劉 巖 付旭東

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052

·論著臨床診治·

XRCC1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

劉 巖 付旭東△

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052

目的分析XRCC1在腦膠質(zhì)瘤，癌旁組織和正常組織中的表達(dá)情況。方法鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2015-07—2016-03經(jīng)手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本50例，按病理類型可分級，另取因高血壓所導(dǎo)致的腦出血行正常腦組織切除減壓患者標(biāo)本10例為對照組。依次檢測不同級別的腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中XRCC1的表達(dá)情況，比較XRCC1在不同級別的腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中以及在不同年齡及性別中的陽性率和相關(guān)性。結(jié)果低度惡性組膠質(zhì)瘤(Ⅰ～Ⅱ級)XRCC1陽性率低于高度惡性組膠質(zhì)瘤(Ⅲ～Ⅳ級)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在10例正常腦組織標(biāo)本中XRCC1表達(dá)總陽性率為0%。XRCC1在正常腦組織與膠質(zhì)瘤組織表達(dá)有顯著差異(P<0.05)；50例膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本中XRCC1的表達(dá)與患者年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論XRCC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于正常腦組織；XRCC1陽性率的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性級別無相關(guān)性。

腦膠質(zhì)瘤；XRCC1；免疫組化；表達(dá)意義

腦膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，總體發(fā)病率占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤發(fā)病率的50%[1]，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤。腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍正常組織分界不清，位于大腦功能區(qū)的膠質(zhì)瘤，即便采用顯微神經(jīng)外科技術(shù)也很難完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)，對放療不甚敏感，傳統(tǒng)化療藥物不易通過血腦屏障，效果不理想，而且有毒副作用。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的平均生存期12～15個月[2]，近期的研究結(jié)果表明，XRCC1的基因多態(tài)性與頭頸部、肺部、結(jié)腸、前列腺等多種惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。本研究運用免疫組化的方法對50例不同級別的腦膠質(zhì)瘤患者和10例正常腦組織中XRCC1的表達(dá)進(jìn)行測定，并分析其與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1病例選擇收集鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2015-07—2016-03經(jīng)手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本50例，所有標(biāo)本均通過我院病理科診斷證實，按病理類型可分為：星形膠質(zhì)瘤21例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤14例，室管膜瘤7例，髓母細(xì)胞瘤8例。按照2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(Ⅰ～Ⅳ級)，可將50例標(biāo)本分為：Ⅰ級膠質(zhì)瘤10例，Ⅱ級膠質(zhì)瘤13例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤15例，Ⅳ級膠質(zhì)瘤12例。其中將Ⅰ～Ⅱ級歸為低度惡性組(23例)，Ⅲ～Ⅳ級歸為高度惡性組(27例)，50例患者年齡16～70歲，平均43歲，男23例，女27例，另取由高血壓所導(dǎo)致的腦出血行正常腦組織切除減壓患者標(biāo)本10例為對照組。對照組標(biāo)本均通過我院倫理協(xié)會批準(zhǔn)。

1．2入選標(biāo)準(zhǔn)(1)50例患者均為首次入院，行手術(shù)治療前均未進(jìn)行過任何放、化療或免疫治療；(2)患者入院后均行常規(guī)檢查，且結(jié)果回示排除患有其他部位腫瘤；(3)腫瘤直徑2～8 cm，所有腫瘤均為顯微鏡下手術(shù)全部切除或者大部分切除；(4)手術(shù)方案是經(jīng)過我院神經(jīng)外科全體醫(yī)師討論并由資深醫(yī)師主刀，術(shù)中所得病理組織，均經(jīng)我院病理科檢驗確診為膠質(zhì)瘤；(5)確保石蠟組織的質(zhì)量良好；(6)所選患者依從性良好，術(shù)后隨訪態(tài)度積極；(7)隨訪資料及患者臨床資料保存完整。

1．3主要實驗試劑濃縮型兔抗人XRCC1單克隆抗體(購自福州邁新公司)、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、蘇木素染液、DAB顯色劑(購自北京中山金橋生物公司)、伊紅染液、APES防脫片劑、二甲苯、無水乙醇。

2 實驗方法

2．1石蠟切片的制備過程首先在術(shù)中取材后固定，用純化水充分沖洗后脫水，再將組織進(jìn)行透明和浸蠟，浸蠟完成之后再放入蠟槽中包埋，用石蠟切片機將蠟塊切成4～5 μm厚的切片，將切片放入35 ℃的溫水中展片，展平之后放在涂有很薄層蛋白甘油的載玻片擺正，最后放入格盤中用溫箱烘干粘片，以上步驟完成之后即可進(jìn)行染色。

2．2 HE染色的步驟(1)切片首先經(jīng)過烤箱烤片1 h，后進(jìn)行脫蠟。(2)先用蘇木素染色15 min后，用純化水沖洗。(3)再用鹽酸酒精分色3 min，用純化水沖洗。(4)置玻片于40～50 ℃的溫水中反藍(lán)2 min。(5)伊紅復(fù)染3～5 min。(6)先用梯度酒精脫水各15 min，然后用二甲苯透明兩次，再用中性樹膠封片，制備HE染色切片進(jìn)行常規(guī)病例切片觀察，與免疫組化結(jié)果對照觀察。

2．3免疫組化檢測的步驟(1)實驗進(jìn)行前先將切片在烤箱中烤2 h。(2)開始脫蠟和水化。(3)每張切片上滴加1滴3%的過氧化氫溶液，在室溫下孵育20 min。(4)0.01 PBS沖洗5 min×3次。(5)采用高溫高壓組織抗原修復(fù)。(6)3%過氧化氫浸泡，蒸餾水沖洗。(7)0.01 PBS沖洗，正常羊血清室溫下孵育。(8)滴加抗兔抗人XRCC1，置4 ℃冰箱12 h。(9)0.01 PBS沖洗，滴加試劑1，室溫孵育。(10)0.01 PBS沖洗，滴加試劑2，室溫孵育。(11)0.01 PBS沖洗，滴加DAB顯色液。(12)中止染色，先用蘇木素輕度復(fù)染，后鹽酸酒精分化，在溫水中反藍(lán)。(13)梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。

2．4免疫組化陽性結(jié)果判斷XRCC1陽性結(jié)果的判定采用半定量積分法，以切片標(biāo)本細(xì)胞核和(或)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為準(zhǔn)，具體標(biāo)準(zhǔn)為：(1)陽性細(xì)胞數(shù)小于5%者0分，6%～25%者1分，26%～50%者2分，51%～75%者3分，76%以上者(包括76%)4分。(2)陽性細(xì)胞強度：淺黃色者1分，黃色者2分，棕褐色者3分。按照(1)(2)兩標(biāo)準(zhǔn)得分的乘積值來定陽性分級，0分者陰性(-)，1～4者弱陽性(+)，5～8分者陽性(++)，9～12分者強陽性(+++)。檢測結(jié)果均要求在雙盲條件下由主要研究人員和經(jīng)驗豐富的病理科人員兩位閱片評估。使用購買試劑時贈送的陽性切片作對照。

2．5統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 17.0軟件完成:2組均值比較采用t檢驗；臨床病理資料等計數(shù)資料分析采用卡方檢驗或 Fisher 精確概率法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3．1 XRCC1在不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)50例神經(jīng)膠質(zhì)瘤和10例正常腦組織切片染色成功。XRCC1的陽性表達(dá)表現(xiàn)為免疫組織化學(xué)染色在細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，大部分陽性細(xì)胞分布不規(guī)則。XRCC1在膠質(zhì)瘤陽性表達(dá)率為38%，在正常腦組織的陽性表達(dá)為0%，由此可見神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的XRCC1陽性表達(dá)率明顯高于正常人。見表1、2。

表1 XRCC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤與正常腦組織的表達(dá) (n)

表2 XRCC1在不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá) (n)

3．2 XRCC1在不同性別膠質(zhì)瘤患者中的陽性率和相關(guān)性50例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，男23例，女27例，其中23例男性患者中，XRCC1表達(dá)為陽性者7例，陽性率30.43%；27例女性患者中，XRCC1表達(dá)為陽性者13例，陽性率48.15%。XRCC1在不同性別膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)陽性率比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。見表3。

3．3 XRCC1在不同年齡段膠質(zhì)瘤患者中的陽性率和相關(guān)性50例患者年齡16～70歲，平均43歲，其中≥40歲患者XRCC1表達(dá)為陽性者11例，陽性率34.38%，<40歲患者XRCC1表達(dá)為陽性者8例，陽性率44.44%。見表4。

表4 XRCC1在不同年齡段膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)陽性率和相關(guān)性

4 討論

中樞神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占成年人顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤相當(dāng)大比例，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤程彌漫浸潤性生長，侵襲性強，生長速度快，與附近正常腦組織分界不清，手術(shù)難以徹底切除，故復(fù)發(fā)率高，具有顯著的占位效應(yīng)，患者在較短時間內(nèi)就可出現(xiàn)高顱壓癥狀。傳統(tǒng)治療方法效果差，患者生存期短，多數(shù)患者最后死于腫瘤細(xì)胞的耐藥性，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療已成為神經(jīng)外科學(xué)上一重大難題。目前對于膠質(zhì)瘤患者的治療手段主要是手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療，但膠質(zhì)瘤可生長于顱內(nèi)多個區(qū)域，常累及腦內(nèi)重要功能區(qū)，侵犯腦內(nèi)重要血管，且部分病人侵犯部位深、體積大，所以手術(shù)很難完全切除，且術(shù)后復(fù)發(fā)極快，患者生存期短，預(yù)后相當(dāng)差。

現(xiàn)階段臨床上使用比較多的化療藥物主要是鉑類藥物和烷化劑類藥物，這兩類藥物的作用靶點均為膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)能力很大程度上決定膠質(zhì)瘤對化療藥物的耐藥性，XRCC1是膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA修復(fù)基因的一種類型，它在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)強度直接影響了腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的耐藥性。本次研究的主要目的就是通過檢測XRCC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，研究其對抗腫瘤藥物的耐藥機制從而為在臨床上更好的治療膠質(zhì)瘤患者提供參考。人類XRCC1是影響細(xì)胞對電離輻射敏感性分離出的第一個哺乳動物基因，染色體19q13.2-13.3區(qū)屬于XRCC1的編碼基因，編碼基因全長約31.9 Kb，cDNA長約2.2 Kb，由17個外顯子組成[3]，編碼產(chǎn)物為一個由633個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。XRCC1本身不具有酶的催化活性，而是作為連接蛋白參與堿基修復(fù)切除和單鏈DNA斷裂修復(fù)。通過細(xì)胞融合與X射線的互補實驗，現(xiàn)已鑒定出11個遺傳族群，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP )是最常見的人類可遺傳的一種變異，可導(dǎo)致氨基酸的編碼發(fā)生改變，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等改變，Shen[4]等報道了XRCC1的3處常見突變，分別使氨基酸發(fā)生了Arg轉(zhuǎn)變成Trp，Arg轉(zhuǎn)變成His，Arg轉(zhuǎn)變成Gln的替換效應(yīng)，由DNA修復(fù)基因SNP所引起的不同個體DNA修復(fù)能力不同，使機體對疾病的易感性發(fā)生變化，這也是腫瘤易感因素之一。XRCC1是現(xiàn)階段研究最多的一種DNA修復(fù)基因，廣泛參與電離輻射和氧化反應(yīng)所導(dǎo)致單鏈DNA斷裂和堿基損傷修復(fù)，其表達(dá)異常跟多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，XRCC1編碼的蛋白本身不具有酶催化活性，而是作為連接蛋白參與堿基修復(fù)切除和單鏈DNA斷裂修復(fù)。DNA修復(fù)基因的多態(tài)性影響著DNA的修復(fù)能力，目前已發(fā)現(xiàn)XRCC1蛋白質(zhì)共有3個功能域，分別與不同的酶發(fā)生作用，參與基因修復(fù)的不同步驟和類型。XRCC1的突變使基因的穩(wěn)定性下降，可能會增加腫瘤的易感性。先前的研究結(jié)果表明：XRCC1的多態(tài)性與臨床上多見的大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)[5-6]。近期的研究表明XRCC1的多態(tài)性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)[7]。

鉑類藥物進(jìn)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞后直接與DNA結(jié)合，形成DNA加合物，通過限制DNA的解旋來抑制DNA的復(fù)制，腫瘤細(xì)胞的繁殖速度比正常組織細(xì)胞的繁殖速度快，且腫瘤細(xì)胞對受損DNA的修復(fù)功能并不完善，DNA的修復(fù)能力是影響鉑類抗腫瘤藥物療效的關(guān)鍵[8]。XRCC1是一種重要的DNA修復(fù)基因，它所編碼的蛋白質(zhì)參與堿基修復(fù)切除和單鏈DNA斷裂修復(fù)，對維持基因組的穩(wěn)定性具有十分重要的作用。不同個體的XRCC1的表達(dá)情況有所不同[9]，這也可能是不同個體之間DNA修復(fù)能力不同的原因之一。DNA的修復(fù)能力跟機體對腫瘤的易感性和抗腫瘤藥物的療效有著很大聯(lián)系：DNA的修復(fù)能力越強，機體對腫瘤的易感性越低，但對抗腫瘤藥物的耐藥作用可能會增強，反之亦然。

本研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)XRCC1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，可能對膠質(zhì)瘤耐藥的研究提供新的思路，然而XRCC1通過何種途徑參與腫瘤的進(jìn)展及浸潤，能否通過抑制XRCC1的表達(dá)來抑制膠質(zhì)瘤的生長及耐藥性，將是我們下一步的任務(wù)所在。

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(收稿2017-03-20)

責(zé)任編輯：王喜梅

TheexpressionandsignificanceofXRCC1ingliomastissues

LiuYan，F(xiàn)uXudong

DepartmentofNeurosurgery，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

ObjectiveTo analyze the expression of XRCC1 in glioma and adjacent tissues and normal tissues．Methods50 samples of brain gliomas removed from surgery in department of neurosurgery of The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University from July 2015 to March 2016 were collected．All samples had been diagnosed，verified and graded according to pathological types by the pathology department of our hospital．Besides，10 samples of normal brain tissues resected from patients with cerebral hemorrhage caused by hypertension were collected as control group．The XRCC1 expression in the two groups was detected and the positive rate and correlation between XRCC1 in brain gliomas of different levels and the relation of XRCC1 with age and gender were analyzed．ResultThe difference between the XRCC1 positive rate of low-degree malignant group of glioma (Ⅰ-Ⅱ) and that of high-degree malignant group of glioma (Ⅲ-Ⅳ) had no statistical significance (P>0.05)．Among 10 samples of normal brain tissues，the total positive expression rate of XRCC1 was 0%．According to statistical analysis，there was significant difference between the expression of XRCC1 in normal brain tissues and glioma tissues (P<0.05)．Among the 50 samples of glioma tissues，after statistical analysis，there was no difference between the expression of XRCC1 in the patients' ages and genders (P>0.05)．ConclusionThe expression of XRCC1 in gliomas is significantly higher than that in normal brain tissues；the expression of XRCC1's positive rate has no correlation with the malignant degrees of gliomas．

Brain gliomas；XRCC1；Immunohistochemistry；Expressive meaning

R730.264

A

1673-5110(2017)18-0046-04

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.18.014

△通信作者：付旭東(1976—)，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：神經(jīng)外科。Email：fxd@126.com