個植物當中得到了運用[6-8]。作為DNA序列分析的一個部分，cpDNA序列有著相對保守、基因組較小、多拷貝、母系遺傳的特點，使得葉綠體基因組序列被大量用于系統(tǒng)進化研究[9-11]。在茶樹方面也已經(jīng)有了這方面應(yīng)用的報道，陳春梅[12]采用了3對葉綠體DNA序列進行了山茶屬植物的親緣關(guān)系研究。

本研究采用cpDNA序列分析技術(shù)對江華苦茶的不同單株進行比較分析，探討江華苦茶單株間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性水平，以便為江華苦茶這一珍稀資源的保護和選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究共采集到江華苦茶樣品32個，對照為豬婆茶（gene22）。樣品來源及編號見表1。所有樣品均取一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍處理，然后將其保存在-40℃冰箱中備用。

表1 32個參試的樣品來源Table 1 Resource of 32 tested tea samples

1.2 方法

1.2.1 D N A的提取

采用試劑盒（天根生化科技有限公司，型號DP305-02）進行DNA提取，提取方法參照試劑盒說明書。

1.2.2 引物合成

參照高連明等[13]的引物序列，共選用4對cpDNA序列（表2），由天根生化科技有限公司進行引物合成。

1.2.3 P C R擴增體系

擴增程序見表2，擴增體系見表3。PCR擴增在Thermo-5020型PCR儀（Thermo Fisher Scienti fi c. Int’l trade Co., Ltd.）上進行，擴增產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用dnastar軟件進行序列拼接，先剪去序列兩端不可靠的堿基序列和引物序列，然后再將正反兩個引物的序列進行比對，對序列進行編輯后獲得正反引物序列一致的DNA序列。通過MEGA6.0軟件中的ClustalW 功能對所選材料的序列進行比對，適當手工校正，去除邊緣不準確的部分序列，整理以待分析，計算變異堿基數(shù)[14]。采用MP法(most parsimonious tree,MP)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，對分支的可靠性評價使用靴帶值（bootstrap，1000次重復(fù)）分析，自展數(shù)值75% ～ 100%表示強支持率，50% ～ 74%表示弱支持率，小于 50%表示不支持[15]。

表2 4對引物特征Table 2 The characterization of 4 pairs of primer

表3 PCR反應(yīng)程序Table 3 The system of PCR reaction

表4 PCR擴增體系Table 4 The system of PCR ampli fi cation

表5 DNA序列特征Table 5 DNA sequence characteristics

表6 不同引物的變異位點Table 6 Variable sites of different Primers

3 結(jié)果分析

3.1 不同序列的特征與差異

本研究共使用cpDNA序列引物4對，其中3對引物測序成功（1F-724R、rbcla-rev和rbclaajf634），trnH2-psbAF序列雖然獲得了測序結(jié)果，但是由于出現(xiàn)poly結(jié)構(gòu)，正反方向序列比對后多個樣品中存在大量正反方向序列不一致的位點。同時該引物在之前的實驗當中，出現(xiàn)了測序失敗的情況，因此綜合判斷下，最后放棄這一引物，僅采用其他3對引物進行數(shù)據(jù)分析。測序成功的3對引物（表5），擴增序列長度分別為634（1F-724R）、499（rbcla-rev）、532（rbcla-ajf634）。變異位點數(shù)量分別為5（1F-724R）、4（rbcla-rev）、4（rbcla-ajf634）。變異率從高到低分別是rbcla-rev（0.80%）、1F-724R（0.79%）、rbcla-ajf634（0.75%）。

3.2 參試材料的親緣關(guān)系

按照表5從1到3的引物順序?qū)y序所得到的3個序列拼接。采用MEGA 6.0軟件按照MP法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹（圖1），將參試的32個樣品分成4個大類。類群1包括7個樣品，自展值達到97%，該類群與另外三個類群相互之間親緣關(guān)系較遠，而與外類群豬婆茶（gene22）靠的比較近。類群2為最大的類群，共有13個樣品聚集在一起，自展值達到了88%。其中包括了從湖南省茶葉研究所茶樹種質(zhì)資源圃采集5個樣品中的4個（gene23、gene 24、gene 25、gene 26）。類群3只有g(shù)ene 2和gene 14兩個樣品，數(shù)量最少，自展值達到了96%。最后的類群4則由10個樣品組成，包括采集自江華縣碼市鎮(zhèn)的6個樣品當中的5個（gene28、gene 29、gene 30、gene 32、gene 33），自展值達到83%。

圖1 基于3個序列和最大簡約法（MP）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 （圖中數(shù)字表示抽樣檢驗的自展百分比）Fig. 1 A phylogenetic tree constructed by maximum parsimony method with 3 sequences （The numbers in the fi gure indicate percentage of sampling inspection）

4 討論

本研究共采用4個cpDNA序列，其中有3個獲得可用條帶，DNA堿基變異率的平均值為0.78%，小于本實驗室前期在16份不同茶樹變種間的變異率（4.25%，試驗數(shù)據(jù)未發(fā)表）。這一方面說明群體資源的遺傳多樣性要遠小于不同變種間的遺傳多樣性，本研究采用的試驗材料全部是江華苦茶的群體單株，而之前研究中采用的是茶組植物的不同變種材料，另一方面也說明cpDNA變異率對于種間和種內(nèi)的樣品辨識度相當明顯。同時，本研究中使用的trnH-psbA序列雖然沒有采用進行結(jié)果分析，但是與陳春梅的實驗[12]以及之前實驗結(jié)果類似，序列當中有著較高的堿基變異率，在之后的研究中可以更多的關(guān)注trnH-psbA區(qū)域。

采自湖南省茶葉研究所茶樹資源圃的5個品種中，除了苦茶3號（gene27）外，其余4個品種都聚在一個類群中，其中有兩個是選育品種（gene23的瀟湘紅21-3和gene26的未命名品種），該類群可能是將來選育品種的重點考慮對象。同時，來自江華縣碼市鎮(zhèn)的6個樣品當中，有4個來自同一村莊的樣品聚集在一起，親緣關(guān)系表現(xiàn)出非常強烈的地域性。因此，在江華苦茶資源入圃保護時，應(yīng)重點考慮同一區(qū)域資源親緣關(guān)系相似度高的特點，盡量選擇親緣關(guān)系較遠的單株。

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Analysis of cpDNA Sequence of Kinship among Different Strains of Jianghua Kucha

CHENG Yang1,2，LIU Zhen2，YANG Yang2，LUO Jun-wu1*

（1. College of Horticulture and Landscape Architecture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Tea Improvement Center Hunan sub – center, Tea Research Institute of Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China）

DNA sequence analysis has shown a strong vitality in the phylogenetic evolution, classification and identi fi cation of species. The cpDNA sequence analysis has been widely used in phylogenetic studies because of its small genome, moderate evolution rate and maternal inheritance. In this study, four pairs of cpDNA primers were used to study the genetic relationship among 32 Jianghua Kucha resources. Three of them were successfully sequenced. Ampli fi cation sequence length was 634 (1F-724R), 499 (rbcla-rev), 532 (rbcla-ajf634), respectively. The number of mutations was 5(1F-724R), 4 (rbcla-rev), 4 (rbcla-ajf634), respectively. The variance rates were rbcla-rev (0.80%), 1F-724R (0.79%), rbclaajf634 (0.75%), respectively, from high to low. The sequences of the three pairs of primers were staged, and the molecular system trees were constructed according to the MP method. The 32 tea trees were divided into four groups. This study has opened up a new way for the research on the genetic relationship of Jianghua Kucha, which provides a theoretical reference for the application and protection of bitter tea resources in Jianghua.

Jianghua Kucha，cpDNA，Analysis of DNA sequence

S571.1，R282.5

A

1009-525X（2017）03-22-26

2017-07-31

2017-08-12

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-23）、湖南省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目（2017JC15）

成楊（1985-），男，江蘇如皋人，助理研究員，在讀碩士研究生，研究方向：茶樹分子育種。

*通訊作者：羅軍武（1957-），男，湖南邵陽人，教授，主要從事茶樹種質(zhì)資源與育種、茶樹栽培生理方面的研究與教學。E-mail：luojunwu11@sina.com