馬艷紅，張旭婷，于肖夏，劉旭婷，高 慧，于 卓

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

蒙古冰草苗期抗旱相關(guān)microRNA的差異表達(dá)分析及靶基因預(yù)測(cè)

馬艷紅，張旭婷，于肖夏，劉旭婷，高 慧，于 卓

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

為明確蒙古冰草抗旱相關(guān)microRNA(miRNA)的表達(dá)特征及其靶基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)前期測(cè)序篩選到的4個(gè)miRNA(amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62、amo-miR82)在干旱脅迫下的苗期差異表達(dá)情況進(jìn)行了定量驗(yàn)證，用Target Finder軟件和psRNATarget數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測(cè)其靶基因，并用MegAlign軟件對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行了同源性比對(duì)分析。結(jié)果表明，干旱脅迫下，蒙古冰草中amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，而amo-miR44的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，與前期測(cè)序結(jié)果相符；4個(gè)miRNA共預(yù)測(cè)出32個(gè)靶基因，其中，amo-miR44在玉米、水稻和小麥數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源的靶基因，在擬南芥、大麥、蒺藜苜蓿中發(fā)現(xiàn)的靶基因相似性較低；而amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的靶基因均與小麥中預(yù)測(cè)的靶基因存在較高同源性(68.6%～95.6%)，推測(cè)這3個(gè)靶基因是參與干旱逆境脅迫響應(yīng)的基因。

蒙古冰草；干旱脅迫；microRNA；熒光定量RT-PCR；靶基因預(yù)測(cè)

Abstract:In order to know the expression characteristics and target gene of drought-responsive microRNA(miRNA) inAgropyronmongolicumKeng,the temporal expression of four miRNA(amo-miR21,amo-miR44,amo-miR62 and amo-miR82) under drought stress treatment at seedling stage were monitored by fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction,of which miRNA have been selected based on the previous researches of small RNA-seq. Their target genes were predicted by Target Finder software and psRNATarget database,and the homology were analyzed with MegAlign. The results showed that amo-miR21,amo-miR82 and amo-miR62 were significantly up-regulated in leaves,while amo-miR44 was down-regulated under drought stress,and the expression of the four miRNA were consistent with sequencing data. Thirty-two target genes of the four miRNAs ofA.mongolicumwere predicted by Target Finder software and homologously searched in psRNATarget database. The homologous target genes of amo-miR44 are not found in corn,rice or wheat database,and the similarity index of target gene sequence pairs fromA.mongolicumandArabidopsisthaliana,Hordeumvulgare,Medicagotruncatulais low. The three target genes of amo-miR21,amo-miR82,and amo-miR62 are homologous with the target genes fromTriticumaestivum(68.6%-95.6%),which can be speculated as drought-responsive genes.

Keywords:AgropyronmongolicumKeng; Drought stress; microRNA; Fluorescent quantitative RT-PCR; Target gene prediction

蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng)為小麥族冰草屬(Agropyron)二倍體多年生牧草，是耿以禮教授于1938年發(fā)現(xiàn)的新種，模式標(biāo)本產(chǎn)地為內(nèi)蒙古烏蘭察布盟的百靈廟地區(qū)[1-2]，在內(nèi)蒙古集中分布在渾善達(dá)克沙地和嘎亥額勒蘇沙地，為典型的寒旱生植物，其根系發(fā)達(dá)、具沙套、返青早、分蘗多、抗旱性極強(qiáng)，是麥類作物抗旱性改良的優(yōu)良基因資源[3-5]。

MicroRNA(miRNA)是植物體內(nèi)普遍存在的長度約21～25 nt的內(nèi)源單鏈小分子非編碼RNA，其與靶mRNA序列的互補(bǔ)程度決定其對(duì)靶mRNA的剪切或翻譯的阻遏，主要在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控，是mRNA表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一[6-7]。miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase(miRBase V21.0)共收錄了223個(gè)物種的35 828個(gè)成熟的miRNA，涵蓋了73個(gè)植物種的849個(gè)miRNA。大量研究表明，miRNA在植物的生育、細(xì)胞分化、抗非生物脅迫等過程中發(fā)揮重要作用[6,8]。目前，針對(duì)miRNA響應(yīng)干旱脅迫并參與調(diào)控的研究已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、煙草(NicotianatabacumL.)、大豆(GlycinemaxL.)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、楊樹(PopulustrichocarpaL.)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、大麥(Hordeumvulgare)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、桃(Prunuspersica)、擬二粒小麥(Triticumdicoccoides)、沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)等植物中有相關(guān)報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，與抗旱相關(guān)的miRNA有miR156、miR159、miR167、miR168、miR171、miR172、miR319、miR393、miR394a、miR395、miR396、miR397、miR161、miR168、miR169等[9-14]。但至今尚未見有關(guān)于蒙古冰草抗旱相關(guān)miRNA的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)在前期對(duì)蒙古冰草Solexa高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)選出與抗旱性顯著相關(guān)的4個(gè)新預(yù)測(cè)的保守miRNA(amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62和amo-miR82)進(jìn)行定量分析，并對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為闡明蒙古冰草抗旱相關(guān)miRNA調(diào)控機(jī)制及其靶基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及干旱處理

供試材料為野生蒙古冰草，其種子采集于內(nèi)蒙古烏蘭察布百靈廟鎮(zhèn)。

挑選籽粒飽滿的蒙古冰草種子，種植于裝有花卉土與蛭石混合(1∶1)的花盆(直徑20 cm，深30 cm)中，每盆播種50粒種子，共24盆，置人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，室內(nèi)晝夜溫度25±5 ℃，光強(qiáng)30 000 lx，光照時(shí)間14 h，定量澆水，濕度65%。待幼苗長至15 cm時(shí)，分成對(duì)照和處理兩組，處理組進(jìn)行斷水干旱脅迫，脅迫天數(shù)為3、6、9、12、15、18、21 d(21 d干旱處理后，葉片較干枯，復(fù)水后僅有少數(shù)植株成活，為水分脅迫的臨界點(diǎn))，3次重復(fù)，每個(gè)處理同期取15株幼苗葉片等量混合，立即于液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存。

1.2 miRNA表達(dá)的熒光定量RT-PCR檢測(cè)

1.2.1 總RNA提取及miRNA反轉(zhuǎn)錄

取凍存的樣本經(jīng)液氮研磨后，利用Trizol法提取各處理及對(duì)照的總RNA。取2 μL RNA原液稀釋至10 μL，用1%的瓊脂糖凝膠電泳20 min后，檢測(cè)其完整性和純度。各處理及對(duì)照樣品總RNA采用TianGen公司生產(chǎn)的miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒(KR211)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括2 μL的2×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、2 μL RNA模板、1.2 μL逆轉(zhuǎn)錄引物、0.2 μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U·μL-1)，加DEPC水至總體積20 μL。反應(yīng)條件：26 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量RT-PCR

用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)表格整理及柱形圖繪制，用SAS 9.0軟件進(jìn)行方差及差異顯著性分析。

表1 熒光定量RT-PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.3 靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

利用Target Finder[18]軟件對(duì)蒙古冰草4個(gè)新預(yù)測(cè)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并用BLAST軟件[19]將預(yù)測(cè)得到的靶基因序列與nr[20]、Swiss-Prot[21]數(shù)據(jù)庫比對(duì)，獲得靶基因序列的注釋信息。同時(shí)，在植物microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫psRNATarget[22](http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)中，基于模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(NicotianatabacumL.)及禾本科植物小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、豆科牧草蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)靶基因(Scoring Schema為Schema V2，2017 release)，成熟的miRNA與其靶基因之間的錯(cuò)配堿基不超過3個(gè)。

用軟件DNAstar中MegAlign[23]對(duì)蒙古冰草4個(gè)miRNA預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行多序列比對(duì)及相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古冰草總RNA的質(zhì)量

利用Trizol法提取7個(gè)干旱處理及對(duì)照樣品的總RNA后，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果(圖1)顯示，28S rRNA、18S rRNA條帶清晰穩(wěn)定，RNA無降解，未出現(xiàn)DNA污染。OD260/280值在1.8～2.1之間。說明RNA含量和質(zhì)量均符合PCR擴(kuò)增要求。

CK：對(duì)照；1～7：干旱處理3、6、9、12、15、18、21 d。

CK:Control; 1-7:Drought stress treatment for 3,6,9,12,15,18,and 21 d.

圖1蒙古冰草干旱處理后總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

Fig.1TotalRNAofA.mongolicumunderdroughtstressdetectedbyagarosegel

2.2 與抗旱性相關(guān)的4個(gè)新預(yù)測(cè)miRNA的真實(shí)性

根據(jù)4個(gè)新預(yù)測(cè)的miRNA(amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62和amo-miR82)前體序列設(shè)計(jì)莖環(huán)狀特異引物，以 U6作為內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果(圖2)顯示，這4個(gè)miRNA均能在7個(gè)干旱處理及對(duì)照樣品中檢測(cè)到，是一條片段大小約為100 bp的清晰條帶，與預(yù)期片段大小一致，表明這4個(gè)miRNA是真實(shí)存在的。

2.3 與抗旱性相關(guān)的4個(gè)新預(yù)測(cè)miRNA的表達(dá)分析

以 U6為內(nèi)參基因，將蒙古冰草未經(jīng)干旱脅迫的miRNA表達(dá)量作為對(duì)照，設(shè)其為1，然后分別計(jì)算出各干旱處理中的miRNA相對(duì)表達(dá)量(圖3)。由圖1可知，蒙古冰草中amo-miR21、amo-miR62和amo-miR82的表達(dá)量隨著干旱脅迫時(shí)間的延長均呈上升趨勢(shì)，在干旱脅迫21 d時(shí)，其表達(dá)量分別較對(duì)照增加2.39、2.60和2.46倍；另外，干旱處理15、18和21 d時(shí)，這3個(gè)miRNA的表達(dá)量差異不顯著，表明干旱15 d時(shí)蒙古冰草的miRNA表達(dá)為極限表達(dá)。amo-miR44的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，干旱處理?xiàng)l件下的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照，干旱處理21 d時(shí)的表達(dá)量較對(duì)照降低69.9%。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；CK：對(duì)照；1～3:3次重復(fù)。

M：DNA marker DL2000；CK：Control；1-3：Three replicates.

圖2干旱處理后蒙古冰草中與抗旱性相關(guān)的4個(gè)新預(yù)測(cè)miRNA的電泳檢測(cè)結(jié)果

Fig.2Electrophoretogramforthefournoveldrought-responsivemiRNAofA.mongolicumunderdroughtstress

圖注上不同字母表示處理間差異在0.01水平上顯著。

Different letters above the columns mean significant difference among different treatments at 0.01 level.

圖3干旱脅迫下蒙古冰草中miRNA的相對(duì)表達(dá)量

Fig.3RelativeexpressionlevelofmiRNAinA.mongolicumunderdroughtstress

2.4 與抗旱性相關(guān)的4個(gè)新預(yù)測(cè)miRNA的靶基因

利用Target Finder軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，amo-miR21、amo-miR44和amo-miR82各有1個(gè)靶基因，其分別編碼光合系統(tǒng)II中的蛋白、PPR家族蛋白和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的蛋白，amo-miR62有2個(gè)靶基因，編碼過氧化物還原酶和在線粒體中發(fā)揮作用的PPR蛋白家族。

在植物microRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫psRNATarget中，與模式植物擬南芥(A.thaliana)、煙草(N.tabacum)及禾本科作物大麥(H.vulgare)、小麥(T.aestivum)、水稻(O.sativa)、玉米(Z.mays)、二穗短柄草(B.distachyon)和豆科牧草蒺藜苜蓿(M.truncatula)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，這4個(gè)miRNA共有27個(gè)靶基因(表2)，且每個(gè)miRNA預(yù)測(cè)調(diào)控的靶基因數(shù)目不同。amo-miR62靶基因數(shù)最多，為9個(gè)，amo-miR21、amo-miR44和amo-miR82的靶基因數(shù)均為6個(gè)。盡管其中一部分靶基因沒有描述，但部分靶基因功能多種多樣，如光系統(tǒng)II反應(yīng)中心M蛋白、α/β超家族蛋白水解酶、葡萄糖胺N-酰基轉(zhuǎn)移酶、抗壞血酸過氧化物酶、轉(zhuǎn)座子基因、假想蛋白等，一些參與干旱逆境脅迫響應(yīng)過程(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)。

2.5 預(yù)測(cè)的miRNA靶基因同源性

對(duì)Target Finder預(yù)測(cè)的靶基因與psRNATarget在線預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，amo-miR21的靶基因與玉米Z.mays-GRMZM2G030695-T01的相似性指數(shù)為70.9%，與玉米Z.mays-GRMZM2- G055151-T01的相似性指數(shù)為84.2%，與小麥T.aestivum-CA679344的相似性指數(shù)高達(dá)95.6%，該基因注釋為光系統(tǒng)II反應(yīng)中心M蛋白；amo-miR44的靶基因與擬南芥A.thaliana-AT4G06540.1的相似性指數(shù)為41.4%，與苜蓿M.truncatula-Medtr7g047630.1的相似性指數(shù)最高，也僅為46.2%，與大麥H.vulgare-TC256962的相似性指數(shù)為29.6%，均較低；amo-miR62靶基因2與玉米Z.mays-GRMZM2 G085845_T01的相似度為31.7%，與小麥T.aestivum-CA610180的相似性指數(shù)為48.2%，與短穗二柄草B.distachyon-Bradi2g52000.1的相似性指數(shù)為28.9%，與水稻O.sativa-LOC_Os02g28530.1的相似性指數(shù)為28.6%，與小麥T.aestivum-CA610180的相似性指數(shù)為40.2%，均較低；而amo-miR62的靶基因1和小麥中預(yù)測(cè)到的靶基因T.aestivum-TC459743的相似性指數(shù)高達(dá)91.3%，該基因注釋為抗壞血酸過氧化物酶；amo-miR82的靶基因與小麥T.aestivum-TC461760的相似性指數(shù)高達(dá)68.6%，相似度較高，該基因注釋為醛氧化酶-2。這表明蒙古冰草amo-miR21和amo-miR82的靶基因及amo-miR62的靶基因1與小麥中預(yù)測(cè)到的靶基因存在同源性。

表2 Target Finder和psRNATarget預(yù)測(cè)的靶基因Table 2 Target genes predicted by Target Finder and psRNATarget

3 討 論

蒙古冰草是干草原和荒漠草原上抗旱性強(qiáng)的叢生禾草，亦是麥類作物遺傳改良的寶貴野生近緣種，挖掘野生蒙古冰草的抗旱基因資源對(duì)于拓寬麥類作物的遺傳基礎(chǔ)具有重要意義。干旱是農(nóng)作物生長發(fā)育最為嚴(yán)重的逆境脅迫之一，近年來大量研究報(bào)道表明，miRNA在干旱脅迫中起到重要調(diào)控作用，抗旱相關(guān)miRNA同作物遺傳改良中的新功能基因一樣重要，急需研究利用。RT-PCR是目前miRNA定量表達(dá)分析最常用且快速有效的方法之一[16]。本試驗(yàn)選取前期蒙古冰草高通量測(cè)序獲得的4個(gè)抗旱相關(guān)的miRNA，利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)其在不同干旱脅迫進(jìn)程中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62表達(dá)量在干旱脅迫15、18、21 d間差異不顯著，表明干旱15 d時(shí)蒙古冰草的miRNA表達(dá)為極限表達(dá)。隨著對(duì)蒙古冰草幼苗干旱脅迫處理天數(shù)的增加，amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，而amo-miR44的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，與前期的miRNA測(cè)序結(jié)果是一致的。根據(jù)MiRDeep軟件的保守性分析發(fā)現(xiàn)，amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62和amo-miR82的不同物種的相似miRNA分別為bdi-miR5180b[9]、ath-miR854a[24]、zma-miR164g-3p[25]和bdi-miR5066[26](相似性分別為42.0%、30.7%、26.13%和43.5%)，其中，bdi-miR5180b和bdi-miR5066未見有試驗(yàn)驗(yàn)證，zma-miR164g-3p和ath-miR854a響應(yīng)生物逆境脅迫。本試驗(yàn)中4個(gè)miRNAs在干旱脅迫響應(yīng)中的功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

miRNA的重要研究價(jià)值體現(xiàn)在其能夠調(diào)控靶基因的表達(dá)，預(yù)測(cè)和鑒定miRNA靶標(biāo)基因是分析miRNA功能的前提。因植物體內(nèi)miRNAs與其調(diào)控的靶基因序列近乎完全匹配，用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因的方法更方便。利用已開發(fā)的Target Finder、PatScan、psRNATarget等軟件，通過同源性搜索和在線軟件預(yù)測(cè)植物miRNA靶標(biāo)基因的方法得到了廣泛應(yīng)用[27]，如：Zhang等[28]利用在線預(yù)測(cè)軟件miRU(http://bioinofo3. noble. Org/ miRU. htm)對(duì)60個(gè)植物的miRNA靶基因預(yù)測(cè)得到了較好的結(jié)果，Kohli等[29]利用二代測(cè)序技術(shù)獲得了鷹嘴豆的122個(gè)保守miRNA和59個(gè)新miRNA，用psRNA-Target(http://plantgrn.noble.org /psRNATarget/)預(yù)測(cè)到358個(gè)靶基因。本試驗(yàn)用Target Finder和psRNA-Target分別成功地預(yù)測(cè)到5個(gè)和27個(gè)靶基因，同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)蒙古冰草amo-miR21的靶基因、amo-miR62的靶基因1和amo-miR82的靶基因與小麥的靶基因(T.aestivum-CA679344、T.aestivum-TC459743、T.aestivum-TC461760)存在較高的同源性(68.6%～95.6%)，靶基因功能依次注釋為光合系統(tǒng)II、過氧化物還原酶II、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的蛋白，它們與干旱逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)，這為下一步蒙古冰草抗旱相關(guān)miRNA及其靶基因的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

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DifferentialExpressionAnalysisofDrought-ResponsiveMicroRNAandPredictionofTheirTargetGenesinAgropyronmongolicumatSeedlingStage

MAYanhong,ZHANGXuting,YUXiaoxia,LIUXuting,GAOHui,YUZhuo
(Agronomy College,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot,Inner Mongolia 010019,China)

時(shí)間：2017-09-13

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170913.1138.010.html

S512.9；S330

A

1009-1041(2017)09-1168-07

2017-01-28

2017-07-18

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