孫燕（山東省濰坊市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 261000）

一例疑似雞傳染性支氣管炎診斷

孫燕（山東省濰坊市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 261000）

濰坊市某養(yǎng)禽場送檢了一批臨床疑似傳染性支氣管炎的病雞樣品，臨床表現(xiàn)為拉稀、消瘦、采食量下降，剖檢發(fā)現(xiàn)腎臟腫大，花斑腎等癥狀。采集氣管、肺臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，通過熒光PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，確診為雞傳染性支氣管炎。

雞；傳染性支氣管炎；熒光RT-PCR；診斷

雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis，IB）是一種急性、高度接觸傳染性疫病，主要引起雞呼吸道、消化道以及生殖道疫病，是長期困擾養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一，臨床表現(xiàn)為氣管啰音、咳嗽和打噴嚏，未免疫或免疫抗體低下的雞容易引起呼吸道或腎臟的感染而引起死亡，尤其是近幾年來，不斷有養(yǎng)雞場出現(xiàn)類似病例。

筆者接到一起臨床疑似雞傳染性支氣管炎的病例，養(yǎng)殖場近20000只雞，25d左右出現(xiàn)輕微呼吸道癥狀，28d拉糞料和稀糞，30d左右開始出現(xiàn)病死雞，每天死亡50只左右，剖檢，有典型的花斑腎癥狀。

1 材料和方法

1.1 樣品

采集病死雞的氣管、腎臟樣品5份。

1.2 試劑

病毒RNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司提供；雞傳染性支氣管炎病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，北京生科尚儀科技有限公司提供；新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，凱杰生物工程（深圳）有限公司提供。

1.3 設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)SIGMA3K-15，Roche Lightcycler 480熒光定量PCR儀。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

取病死雞的氣管、腎臟樣品，研磨，用pH7.2PBS液配制成體積比1∶5的混懸液，凍融3次，8000rpm離心5min，取上清備用。

1.4.2 核酸提取

取1.5ml離心管，加入離心好的上清140μl，加入裂解液560μl，震蕩混勻，室溫孵育10min，加入560μl無水乙醇，蓋上離心管蓋，震蕩混勻；吸取630μl液體轉(zhuǎn)移至吸附柱中，蓋上蓋子，8000rpm離心1min，棄去廢液，將吸附柱放回到收集管中，將離心管中剩余液體按此步驟離心，棄去廢液；加入吸附柱中500μl溶液GD，8000rpm離心1min，棄去廢液，將吸附柱放回收集管；加入500μl溶液RW，8000rpm離心1min，棄去廢液，重復(fù)此步驟1次；將吸附柱放回到收集管，12000rpm離心3min，使吸附膜完全干燥，棄去廢液，將吸附柱轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5mlEP管中，向膜中央加入60μl RNase-Free ddH2O，蓋上蓋子，室溫5min，8000rpm離心1min，棄去吸附柱，得到病毒RNA，備用。

1.4.3 熒光RT-PCR

取0.1ml PCR八連管，每一個(gè)管中加入15μl RT-PCR反應(yīng)液，0.25μl RT-PCR酶，0.25μl Taq酶，然后加入10μl病毒RNA，同時(shí)作陰性、陽性對(duì)照。將加好反應(yīng)液的PCR管放入熒光定量PCR儀中，進(jìn)行反應(yīng)：42℃30min，92℃3min，5個(gè)循環(huán)： 92℃10sec，45℃30sec，72℃1min，40個(gè)循環(huán)：92℃10sec，60℃30sec。最后一步收集熒光，熒光信號(hào)收集設(shè)定為Fam熒光素。

2 結(jié)果

通過熒光RT-PCR檢測(cè)，送檢的5份樣品，禽流感、新城疫病毒均沒有Cp值，判定為陰性，雞傳染性支氣管炎病毒，Cp值在17.91～25.90之間參見附表，判定為陽性。

附表 試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

通過流行病學(xué)調(diào)查分析、剖檢、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確診引起該養(yǎng)禽場發(fā)病的主要病因?yàn)殡u傳染性支氣管炎。

結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)以及養(yǎng)殖場的現(xiàn)狀，提出了防治措施：（1）加強(qiáng)養(yǎng)殖場的生物安全管理，防止疫病傳入；（2）加強(qiáng)雞群免疫，采用雞傳染性支氣管炎病毒疫苗進(jìn)行免疫，增強(qiáng)雞群特異性免疫力；（3）加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)免疫抗體及病原檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)補(bǔ)免。

孫燕（1973年-），山東省昌樂縣人，主要從事動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)工作。