張海燕　張小芳　魏蘭芳

摘要：根據(jù)茄科雷爾氏菌eg1基因，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立并優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，并對(duì)土壤中的茄科雷爾氏菌進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估。對(duì)采自云南省文山州5個(gè)縣的100份青枯病帶菌土壤進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，100份土壤樣品中，廣南縣15、22、24號(hào)，丘北縣31、35、43號(hào)，麻栗坡縣62、67、68號(hào)，馬關(guān)縣70、74、78、79、80、83、84號(hào)，共16份土壤樣品中茄科雷爾氏菌含量大于105 CFU/mL，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高；廣南縣12、20、21、23、26、27、29號(hào)，丘北縣30、33、34、37、38、39、46、48號(hào)，麻栗坡縣50、52、54、58、59、60、61、63、64、65、66、69號(hào)，馬關(guān)縣71、72、73、75、76、77、81、82、85、86號(hào)，硯山縣1、2、4、5、7、9號(hào)，共43份土壤樣品檢測(cè)出的茄科雷爾氏菌含量在104～105 CFU/mL之間，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中等；其他土壤樣品檢測(cè)出的茄科雷爾氏菌含量均小于103 CFU/mL，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低，其中硯山縣3、10、87、88、89、90號(hào)，廣南縣14、19、25、28、91、92、93號(hào)，丘北縣32、36、44、49、94、95、96號(hào)，麻栗坡縣51、57、97、98、99、100號(hào)，共26份土壤樣品中未檢測(cè)出茄科雷爾氏菌。

關(guān)鍵詞：茄科雷爾氏菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；快速檢測(cè)體系；細(xì)菌性青枯病

中圖分類號(hào)： S432.4+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0017-03

茄科雷爾氏菌[Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi et al.]是世界上最重要的植物病原細(xì)菌之一，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。該病原細(xì)菌的寄主范圍較廣，可侵染55科數(shù)百種植物[1]。在我國(guó)，已報(bào)道有番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、煙草、花生、生姜、沙姜、桑、蕹菜、桉樹等10余種作物受到該病原細(xì)菌的危害，造成細(xì)菌性青枯病。該病原菌主要在土壤中及遺落土中的病株殘?bào)w上越冬，通過(guò)根部﹑葉柄或莖部的傷口侵入后，在維管束內(nèi)繁殖，并沿維管束向上發(fā)展，以致維管束阻塞，腐爛變褐，莖、葉因得不到水分、養(yǎng)分的供應(yīng)而萎蔫[2]。調(diào)查研究表明，由該病原菌造成的煙草青枯病極為嚴(yán)重，給我國(guó)西南地區(qū)及長(zhǎng)江下游流域的煙草生產(chǎn)帶來(lái)了很大威脅[3]。其中個(gè)別年份煙草青草枯病暴發(fā)流行，發(fā)病重的地塊，產(chǎn)量損失達(dá) 80%左右，造成毀滅性損失[4]。此外，受該病原菌感染的番茄、茄子、辣椒等茄科作物的產(chǎn)量會(huì)大幅減少，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-7]。因此，對(duì)溫室或大田可能存在的病菌進(jìn)行早期檢測(cè)，對(duì)于適時(shí)控制病害的發(fā)生有著極為重要的意義。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在植物病害研究上也不斷深入并廣泛在多種病原菌定量檢測(cè)中應(yīng)用，極大地提高了植物病害的檢測(cè)效率[8-11]。Nicholson等利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)建立了小麥莖基部病原物的定量檢測(cè)方法[12]；潘娟娟等利用 RT-PCR 技術(shù)建立了定量檢測(cè)小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）潛伏侵染的方法，對(duì)小麥條銹病進(jìn)行早期檢測(cè)，指導(dǎo)病害的預(yù)測(cè)[13-14]。目前，國(guó)內(nèi)外未有利用該方法對(duì)茄科雷爾氏菌進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道，本研究擬查閱文獻(xiàn)并分析茄科雷爾氏菌基因序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)相關(guān)的熒光定量PCR的特異性引物，并應(yīng)用建立的方法對(duì)采自云南省各個(gè)地區(qū)土壤中的病原菌進(jìn)行早期檢測(cè)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）標(biāo)準(zhǔn)菌株Y45，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)煙草研究院提供；軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum）MY9，由筆者實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（BioTeke），購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；土壤DNA提取試劑盒（美國(guó)MO BIO），購(gòu)自北京寶杰羅生物科技有限公司；PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）試劑盒，購(gòu)自寶生物工程 （大連） 有限公司；熒光定量PCR儀器（BIO-Rad IQTM5），由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物多樣性國(guó)家工程中心提供。

云南省文山州5個(gè)縣（廣南縣、丘北縣、麻栗坡縣、馬關(guān)縣、硯山縣）的100份土壤樣品，由云南省文山州煙草公司協(xié)助采集。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1茄科雷爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取與檢測(cè)使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（BioTeke）提取茄科雷爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Y45的DNA，于微量分光光度計(jì)下檢測(cè)DNA濃度及D260 nm/D280 nm值，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2土壤DNA提取與檢測(cè)使用土壤DNA提取試劑盒（美國(guó)MO BIO）進(jìn)行土壤中煙草青枯病病菌基因組DNA的提取，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書。提取結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查。Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)土壤總DNA濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成使用PrimerPremier 5.0，根據(jù)GenBank中茄科雷爾氏菌eg1基因部分序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物 RS-1：5′-GTGCCTGCCTCCAAAACGACT-3′；RS-2：5′-GACGCCACCCGCATCCCTC-3′，PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.4引物特異性檢測(cè)以茄科雷爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Y45的DNA為模板，標(biāo)準(zhǔn)菌株Y45的基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，軟腐果膠桿菌MY9的DNA為陰性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照，應(yīng)用引物RS-1、RS-2進(jìn)行普通PCR 和RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物特異性。endprint

茄科雷爾氏菌普通PCR反應(yīng)體系：2.5 μL Buffer，2.0 μL dNTP Mix，引物RS-1、RS-2各0.5 μL，1.0 μL Taq Enzyme，25 μL DNA模板，ddH2O補(bǔ)足25.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，凝膠成像系統(tǒng)分析試驗(yàn)結(jié)果。

茄科雷爾氏菌RT-PCR反應(yīng)體系：引物RS-1、RS-2各0.5 μL，12.5 μL SYBR Premix Ex Taq，2.0 μL DNA模板，ddH2O補(bǔ)足20.0 μL。

1.2.5RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及引物靈敏度檢測(cè)取茄科雷爾氏菌Y45的DNA，并將DNA進(jìn)行梯度稀釋，即取 10 μL DNA加入到90 μL ddH2O中，把DNA的濃度稀釋成10-1，并依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，以ddH2O為空白對(duì)照，RT-PCR反應(yīng)體系參照“1.2.4”節(jié)中青枯病菌 RT-PCR的反應(yīng)體系。

1.2.6土壤樣品中茄科雷爾氏菌的熒光定量PCR檢測(cè)反應(yīng)體系參照“1.2.4”節(jié)中青枯病菌RT-PCR的反應(yīng)體系。

2結(jié)果與分析

2.1引物特異性檢測(cè)結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的引物 RS-1、RS-2 對(duì)茄科雷爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Y45的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）表明，僅茄科雷爾氏菌Y45菌株基因組DNA能擴(kuò)增出290 bp的特異性條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物具有特異性，能夠區(qū)別于其他病原菌。

2.2土壤樣品中青枯病菌的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，100份土壤樣品中，廣南縣15、22、24號(hào)，丘北縣31、35、43號(hào)，麻栗坡縣62、67、68號(hào)，馬關(guān)縣70、74、78、79、80、83、84號(hào)，共16份土壤樣品中檢測(cè)到的茄科雷爾氏菌含量較高（大于105 CFU/mL），預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較[CM（25]高；廣南縣12、20、21、23、26、27、29號(hào)，丘北縣30、33、34、37、38、39、46、48號(hào)，麻栗坡縣50、52、54、58、59、60、61、63、64、65、66、69號(hào)，馬關(guān)縣71、72、73、75、76、77、81、82、85、86號(hào)，硯山縣1、2、4、5、7、9號(hào)，共43份土壤樣品中檢測(cè)出的茄科雷爾氏菌含量在104～105 CFU/mL之間，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中等；其他土壤樣品檢測(cè)出的茄科雷爾氏菌含量均小于103 CFU/mL，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低，其中硯山縣3、10、87、88、89、90號(hào)，廣南縣14、19、25、28、91、92、93號(hào)，丘北縣32、36、44、49、94、95、96號(hào)，麻栗坡縣51、57、97、98、99、100號(hào)，共26份土壤樣品中未檢測(cè)出茄科雷爾氏菌。

3討論

茄科雷爾氏菌（R. solanacearum）是一種危害嚴(yán)重的土傳病害病原菌，具有非常廣泛的宿主范圍，在世界各地均有分布[15]，其中以茄科中的寄主種類最多，茄科雷爾氏菌可以引起茄科作物上重要的細(xì)菌性病害，在嚴(yán)重發(fā)生的年份甚至造成絕收[16]。因此，在發(fā)病前快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)田間土壤中茄科雷爾氏菌的數(shù)量和動(dòng)態(tài)變化規(guī)則能為該病的測(cè)報(bào)、防治策略或防控措施的制定和應(yīng)用，以及品種田間抗性評(píng)價(jià)提供重要的科學(xué)依據(jù)[17]。

傳統(tǒng)的茄科雷爾氏菌檢測(cè)方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、靈敏度不高等缺點(diǎn)，不能較好地滿足檢測(cè)工作的要求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可高通量定量檢測(cè)土壤中病原菌數(shù)量，可提前對(duì)煙草等茄科細(xì)菌性青枯病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，已經(jīng)廣泛運(yùn)用于多種土傳病原菌的快速檢測(cè)研究領(lǐng)域中[18]。本研究中建立的茄科雷爾氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)體系，為該病原菌的快速檢測(cè)提供了新的方法，且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)作物病害發(fā)生發(fā)展過(guò)程中病原菌的動(dòng)態(tài)變化，為病原菌的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及病害防控奠定了基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR建立了茄科雷爾氏菌的快速檢測(cè)技術(shù)體系，并用該方法對(duì)來(lái)自云南省文山州5個(gè)縣的100份土壤樣品進(jìn)行了檢測(cè)，16份土壤中茄科雷爾氏菌總數(shù)均大于105 CFU/mL，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高；43份土壤樣品檢測(cè)出的茄科雷爾氏菌含量在104～105 CFU/mL之間，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中等；15份土壤樣品檢測(cè)出的茄科雷爾氏菌含量均小于103 CFU/mL，預(yù)測(cè)細(xì)菌性青枯病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低；其余26份土壤樣品中未檢測(cè)出茄科雷爾氏菌。

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