白偉良，宋巖，王梟維，李婷，項(xiàng)清華，周倩，李進(jìn)興

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽(yáng) 110004）

鼻息肉的全基因表達(dá)譜

白偉良，宋巖，王梟維，李婷，項(xiàng)清華，周倩，李進(jìn)興

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽(yáng) 110004）

目的研究鼻息肉的全基因表達(dá)譜情況，探尋其與正常鼻腔黏膜的基因表達(dá)差異。方法提取鼻息肉中的RNA，將RNA合成雙鏈的cDNA，將標(biāo)記的cDNA在Roche NimbleGen基因芯片上進(jìn)行雜交。應(yīng)用Axon GenePix 4000B scanner進(jìn)行掃描，應(yīng)用NimbleScan軟件進(jìn)行圖像分析，探針及基因水平標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果與正常鼻腔黏膜相比，鼻息肉中有1 000個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，占2.22% （1 000/45 033），有1 123個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，占2.49%（1 123/45 033）。經(jīng)過(guò)信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)在核糖體、蛋白酶體、檸檬酸循環(huán)、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、慢性髓樣白血病、谷胱甘肽代謝等信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，在嗅覺(jué)傳導(dǎo)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞色素P450的化合物代謝、細(xì)胞色素P450的藥物代謝、抗原加工和呈遞、瘧疾、移植物抗宿主疾病、視黃醇代謝、亞油酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換等信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)論鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展與多個(gè)基因及信號(hào)通路的表達(dá)升高或降低有關(guān)，鼻息肉全基因表達(dá)譜的研究為探求鼻息肉的發(fā)生機(jī)制

提供了有益的線索。

鼻息肉； 基因芯片； 基因表達(dá)； 信號(hào)通路

Abstract ObjectiveTo analyze the gene expression profiles of nasal polyp and gene expression differences between the nasal polyp and normal nasal mucosa.MethodsTotal RNA from nasal polyp tissues was purified and synthesized into double-stranded cDNA.The cDNA was labeled and hybridized in a NimbleGen hybridization chamber. The slides were scanned using the Axon GenePix 4000B microarray scanner. Scanned images were analyzed using NimbleScan software. The probes and gene levels were standardized and calculated.ResultsCompared with normal nasal mucosa tissues，expression of 2.22% （1 000/45 033） of genes was up-regulated in all cases of nasal polyp tissues，while 2.49% （1 123/45 033） of genes were down-regulated in all cases of nasal polyp tissues. We found genes related to the ribosome，proteasome，citrate cycle （TCA cycle），bladder cancer，non-small cell lung cancer，glioma，endometrial cancer，protein processing in the endoplasmic reticulum，chronic myeloid leukemia，and glutathione metabolism were up-regulated.Genes related to olfactory transduction，natural killer cell-mediated cytotoxicity，metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，drug metabolism-cytochrome P450，antigen processing and presentation，malaria，graft-versus-host disease，retinol metabolism，linoleic acid metabolism，and pentose and glucuronate interconversions were down-regulated.ConclusionMultiple genes or pathways may be involved in the occurrence and development of nasal polyp. Gene expression profiling provides insight into the mechanism of nasal polyp development.

Keywordsnasal polyp； gene chip； gene expression； signaling pathway

鼻息肉本質(zhì)上是一種炎癥疾病，是一個(gè)多步驟、多因素、序貫的復(fù)雜過(guò)程，目前已發(fā)現(xiàn)涉及到多種基因及產(chǎn)物的改變，多種信號(hào)通路相互調(diào)節(jié)和拮抗［1］?；虮磉_(dá)譜芯片是目前應(yīng)用最為廣泛的基因芯片，具有快速、高效、大規(guī)模、高通量及平行性獲取相關(guān)生物信息的特點(diǎn)，可以同時(shí)分析多個(gè)基因的表達(dá)情況［2］。目前有關(guān)鼻息肉基因表達(dá)譜的研究較少，本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究了鼻息肉全基因表達(dá)譜的情況。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

取臨床經(jīng)病理證實(shí)的鼻息肉3例，正常鼻腔下鼻甲黏膜組織2例，迅速放入液氮中凍存?zhèn)溆茫谢颊咝g(shù)前均未接受激素等特殊治療。

1.2 總RNA提取

按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取每例組織標(biāo)本的總的RNA，紫外分光光度儀測(cè)量提取的RNA的純度，要求A260/A280為1.9～2.1。

1.3 基因表達(dá)譜芯片

應(yīng)用Roche NimbleGen公司的12×135K基因芯片，可同時(shí)檢測(cè)人類45 033個(gè)基因的表達(dá)。

1.4 RNA標(biāo)記和雜交

應(yīng)用美國(guó)Invitrogen公司的SuperScript ds-cDNA試劑盒，將5 μg 的RNA合成雙鏈的cDNA。雙鏈cDNA應(yīng)用美國(guó)NimbleGen公司的基因表達(dá)分析方法進(jìn)行標(biāo)記和清洗，雙鏈cDNA與4 μg RNase A在37 ℃孵育 10 min，用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）清洗，然后用低溫乙醇沉淀。NimbleGen單色DNA標(biāo)記試劑盒標(biāo)記cDNA。1 μg的雙鏈cDNA與1單位的Cy3-9引物在98℃孵育10 min，然后加入100 pmol的脫氧核苷三磷酸和100單位的克列諾片段（美國(guó)New England Biolabs），37 ℃孵育2 h。加入0.1 μL的0.5 mol/L EDTA停止反應(yīng)，異丙醇/乙醇將標(biāo)記的雙鏈cDNA提純，將4 μg Cy3標(biāo)記的雙鏈cDNA在基因芯片上進(jìn)行雜交，42 ℃孵育16～20 h。然后應(yīng)用NimbleGen Wash緩沖液沖洗。

1.5 圖像與數(shù)據(jù)的分析

基因芯片應(yīng)用Axon GenePix 4000B scanner（美國(guó)Molecular Devices公司）進(jìn)行掃描，數(shù)據(jù)應(yīng)用NimbleScan軟件進(jìn)行分析，探針及基因水平標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)應(yīng)用Agilent GeneSpring GX軟件進(jìn)行分析，篩選出比值＞2或＜0.5的基因。

2 結(jié)果

研究鼻息肉的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與正常鼻腔黏膜相比，3例鼻息肉中同時(shí)表達(dá)上調(diào)的基因有1 000個(gè)，占2.22% （1 000/45 033），同時(shí)表達(dá)下調(diào)的基因有1 123個(gè)，占2.49% （1 123/45 033）。見(jiàn)圖1。

圖1 鼻息肉的基因芯片F(xiàn)ig.1 Gene chip of nasal polyp

經(jīng)過(guò)信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)在核糖體、蛋白酶體、檸檬酸循環(huán)、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、慢性髓樣白血病、谷胱甘肽代謝等信號(hào)通路中有基因表達(dá)上調(diào)（圖2），在嗅覺(jué)傳導(dǎo)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞色素P450的化合物代謝、細(xì)胞色素P450的藥物代謝、抗原加工和呈遞、瘧疾、移植物抗宿主疾病、視黃醇代謝、亞油酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換等信號(hào)通路中有基因表達(dá)下調(diào)（圖3）。

圖2 鼻息肉基因比正常鼻腔黏膜表達(dá)高的相關(guān)信號(hào)通路Fig.2 Higher gene expression in the pathway of nasal polyp compared to normal nasal mucosa

圖3 鼻息肉基因比正常鼻腔黏膜表達(dá)低的相關(guān)信號(hào)通路Fig.3 Lower gene expression in the pathway of nasal polyp compared to normal nasal mucosa

3 討論

鼻息肉是鼻腔黏膜的慢性炎癥疾病，組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鼻息肉為呼吸上皮覆蓋的高度水腫的疏松纖維組織，間質(zhì)中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，多以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主。鼻息肉的發(fā)病機(jī)制和病因仍不十分清楚［3］，已發(fā)現(xiàn)有多個(gè)基因、多個(gè)信號(hào)通路與鼻息肉發(fā)生有關(guān)，BENITO等［4］研究了LTC4S、CYSLTR1、PTGDR和NOS2A基因在鼻息肉中多形態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因與鼻息肉臨床關(guān)系密切，在鼻息肉發(fā)展中起重要作用。FIGUEIREDO等［5］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子基因、金屬基質(zhì)蛋白酶參與了鼻息肉的炎癥及局部組織的重塑。有研究［6］報(bào)道，鼻息肉發(fā)生與干擾素α、轉(zhuǎn)錄因子、核因子κB、AP-1、p38MAPK、ERK 1/2、JNK、AKT等多個(gè)信號(hào)通路有關(guān)。基因芯片技術(shù)使得同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)成為可能，能夠篩選和發(fā)現(xiàn)疾病新的基因或信號(hào)通路，F(xiàn)R CZEK等［7］應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)NOS2A、SERPINA1、UCP2、OXTR和IL-8在鼻息肉中表達(dá)升高，而LTF、KRT6B、LYZ、SD11B2和MMP-3表達(dá)降低?；蛐酒卸喾N，本研究采用的是Roche NimbleGen的人全基因組表達(dá)芯片，可同時(shí)檢測(cè)45 033個(gè)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常鼻腔黏膜組織相比，鼻息肉組織中表達(dá)上調(diào)的基因有1 000個(gè)，占2.22%；表達(dá)下調(diào)的基因有1 123個(gè)，占2.49%，可見(jiàn)鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展與多個(gè)基因的表達(dá)失調(diào)有關(guān)。

本研究進(jìn)一步對(duì)表達(dá)失調(diào)的基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中在核糖體、蛋白酶體、檸檬酸循環(huán)、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、慢性髓樣白血病、谷胱甘肽代謝等信號(hào)通路中有基因表達(dá)上調(diào)。其中核糖體、蛋白酶體、檸檬酸循環(huán)等信號(hào)通路中的基因與鼻息肉的關(guān)系未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，而在膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌信號(hào)通路中有共同的CCND1和EGFR基因，在鼻息肉中表達(dá)均升高。LIN等［8］發(fā)現(xiàn)CCND1在鼻息肉組織中表達(dá)升高，DUAN等［9］認(rèn)為EGFR等基因在鼻息肉中表達(dá)升高，在鼻息肉發(fā)生、發(fā)展、組織重塑過(guò)程中起重要作用。這些研究結(jié)果與本研究基因芯片結(jié)果相符合。而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成及谷胱甘肽代謝信號(hào)通路出現(xiàn)的基因，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)與鼻息肉相關(guān)報(bào)道，但是其中GPX-1與上呼吸道感染及哮喘有一定關(guān)系，WON等［10］認(rèn)為缺乏GPX-1表達(dá)的小鼠中卵清蛋白不能誘發(fā)哮喘，鼻息肉與哮喘關(guān)系密切，可見(jiàn)GPX-1有可能是研究鼻息肉新的候選基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，在嗅覺(jué)傳導(dǎo)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞色素P450的化合物代謝等多個(gè)信號(hào)通路中，有基因表達(dá)下調(diào)。其中尤其值得關(guān)注的是嗅覺(jué)傳導(dǎo)通路，嗅覺(jué)傳導(dǎo)通路中的嗅覺(jué)受體在嗅神經(jīng)軸中起重要作用［11］。鼻息肉不僅阻塞溴素到達(dá)嗅區(qū)，影響嗅覺(jué)，本研究顯示鼻息肉組織嗅覺(jué)受體基因表達(dá)也下降。當(dāng)鼻息肉出現(xiàn)在嗅區(qū)時(shí)，會(huì)對(duì)嗅覺(jué)黏膜有一定影響，這也可能是鼻息肉引起嗅覺(jué)障礙的另一個(gè)機(jī)制，目前這方面研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號(hào)通路中的基因在鼻息肉中表達(dá)下降，其中ITGB2基因突變會(huì)導(dǎo)致呼吸道反復(fù)感染以及傷口不愈合［12］，鼻息肉中ITGB2基因表達(dá)下降無(wú)疑會(huì)促進(jìn)鼻息肉的發(fā)生和發(fā)展，以往并無(wú)這方面的研究。其他細(xì)胞色素P450的化合物代謝、瘧疾、抗原加工和呈遞等信號(hào)通路中的基因與鼻息肉關(guān)系研究較少。通過(guò)基因芯片技術(shù)，可以對(duì)鼻息肉的基因表達(dá)譜有一個(gè)全新的認(rèn)識(shí)，本研究篩選到了一些有價(jià)值的基因，通過(guò)信號(hào)通路分析，進(jìn)一步明確了研究的方向，為鼻息肉基礎(chǔ)研究提供了思路。

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（編輯 陳 姜）

Gene Expression Profiling in Nasal Polyp

BAI Weiliang，SONG Yan，WANG Xiaowei，LI Ting，XIANG Qinghua，ZHOU Qian，LI Jinxing

（Department of Otorhinolaryngology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

R765.2

A

0258-4646（2017）10-0895-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.016.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.008

遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金（2013001010）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F11-264-1-07，F(xiàn)13-220-9-21）

白偉良（1972 -），男，教授，博士.

白偉良，E-mail：bweiliangcmu@163.com

2017-04-21

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-09-27 14:52