梁志白，趙楓

（中國人民解放軍第180醫(yī)院 骨二科，福建 泉州 362000）

脂聯(lián)素抑制人髓核細(xì)胞分泌疼痛介質(zhì)PGE2的初步機(jī)制研究

梁志白，趙楓

（中國人民解放軍第180醫(yī)院 骨二科，福建 泉州 362000）

目的驗(yàn)證脂聯(lián)素在椎間盤源性腰痛患者中可能發(fā)揮的抗炎作用，并初步研究其機(jī)制。方法首先檢測髓核組織內(nèi)脂聯(lián)素受體表達(dá)水平；隨后提取并培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，檢測炎癥因子TNF-α對髓核細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素受體調(diào)控；最后采用慢病毒基因沉默的手段檢測脂聯(lián)素抑制炎癥因子誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生PGE-2的作用及機(jī)制。結(jié)果椎間盤源性腰痛患者髓核組織內(nèi)脂聯(lián)素受體Adipo R1/2表達(dá)水平低于正常髓核組織（P＜0.05），炎癥介質(zhì)TNF-α能抑制脂聯(lián)素受體AdipoR1/2的表達(dá)（P＜0.05）。當(dāng)脂聯(lián)素處理髓核細(xì)胞后，TNF-α對PGE-2分泌的誘導(dǎo)受抑并且呈濃度劑量依賴效應(yīng)（P＜0.05）；髓核細(xì)胞過表達(dá)Adipo R1/R2后，均能抑制炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生PGE-2，其中以Adipo R2為明顯（P＜0.05）。結(jié)論脂聯(lián)素能夠通過兩個(gè)受體Adipo R1、Adipo R2抑制抑制髓核細(xì)胞合成分泌疼痛介質(zhì)PGE-2，提示脂聯(lián)素可能為一個(gè)保護(hù)性因子在椎間盤源性腰痛環(huán)境中發(fā)揮抗炎作用。

椎間盤源性腰痛；脂聯(lián)素；炎癥反應(yīng)；PGE-2

Abstract:ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory effects of adiponectin in patients with discogenic back pain and the potential mechanism.MethodsThe expression of adiponectin receptor Adipo R1/2 in human nucleus pulposus (NP)tissue was examined.Human NP cells were isolated for further culture.The regulatory effect of TNF-α on adiponectin receptors in NP cells was detected.Moreover,lentiviral gene silencing technology was utilized to investigate the inhibitory effect of adiponectin on TNF-α-induced production of PGE-2 and underlying mechanism.ResultsThe expression of Adipo R1/2 was significantly decreased in NP tissues derived from patients with discogenic back pain compared with normal NP tissues(P＜0.05).TNF-α inhibited the expression of Adipo R1/2,and up-regulated the secretion of PGE2 in NP cells,which was attenuated by adiponectin dose-dependently (P＜0.05).Over-expression of Adipo R1/2 abolished the TNF-α-induced PGE2 production (P＜0.05).ConclusionsAdiponectin is potentially a protective mediator in patients with discogenic back pain through AdipoR1/2-dependent inhibition of secretion of PGE2.

Keywords: discogenic back pain;adiponectin;inflammation;PGE2

椎間盤源性疼痛是指椎間盤退變、椎間盤內(nèi)部結(jié)構(gòu)與功能紊亂刺激神經(jīng)末梢疼痛感受器引發(fā)的疼痛，同時(shí)排除神經(jīng)機(jī)械壓迫引發(fā)的腰腿痛[1]。后續(xù)研究證實(shí)盤源性疼痛與椎間盤內(nèi)疼痛介質(zhì)密切相關(guān)，如一氧化二氮（nitrous oxide，N2O）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、環(huán)加氧酶（cyclooxygenase 2，Cox2）或磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）[2]，能刺激長入的末梢神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)誘發(fā)椎間盤源性腰痛。

脂聯(lián)素（adiponectin，Apn）是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素蛋白，多項(xiàng)研究證實(shí)Apn具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等功用[3]。Apn可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞分泌促炎因子拮抗劑，對抗炎癥刺激、延緩炎癥反應(yīng)進(jìn)程[4]。椎間盤源性腰痛患者髓核組織存在廣泛炎癥級聯(lián)反應(yīng)內(nèi)環(huán)境，Apn能否調(diào)節(jié)椎間盤內(nèi)炎癥惡性循環(huán)尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過體外培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，檢測Apn在人髓核細(xì)胞中的抗炎作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 髓核組織獲取及細(xì)胞培養(yǎng)

正常椎間盤組織取自因腰椎爆裂性骨折行椎間盤摘除骨折復(fù)位內(nèi)固定者，盤源性腰痛椎間盤組織取自于因盤源性腰痛行椎間盤摘除者，置入-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。人髓核?xì)胞購自無錫英紐瑞生物醫(yī)藥科技有限公司（貨號INV-HN0094），培養(yǎng)方法依照RISBUD等[5]文獻(xiàn)報(bào)道。細(xì)胞傳代至3～5代用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試劑耗材

人全長 Apn（Catalog no.1065-AP；R&D 公司），MEM 培養(yǎng)基（Gibco公司），Adipo R1、Adipo R2抗體（ab189446 44 kDa，ab126611 43 kDa，Abacm 公司），β-Tubulin Antibody抗體（#2146，CST公司），前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒（Catalog no.ADI-900-001；Enzo Life公司），慢病毒 LV-sh Adipo R1和LV-sh Adipo R2（購自百恩維生物）。

1.3 細(xì)胞處理

培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，使用腫瘤壞死因子α（TNF-α）（0、12.5 及 25μg/ml）處理髓核細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 Adipo R1、Adipo R2的表達(dá)情況以明確炎癥因子對脂聯(lián)素受體的調(diào)控。隨后采用 TNF-α（25 μg/ml）處理髓核細(xì)胞，于 0、12及 24 h收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測 Adipo R1、Adipo R2的表達(dá)以確定炎癥因子對脂聯(lián)素受體調(diào)控的時(shí)間曲線。

離體培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，首先使用不同濃度Apn聯(lián)合 TNF-α 處理細(xì)胞，分為 4組：Ctr、TNF-α（25 μg/ml）、TNF-α（25 μg/ml）+Apn（1 μg/ml）和TNF-α（25 μg/ml）+Apn（5 μg/ml），24 h 后收細(xì)胞上清液，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測PGE-2濃度。

為進(jìn)一步明確脂聯(lián)素受體在Apn抑制髓核細(xì)胞產(chǎn)生PGE-2、PLA2中的作用，構(gòu)建慢病毒Adipo R1、Adipo R2過表達(dá)載體Lenti-Adipo R1/R2。采用qRT-PCR方法檢測髓核細(xì)胞中Adipo R1、Adipo R2的過表達(dá)情況以確保Adipo R1、Adipo R2表達(dá)率升高2倍以上；檢測人髓核細(xì)胞中Adipo R1、Adipo R2過表達(dá)后，TNF-α對PGE-2的誘導(dǎo)情況：病毒轉(zhuǎn)染人髓核細(xì)胞5 d后加入TNF-α誘導(dǎo)，24 h后收集細(xì)胞上清液，ELISA檢測PGE-2濃度。

1.4 Western blot檢測

微量二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白樣本、配置10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，PVDF膜將分離后蛋白轉(zhuǎn)印紙膜上，3%BSA室溫封閉1 h，PGE-2（1∶2 000）一抗4℃搖床孵育過夜，室溫二抗孵育1 h，ECL發(fā)光液孵育并曝光。

附表 qRT-PCR引物序列

1.5 qRT-PCR

依據(jù)說明書將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYSB Green（TaKaRa公司）試劑進(jìn)行擴(kuò)增，ABI 7500檢測，內(nèi)參采用β-actin。每樣本設(shè)立3副孔、每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見附表。

1.6 ELISA

依據(jù)說明書將人髓核細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24孔板，分別給予不同分組刺激后，移除上清液并無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗，37℃孵育30 min后收集上清，嚴(yán)格按照ELISA說明書檢測上清液中PGE2的含量，所測濃度以ng/ml表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 盤源性疼痛患者血清中脂聯(lián)素受體水平

髓核組織內(nèi)存在脂聯(lián)素受體Adipo R1/R2 mRNA，盤源性腰痛患者髓核組織內(nèi)脂聯(lián)素受體Adipo R1/2表達(dá)水平降低，以Adipo R2降低明顯。Western blot顯示類似結(jié)果。見圖1。

圖1 髓核組織內(nèi)脂聯(lián)素受體表達(dá)水平

2.2 炎癥因子對髓核細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素受體的調(diào)控作用

人髓核細(xì)胞經(jīng)不同濃度TNF-α處理后，脂聯(lián)素受體Adipo R1/R2 mRNA表達(dá)降低，并于25 μg/ml時(shí)達(dá)到低谷；時(shí)間曲線顯示25μg/ml TNF-α能抑制人髓核細(xì)胞內(nèi)Adipo R1/R2 mRNA表達(dá)，并與24 h達(dá)到最低值。Western blot結(jié)果顯示脂聯(lián)素能抑制人髓核細(xì)胞內(nèi)Adipo R1/R2蛋白表達(dá)，并于24 h達(dá)到低谷。見圖2。

圖2 炎癥因子對髓核細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素受體調(diào)控

2.3 Apn對髓核細(xì)胞內(nèi)炎癥因子誘導(dǎo)PGE2分泌的影響

人髓核細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后，PGE2含量升高，當(dāng)加入Apn后，TNF-α對PGE2分泌的誘導(dǎo)則受抑制并且呈濃度依賴效應(yīng)（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Apn對髓核細(xì)胞內(nèi)炎癥因子誘導(dǎo)PGE-2分泌的影響

2.4 Apn對髓核細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素受體表達(dá)的影響

Apn能促進(jìn)髓核組織內(nèi)存在脂聯(lián)素受體Adipo R1/R2 mRNA表達(dá)。見圖4。

圖4 Apn對髓核細(xì)胞Adipo R1/R2 mRNA表達(dá)的影響

2.5 髓核細(xì)胞內(nèi)Adipo R1/R2表達(dá)情況及對炎癥因子PGE-2分泌的影響

髓核細(xì)胞感染Lenti-Adipo R1/R2過表達(dá)病毒后，髓核細(xì)胞內(nèi)Adipo R1/R2表達(dá)升高，均超過2倍以上。見圖5A～E。

應(yīng)用慢病毒技術(shù)過表達(dá)髓核細(xì)胞內(nèi)Adipo R1/R2后，再給予TNF-α刺激髓核細(xì)胞，均能抑制炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生PGE2，其中以Adipo R2明顯。見圖5F。

圖5 Apn抑制炎癥因子誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生PGE2

3 討論

CROCK等[1]率先提出椎間盤結(jié)構(gòu)與功能紊亂刺激椎間盤疼痛感受器為椎間盤源性腰痛的發(fā)病機(jī)制。隨著椎間盤退變進(jìn)展，纖維環(huán)由內(nèi)至外逐漸撕裂、微小血管和末梢神經(jīng)沿破裂纖維環(huán)長入椎間盤，同時(shí)髓核內(nèi)產(chǎn)生的炎癥因子滲漏至相鄰硬膜外結(jié)構(gòu)、硬脊膜、脊神經(jīng)節(jié)的背根神經(jīng)，炎癥因子刺激長入末梢神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)誘發(fā)椎間盤源性腰痛。目前研究證實(shí)，IL-1β、TNF-α 及磷脂酶 A2（PLA2）是與神經(jīng)根性病變相關(guān)的重要促炎因子[7]，其能刺激細(xì)胞產(chǎn)生疼痛介質(zhì)PGE2誘發(fā)疼痛，抑制IL-1β、TNF-α和PLA2的活性可以降低硬膜外炎癥反應(yīng)、緩解疼痛[8]。

脂聯(lián)素（Adiponectin，Apn）是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素蛋白，多項(xiàng)研究證實(shí)，Apn具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等功用[3，9]。既往研究顯示，Apn在骨關(guān)節(jié)炎中既存在促炎和抗炎雙重作用。Apn誘導(dǎo)COX-2和膜結(jié)合型前列腺素E合成酶-1的表達(dá)，導(dǎo)致PGE2合成分泌增加、刺激疼痛[10]。然而亦有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Apn能緩解DBA/1小鼠的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型中骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，同時(shí)可以減少關(guān)節(jié)中IL-1β、TNF-α和MMP-3的表達(dá)[11]。髓核細(xì)胞屬于軟骨樣細(xì)胞，與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有相似的細(xì)胞行為學(xué)。

本研究著重于檢測Apn在椎間盤源性腰痛患者中可能發(fā)揮的抗炎作用，結(jié)果顯示盤源性腰痛患者髓核組織內(nèi)脂聯(lián)素受體Adipo R1/2表達(dá)水平降低；為進(jìn)一步研究是否椎間盤源性腰痛患者椎間盤內(nèi)炎性環(huán)境誘導(dǎo)的Adipo R1/2表達(dá)差異，本研究采用炎癥因子TNF-α處理髓核細(xì)胞，結(jié)果顯示炎癥介質(zhì)TNF-α能抑制Apn受體Adipo R1/2的表達(dá)，鑒于TNF-α亦是椎間盤退變的細(xì)胞模型誘導(dǎo)劑，本結(jié)果與既往研究類似[12]。TERASHIMA等[12]發(fā)現(xiàn)，隨著椎間盤退變進(jìn)展AdipoR1/2表達(dá)呈下降趨勢，此外Apn能抑制IL-1β對髓核/纖維環(huán)細(xì)胞合成分泌炎癥因子TNF-α的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明Apn參與椎間盤內(nèi)炎癥抑制作用。

鑒于椎間盤源性腰痛患者髓核細(xì)胞分泌大量疼痛介質(zhì)如PGE2等，為檢測Apn是否能抑制髓核細(xì)胞合成分泌疼痛介質(zhì)，采用Apn處理髓核細(xì)胞，結(jié)果顯示Apn能抑制TNF-α誘導(dǎo)髓核細(xì)胞分泌PGE2、并且呈濃度劑量依賴效應(yīng)。進(jìn)一步構(gòu)建慢病毒Adipo R1、Adipo R2過表達(dá)載體；發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞過表達(dá)Adipo R1/R2后，均能抑制TNF-α對髓核細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，Adipo R1、Adipo R2均參與抑制髓核細(xì)胞合成分泌疼痛介質(zhì)PGE2，Apn在椎間盤源性腰痛環(huán)境中發(fā)揮抗炎、抗應(yīng)激的功能。

綜上所述，本研究通過慢病毒基因沉默等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Apn能夠通過2個(gè)受體Adipo R1及Adipo R2抑制抑制髓核細(xì)胞合成分泌疼痛介質(zhì)PGE-2，提示Apn可能作為一個(gè)保護(hù)性因子在椎間盤源性腰痛環(huán)境中發(fā)揮抗炎、抗應(yīng)激。因此，可考慮Apn治療椎間盤源性腰痛，接下來可以進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述作用及相關(guān)機(jī)制。

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Inhibitory effect of adiponectin on secretion of PGE2 in human nucleus pulposus cells

Zhi-bai Liang,Feng Zhao
(Department of Orthopeadic Surgery,the 180th Hospital of PLA,Quanzhou,Fujian 362000,China)

R274.34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.007

1005-8982（2017）21-0037-06

2017-03-13