張忠提，王丹，王振華

（中國醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬口腔醫(yī)院干診科，沈陽 110002； 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽 110122）

片仔癀對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞生物學(xué)行為的抑制作用

張忠提1，王丹2，王振華2

（中國醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬口腔醫(yī)院干診科，沈陽 110002； 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽 110122）

目的探討中藥片仔癀對舌鱗狀細胞癌細胞生物學(xué)行為的影響及分子機制。方法將不同濃度的片仔癀作用于Tca8113細胞，應(yīng)用MTT法檢測Tca8113細胞的增殖情況，應(yīng)用碘化丙啶（PI）染色檢測細胞周期的變化，應(yīng)用Western blotting檢測細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3磷酸化蛋白（p-STAT3）、Bcl-2蛋白表達的變化。結(jié)果MTT實驗結(jié)果顯示，片仔癀呈劑量依賴性抑制Tca8113細胞的增殖。PI染色結(jié)果顯示，片仔癀使細胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯。Western blotting結(jié)果提示，片仔癀抑制STAT3蛋白的磷酸化，抑制Bcl-2蛋白表達。結(jié)論片仔癀對舌鱗狀細胞癌細胞的增殖具有抑制作用。

片仔癀； 舌鱗狀細胞癌細胞； 細胞增殖

Abstract ObjectiveTo investigate the effects of Pien Tze Huang on the biological behavior of tongue squamous carcinoma Tca8113 cells and its molecular mechanism.MethodsTca8113 cells were incubated with Pien Tze Huang at different doses. The proliferation of Tca8113 cells was examined by MTT assay. The distribution of the cell cycle was evaluated by PI staining. The expression of the p-STAT3 and Bcl-2 proteins was assessed by Western blotting.ResultsMTT assay showed that Pien Tze Huang inhibited the proliferation of Tca8113 cells in a dose-dependent manner. PI staining showed that Pien Tze Huang arrested cells in the G0/G1phase. The results of Western blotting suggested that Pien Tze Huang inhibited STAT3 protein phosphorylation and Bcl-2 protein expression.ConclusionPien Tze Huang inhibits the proliferation of tongue squamous carcinoma cells.

KeywordsPien Tze Huang； tongue squamous carcinoma cell； cell proliferation

舌鱗狀細胞癌一般惡性程度較高、生長快、浸潤性強，且由于舌體淋巴管和血液循環(huán)非常豐富等原因，癌細胞早期常發(fā)生轉(zhuǎn)移且轉(zhuǎn)移率較高。舌癌的治療主要是以手術(shù)為主，Ⅲ～Ⅳ期晚期舌癌患者還需接受放化療，并輔以中醫(yī)藥的綜合治療［1-3］。在患者術(shù)后或放、化療期間配合使用某些中草藥，可提高機體免疫功能，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，抑制癌細胞生長，而且不良反應(yīng)較小，對穩(wěn)定病情有一定的效果。片仔癀是歷史悠久的傳統(tǒng)中成藥，具有散瘀止痛、散結(jié)解毒等功效，它可在結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮很好的抑癌作用，提高患者的生存質(zhì)量、延長生存時間［4-5］。中醫(yī)中藥在治療舌癌方面亦有重要地位，尋找一種效果好、不良反應(yīng)小的中藥制劑有利于舌癌患者的病情控制。本研究擬探討不同濃度的片仔癀對舌癌Tca8113細胞的生長、增殖及細胞周期的劑量作用關(guān)系及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Tca8113細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。片仔癀購自漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司；RPMI-1640購自美國Gibco公司；MTT、鼠抗GAPDH購自美國Sigma公司；ECL購自英國Amersham Biosciences公司；兔抗人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）磷 酸 化 蛋 白（phospho-STAT3，p-STAT3）、Bcl-2抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)Tca8113細胞，細胞呈貼壁生長，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的Tca8113細胞，分別加入不同濃度（0、200、400、800 μ g/mL）的片仔癀48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況并拍照。

1.2.2 MTT法：取對數(shù)生長期的Tca8113細胞，加入含有不同濃度（200、400、600、800、1 000 μ g/mL）的片仔癀，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μ L充分混合，震蕩15 min，用酶標儀測定在570 nm處的光密度（optical density，OD）值。根據(jù)各組的OD值計算出藥物對細胞增殖抑制率，公式如下：抑制率（%） =1- （加藥組平均OD值/對照組平均OD值）×100。

1.2.3 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色：應(yīng)用流式細胞儀檢測不同濃度（0、300、450、600 μ g/mL）的片仔癀對Tca8113細胞周期的影響，將各實驗組細胞培養(yǎng)48 h后進行檢測，PBS漂洗后2 000 r/min離心5 min，細胞加入預(yù)冷的70%乙醇-20 ℃固定，用500 μ L PBS重懸細胞，加入核糖核酸酶A和5 μ L PI，室溫避光30 min后，用于檢測Tca8113細胞周期的變化。

1.2.4 Western blotting：應(yīng)用Western blotting方法檢測不同濃度（0、300、450、600 μ g/mL）的片仔癀對Tca8113細胞中p-STAT3、Bcl-2蛋白表達的影響，各實驗組細胞培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌后加入細胞裂解液，收集總蛋白。以BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。配制10%分離膠和4%濃縮膠。電泳后轉(zhuǎn)印2 h，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉的封閉液孵育1 h，在兔抗p-STAT3、Bcl-2及鼠抗GAPDH一抗中4 ℃過夜，稀釋相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，用TBST洗3次，每次10 min。ECL顯色，圖像用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，2組間的比較采用t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 片仔癀對Tca8113細胞形態(tài)的影響

顯微鏡下所見，對照組細胞形態(tài)規(guī)則，多角形居多，體積較大，細胞飽滿。加入不同濃度的片仔癀48 h后，細胞的形態(tài)和體積以及細胞密度均發(fā)生改變，隨著藥物濃度的增加，細胞變形、體積變小，甚至皺縮，部分可見細胞碎片，細胞密度愈加稀疏。表明片仔癀可促進Tca8113細胞發(fā)生凋亡、壞死。見圖1。

圖1 不同濃度的片仔癀對Tca8113細胞形態(tài)的影響 ×200Fig.1 Effect of Pien Tze Huang on cell morphology at different doses ×200

2.2 片仔癀抑制Tca8113細胞的增殖

片仔癀抑制Tca8113細胞的增殖，且隨著給藥濃度的增加，片仔癀對Tca8113細胞的增殖抑制率顯著升高（P ＜ 0.01），同一濃度下給藥48 h與給藥24 h相比，對Tca8113細胞的增殖抑制率顯著增加（P ＜0.01）。見表1。

表1 片仔癀對Tca8113細胞的增殖抑制率（%）Tab.1 Proliferation inhibition rate of Tca8113 cells incubated with Pien Tze Huang （%）

2.3 片仔癀對Tca8113細胞周期的影響

應(yīng)用流式細胞儀檢測片仔癀對Tca8113細胞的細胞周期分布的改變。片仔癀使細胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯，細胞比例隨給藥濃度增加而增加，同時伴有S期細胞比例下降（P ＜ 0.01）。見表2。

表2 片仔癀作用48 h后對Tca8113細胞周期各期細胞比例的影響（%）Tab.2 Changes of cell proportion in the cell cycle of Tca8113 cells incubated with Pien Tze Huang for 48 h（%）

2.4 片仔癀對p-STAT3、Bcl-2蛋白表達的影響

片仔癀作用Tca8113細胞48 h后，p-STAT3、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，并隨給藥濃度增加而逐漸下降（圖2）。Western blotting結(jié)果提示，片仔癀抑制STAT3蛋白的磷酸化，抑制抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達。

3 討論

圖2 片仔癀對Tca8113細胞中p-STAT3、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Pien Tze Huang on the expression of the p-STAT3 and Bcl-2 proteins in Tca8113 cells

不同濃度的片仔癀作用于舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞24 h或48 h，對癌細胞的增殖有顯著抑制作用，這一抑制效應(yīng)隨著給藥濃度和給藥時間的增加而增強。PI染色實驗結(jié)果亦顯示，不同濃度的片仔癀作用Tca8113細胞48 h可顯著抑制細胞周期于G0/G1期，與MTT增殖實驗結(jié)果一致。Western blotting結(jié)果顯示，p-STAT3、Bcl-2信號分子可能參與了片仔癀抑制Tca8113細胞增殖這一生物學(xué)過程。

由于近年來人們生活節(jié)奏和生活方式的變化等原因，舌癌的發(fā)生率有逐年升高的趨勢。舌是味覺、輔助發(fā)音、幫助吞咽、攪拌食物的重要器官，因此舌癌患者的生活質(zhì)量會嚴重下降。而對于一些中晚期不能手術(shù)或術(shù)后、放化療后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的舌癌患者，通過中醫(yī)藥的輔助治療可明顯改善患者的癥狀，減輕患者的痛苦。片仔癀是國家一級中藥保護品種，是源于明朝宮廷秘方研制的一種特效消腫退燒的中成藥。主要成分包括清熱解毒的牛黃、蛇膽，消腫止痛的麝香和散瘀消腫止痛的三七。片仔癀作用較廣泛，可保護肝臟、清熱降火、美容養(yǎng)顏、消除“溫、熱、毒、邪”，還可以作為抗腫瘤的輔助用藥［6］。有文獻［7］報道片仔癀可通過多途徑誘導(dǎo)人骨肉瘤MG63細胞的凋亡。片仔癀還可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路，降低結(jié)腸癌細胞的肝轉(zhuǎn)移［8］，亦可通過抑制腫瘤血管新生達到抑癌作用［9］。片仔癀在舌癌方面的研究還未見報道。

本研究設(shè)立片仔癀的不同濃度給藥組（200、400、600、800、1 000 μ g/mL）分別作用于Tca8113細胞24 h或48 h，觀察不同濃度、不同作用時間片仔癀對Tca8113細胞增殖的影響。MTT實驗結(jié)果顯示，片仔癀可顯著抑制Tca8113細胞的增殖，呈劑量依賴性和時間依賴性，鏡下觀察片仔癀濃度越高，處理的細胞形態(tài)呈凋亡樣變化越明顯。本研究還觀察了3個不同濃度的片仔癀對細胞周期進程的作用，結(jié)果顯示片仔癀作用使G0/G1期細胞比例較對照組顯著增加，即片仔癀可使Tca8113細胞阻滯于G0/G1期。這些結(jié)果證實了片仔癀可有效地抑制舌鱗狀細胞癌細胞的增殖。

STAT3是細胞內(nèi)重要的信號傳遞因子，它在腫瘤生長、凋亡、遷移與侵襲、血管生長等方面都有重要作用，其下游靶基因較多，比如抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1，又有促進增殖方面的相關(guān)基因如CyclinD1、C-myc等［10-11］。本研究發(fā)現(xiàn)片仔癀可抑制STAT3的磷酸化激活，其中600 μ g/mL給藥組抑制效果最強。片仔癀對STAT3下游靶基因Bcl-2表達水平的影響與p-STAT3的表達變化一致，說明STAT3/Bcl-2信號分子的下調(diào)參與了片仔癀抑制舌癌細胞增殖的這一生物學(xué)過程。本研究為片仔癀在抗腫瘤領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

［1］ LI R，KOCH WM，F(xiàn)AKHRY C，et al. Distinct epidemiologic characteristics of oral tongue cancer patients ［J］. Otolaryngol Head Neck Surg，2013，148（5）：792-796. DOI：10.1177/0194599813477992.

［2］ YANG ZH，CHEN WL，HUANG HZ，et al. Quality of life of patients with tongue cancer 1 year after surgery［J］. J Oral Maxillofac Surg，2010，68（9）：2164-2168. DOI：10.1016/j.joms.2009.09.048.

［3］ 張陳平. 關(guān)于舌癌治療的幾點建議 ［J］. 中國實用口腔科雜志，2010，3（7）：385-387. DOI：10.3969/j.issn.1674-1595.2010.07.001.

［4］ LIN JM，WEI LH，CHEN YQ，et al. Pien Tze Huang-induced apoptosis in human colon cancer HT-29 cell is associated with regulation of the Bcl-2 family and activation of caspase 3 ［J］. Chin J Integr Med，2011，17（9）：685-690. DOI：10.1007/s11655-011-0846-4.

［5］ SHEN A，LIN J，CHEN Y，et al. Pien Tze Huang inhibits tumor angiogenesis in a mouse model of colorectal cancer via suppression of multiple cellular pathways ［J］. Oncol Rep，2013，30（4）：1701-1706.DOI：10.3892/or.2013.2609.

［6］ LEE KK，KWONG WH，CHAU FT，et al. Pien Tze Huang protects the liver against carbon tetrachloride induced-damage ［J］.Pharmacol Toxicol，2002，91（4）：185-192.

［7］ FU Y，ZHANG L，HONG Z，et al. Methanolic extract of Pien Tze Huang induces apoptosis signaling in human osteosarcoma MG63 cells via multiple pathways［J］. Molecules，2016，21（3）：283.DOI：10.3390/molecules21030283.

［8］ LIN W，ZHUANG Q，ZHENG L，et al. Pien Tze Huang inhibits liver metastasis by targeting TGF-β signaling in an orthotopic model of colorectal cancer［J］. Oncol Rep，2015，33（4）：1922-1928.DOI：10.3892/or.2015.3784.

［9］ SHEN AL，HONG F，LIU LY，et al. Effects of Pien Tze Huang on angiogenesis in vivo and in vitro ［J］. Chin J Integr Med，2012，18（6）：431-436. DOI：10.1007/s11655-012-1121-z.

［10］ FOFARIA NM，SRIVASTAVA SK. STAT3 induces anoikis resistance，promotes cell invasion and metastatic potential in pancreatic cancer cells ［J］. Carcinogenesis，2015，36（1）：142-150. DOI：10.1093/carcin/bgu233.

［11］ SIVEEN KS，SIKKA S，SURANA R，et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer：role of synthetic and natural inhibitors［J］. Biochim Biophys Acta，2014，1845（2）：136-154. DOI：10.1016/j.bbcan.2013.12.005.

（編輯 陳 姜）

Pien Tze Huang Inhibits the Biological Behavior of Tongue Squamous Carcinoma Tca8113 Cells

ZHANG Zhongti1，WANG Dan2，WANG Zhenhua2

（1. VIP Department，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China； 2. Department of Physiology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110122，China）

R739.86

A

0258-4646（2017）10-0899-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.018.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.009

遼寧省自然科學(xué)基金（2015020558，2015020750）；遼寧省臨床能力建設(shè)項目（LNCCC-D17-2015）

張忠提（1972 -），男，副教授，博士.

張忠提，E-mail：zhangzhongti@163.com

2017-04-12

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-09-27 14:52