何瑞鵬， 奉 杰， 田相利, 董雙林， 李海東

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

酪酸菌對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)、消化酶、血清抗氧化酶和溶菌酶活性的影響*

何瑞鵬， 奉 杰， 田相利**, 董雙林， 李海東

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

酪酸菌(Clostridiumbutyricum)是近年來(lái)新開發(fā)的益生菌菌種，具有多種重要的生理功能，但目前在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究相對(duì)較少。本文初步研究了飼料中添加不同濃度的酪酸菌CBYG01對(duì)珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀ ×Epinepheluslanceolatus♂)生長(zhǎng)、消化酶、血清抗氧化酶和溶菌酶活性的影響。以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組，在基礎(chǔ)飼料中分別添加濃度為1×107cfu/kg(CB1組)、1×109cfu/kg(CB2組)、1×1011cfu/kg(CB3組)的酪酸菌活菌菌體以及1×109cfu/kg(CBM組)的酪酸菌發(fā)酵液。石斑魚初始體重為(42.91±1.47) g，養(yǎng)殖60天后，分別測(cè)定其生長(zhǎng)、消化酶活性以及血清超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、溶菌酶(LSZ)活性等指標(biāo)。研究表明，CB3組石斑魚末體重、特定生長(zhǎng)率、攝食量和食物轉(zhuǎn)化效率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，胃蛋白酶、腸道胰蛋白酶、脂肪酶和前腸淀粉酶活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，胃蛋白酶、前腸脂肪酶和前腸淀粉酶活性顯著高于CB1和CB2組(P<0.05)，而與CBM組無(wú)顯著差異(P>0.05)。CB3組石斑魚血清SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，GPx、CAT和LSZ活性顯著高于CB1、CB2組和對(duì)照組(P<0.05)，SOD、CAT和LSZ活性與CBM組無(wú)顯著差異(P>0.05)；CBM組石斑魚血清SOD、CAT、GPx和LSZ活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；CB2組GPx和LSZ活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。研究結(jié)果表明，飼料中補(bǔ)充添加不同濃度的酪酸菌活菌菌體和發(fā)酵液對(duì)珍珠龍膽石斑魚的生長(zhǎng)、消化酶活性和非特異性免疫酶活性具有不同的促進(jìn)效果，其中以添加1×1011cfu/kg的活菌菌體效果最佳。

珍珠龍膽石斑魚；酪酸菌；生長(zhǎng)；消化酶；抗氧化酶；溶菌酶

珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀ ×Epinepheluslanceolatus♂)又稱龍虎斑或珍珠斑，是用棕點(diǎn)石斑魚(E.fuscoguttatus♀)和鞍帶石斑魚(E.lanceolatus♂)培育出來(lái)的雜交新品種石斑魚[1-2]，具有適應(yīng)能力強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)細(xì)膩等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，已成為我國(guó)南方沿海、香港以及馬來(lái)西亞等東南亞國(guó)家重要的石斑魚養(yǎng)殖品種[4-5]。同時(shí)，由于性格溫馴和耐受能力強(qiáng)等特點(diǎn)，珍珠龍膽石斑魚適合池塘、網(wǎng)箱和工廠化等多種養(yǎng)殖模式，特別適合高密度養(yǎng)殖[6]。但是，隨著工廠化等高密度養(yǎng)殖模式的迅速發(fā)展，導(dǎo)致了細(xì)菌、病毒等傳染病的頻繁發(fā)生，繼而給育苗和養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7-9]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖傳統(tǒng)的預(yù)防和治療疾病的方法多以投喂抗生素、注射疫苗、消毒等方式為主。近年來(lái)，由于抗生素濫用造成交叉抗藥性、藥物殘留等，益生菌作為抗生素的重要替代品之一，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可定義為“通過(guò)不同的作用機(jī)制對(duì)宿主或其生存環(huán)境產(chǎn)生有益影響的活性或滅活的微生物”[10]。目前，許多研究已證明益生菌具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高免疫力、增強(qiáng)抗病力等作用，成為最有潛力的抗生素替代品之一[10-12]。

益生菌主要的作用機(jī)理為：通過(guò)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)抑制致病菌生長(zhǎng)；產(chǎn)生抑菌物質(zhì)排斥致病菌；改善水質(zhì)；提高機(jī)體抗氧化和免疫功能；自身提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及通過(guò)產(chǎn)生消化酶促進(jìn)宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等[13-14]。研究表明，飼料中添加不同水平的益生菌可提高青魚(Mylopharyngodonpiceus)[15]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[16-19]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[20]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[21]、金頭鯛(Sparusaurata)[13]和點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[7,22]等的生長(zhǎng)、消化酶活性、抗氧化酶活性和免疫水平。然而，有關(guān)益生菌對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)、消化酶和抗氧化酶活性等的研究尚未見報(bào)道。

酪酸菌(Clostridiumbutyricum)又名丁酸梭菌，是我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2009年7月批準(zhǔn)的新一代微生物飼料添加劑[23]，有關(guān)其研究主要集中在人和畜禽陸生養(yǎng)殖動(dòng)物[24]，目前在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究還少見報(bào)道[25-26]。酪酸菌為嚴(yán)格厭氧菌，同時(shí)因產(chǎn)生芽孢，所以具有高活性、高穩(wěn)定性的特點(diǎn)。此外，它還是對(duì)常用抗生素具有耐受性的腸道正常菌群，易與其它益生菌共生，可糾正腸內(nèi)的菌群紊亂，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等[27-29]，因此具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。本研究以珍珠龍膽石斑魚為研究對(duì)象，初步探討了飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)、消化酶活性以及血清抗氧化酶和溶菌酶活性的影響，以期為其在珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)所使用的酪酸菌(菌株編號(hào)：CBYG01)為中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)室篩選、保存的菌種。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

石斑魚養(yǎng)殖使用的飼料為愛樂配合飼料(ALLER AQUA)，含粗蛋白51%、脂肪12%、灰分1.1%。

研究前期與宏濟(jì)堂文旅園區(qū)相關(guān)負(fù)責(zé)人進(jìn)行多次溝通，包括參觀園區(qū)與面對(duì)面訪談，共同籌劃問(wèn)卷設(shè)計(jì)與表達(dá)形式。確定調(diào)查顧客和企業(yè)員工以分層對(duì)比，采用同樣問(wèn)卷且內(nèi)容涵蓋中醫(yī)藥特色和旅游基礎(chǔ)設(shè)施：地理和交通、環(huán)境結(jié)構(gòu)與布局、價(jià)格、中醫(yī)藥特色資源、安全與衛(wèi)生、設(shè)施與配套、服務(wù)水平、文化與形象、總體滿意程度等，這些信息匯總對(duì)本研究奠定基礎(chǔ)。問(wèn)卷調(diào)查在2018年2月完成，收回有效問(wèn)卷共367份，其中包括員工問(wèn)卷179份，游客問(wèn)卷188份。期間還訪談?dòng)慰秃凸ぷ魅藛T，收集規(guī)章制度、園區(qū)介紹、游客須知、員工手冊(cè)、圖片視頻、微信等內(nèi)容，盡可能全面細(xì)致把握信息材料。

處理組飼料：按一定濃度將酪酸菌活菌菌體或發(fā)酵液菌液均勻噴灑在石斑魚基礎(chǔ)飼料的表面，揉搓陰干，再在其表面包裹一層褐藻酸鈉和魚油(比例同對(duì)照組飼料)，分別制成酪酸菌活菌菌體添加量1×107cfu/kg(標(biāo)記為CB1)、1×109cfu/kg(標(biāo)記為CB2)和1×1011cfu/kg(標(biāo)記為CB3)以及酪酸菌發(fā)酵液添加量為1×109cfu/kg(標(biāo)記為CBM)的4種實(shí)驗(yàn)飼料，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

酪酸菌活菌菌體的制備：酪酸菌接種于強(qiáng)化培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉浸膏3 g，硫酸銨1 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.5 g，K2HPO44 g，蒸餾水1 000 mL)中，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)24 h，顯微鏡計(jì)數(shù)，確定細(xì)菌濃度，然后5 000 r/min離心10 min，無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋制備1×1011、1×109、1×107cfu/kg 的菌懸液。

酪酸菌發(fā)酵液制備：酪酸菌接種于裝有強(qiáng)化培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉浸膏3 g，硫酸銨1 g，硫酸錳0.2 g，硫酸鎂0.5 g，K2HPO44 g，蒸餾水1 000 mL)的5 L三角瓶中，37 ℃厭氧發(fā)酵培養(yǎng)48 h，顯微鏡計(jì)數(shù)，確定細(xì)菌濃度，5 000 r/min離心10 min然后用0.22 μm濾膜過(guò)濾后的發(fā)酵液重懸菌體，制成1×109cfu/kg的菌懸液，其主要成分為酪酸菌及其代謝物。

1.3 實(shí)驗(yàn)魚及飼養(yǎng)管理

本研究所用的珍珠龍膽石斑魚購(gòu)于山東萊州明波水產(chǎn)有限公司，運(yùn)回后在玻璃缸水槽中28 ℃水溫條件下暫養(yǎng)15 d。暫養(yǎng)期間，每天8:00和16:00飽食投喂基礎(chǔ)飼料。暫養(yǎng)結(jié)束后饑餓24 h，以MS-222(40 mg/L)麻醉，挑選125尾健康、規(guī)格一致的石斑魚(42.91 g± 1.47 g)，隨機(jī)分為5組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5尾魚，于規(guī)格為(50 cm×30 cm×35 cm)的玻璃缸中養(yǎng)殖60 d。實(shí)驗(yàn)期間，每天8:00和16:00飽食投喂實(shí)驗(yàn)飼料，投喂前后及時(shí)收集殘餌和糞便，75 ℃烘干保存。

每天換水一次，換水量為3/4。實(shí)驗(yàn)期間，水溫保持(28±0.5) ℃，鹽度29±1，pH=8.0±0.1，連續(xù)增氧，溶氧保持在5 mg/L以上。

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在中國(guó)海洋大學(xué)鰲山衛(wèi)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2015年8月23日至10月21日。

1.4 樣品采集及處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，MS-222(40 mg/L)麻醉，稱量并記錄每尾魚的體重。每個(gè)處理取5尾魚，用1 mL無(wú)菌注射器尾靜脈取血置于1.5 mL離心管中，4 ℃冰箱靜置24 h后，3 000 r/min離心10 min，取上層血清于-80 ℃冰箱保存。然后將魚解剖，取胃和腸道，并將腸道分為前腸和后腸，置于離心管中液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.5 測(cè)試指標(biāo)及測(cè)定方法

1.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)魚的初始體重和末體重，以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中統(tǒng)計(jì)的投喂量和殘餌量，計(jì)算特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate，SGR)，日攝食量(Food consumption，F(xiàn)C)和食物轉(zhuǎn)化效率(Food conversion efficiency，F(xiàn)CE)。

特定生長(zhǎng)率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%，

日攝食量(FC，g·d-1·ind-1)=Cw/(N·t)，

食物轉(zhuǎn)化效率(FCE)=(Wt-W0)/Cw×100%。

式中：W0和Wt為魚的初始體重和末體重(g)；Cw為總攝食量(g)；N為魚的數(shù)量；t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)。

1.5.2 消化酶 稱取適量胃和腸道組織， 并記下其準(zhǔn)確重量， 按照組織樣品與生理鹽水 1∶9 的比例加入生理鹽水， 并在冰水浴條件下勻漿， 制成 10% 組織勻漿液，4 ℃條件下 3 000 r/min 離心 10 min， 小心吸取上清液分裝， 進(jìn)行測(cè)定。胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin)、脂肪酶(Lipase)、淀粉酶(Amylase)活性以及組織總蛋白含量等指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定完成，酶活力單位為U·mgpro-1或U·gpro-1。

1.5.3 血清抗氧化酶和溶菌酶 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)和溶菌酶(Lysozyme，LSZ)等血清酶活性均采用南京建成生物研究所的試劑盒測(cè)定，樣品前處理、試劑配制和測(cè)定步驟嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書執(zhí)行，酶活力單位為U·mL-1。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan's多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析了前后腸消化酶活性差異，以P<0.05時(shí)為差異顯著，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

2.1.1 生長(zhǎng)及特定生長(zhǎng)率 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚生長(zhǎng)的影響見表1。所有處理組珍珠龍膽石斑魚的初始體重與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。CB3處理組石斑魚末體重和特定生長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而CB1、CB2、CB3、CBM各實(shí)驗(yàn)組之間沒有顯著差異(P>0.05)。隨菌體濃度的增加，酪酸菌菌體添加處理組石斑魚末體重和特定生長(zhǎng)率逐漸增大。CBM處理組石斑魚的末體重和特定生長(zhǎng)率大于CB1、CB2處理組，小于CB3處理組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.1.2 日攝食量及食物轉(zhuǎn)化效率 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚日攝食量和食物轉(zhuǎn)化效率的影響見表1。CB3實(shí)驗(yàn)組石斑魚的日攝食量和食物轉(zhuǎn)化效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，CB1、CB2、CB3、CBM處理組之間沒有顯著差異(P>0.05)。隨菌體濃度的升高，酪酸菌菌體添加處理組石斑魚日攝食量和食物轉(zhuǎn)化效率逐漸升高。CBM處理組石斑魚的日攝食量和食物轉(zhuǎn)化效率高于CB1、CB2處理組，低于CB3處理組，但差異不顯著(P>0.05)。

表1 珍珠龍膽石斑魚的生長(zhǎng)、日攝食量和食物轉(zhuǎn)化效率Table 1 Growth, food consumption and food conversion efficiency of hybrid grouper

注： CB1、CB2、CB3和CBM為分別添加濃度為1×107、1×109和1×1011cfu/kg酪酸菌活菌菌體和1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液飼料投喂的石斑魚，對(duì)照為不添加任何益生菌飼料投喂的石斑魚；同一列中標(biāo)不同字母的數(shù)據(jù)表示相互之間差異顯著(P<0.05)。

Note: CB1, CB2 and CB3 were hybrid grouper fed diet with 1×107, 1×109and 1×1011cfu/kg live cell ofClostridiumbutyricum; CBM was hybrid grouper fed diet with 1×109cfu/kgClostridiumbutyricumfermentation broth; The control was hybrid grouper fed diet without probiotics; Data with different superscripts letters at the same column means significant difference each other (P<0.05).

①Treatments；②Initial body weight；③Final body weight；④Special growth rate；⑤Food consumption；⑥Food conversion efficiency；⑦Control

2.2 消化酶

2.2.1 胃蛋白酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚胃蛋白酶活性的影響見圖1。CB3處理組石斑魚胃蛋白酶活性顯著高于CB1、CB2和對(duì)照組(P<0.05)。CBM處理組石斑魚胃蛋白酶活性高于CB1、CB2處理組和對(duì)照組，低于CB3處理組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 胰蛋白酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚胰蛋白酶活性的影響見圖2。CB3處理組石斑魚前腸和后腸胰蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照組和其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。對(duì)照組和CB1、CB2、CBM處理組之間前后腸胰蛋白酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組石斑魚前腸胰蛋白酶活性均顯著高于后腸胰蛋白酶活性(P<0.01)。

(CB1、CB2、CB3和CBM為分別添加濃度為1×107、1×109和1×1011cfu/kg酪酸菌活菌菌體和1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液飼料投喂的石斑魚，對(duì)照為不添加任何益生菌飼料投喂的石斑魚；標(biāo)有不同字母的數(shù)據(jù)表示相互之間差異顯著(P<0.05)。下同。CB1, CB2 and CB3 were hybrid grouper fed diet with 1×107, 1×109and 1×1011cfu/kg live cell ofClostridiumbutyricum; CBM was hybrid grouper fed diet with 1×109cfu/kgClostridiumbutyricumfermentation broth; Control was hybrid grouper fed diet without probiotics; Data with different letters at the same column means significant difference each other (P<0.05).The same as follows.)

圖1 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚胃蛋白酶活性的影響
Fig.1 Effect of probiotics on the pepsin activity of hybrid grouper

(標(biāo)有不同大小寫字母分別表示不同處理之間后腸和前腸酶活性差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有雙星號(hào)的數(shù)據(jù)表示同一處理前腸和后腸之間酶活性差異極顯著(P<0.01)，單星號(hào)表示差異顯著(P<0.05)。圖3、4同圖2。Data with different letters at the same column means significant difference each other (P<0.05). Bars with different lowercase or uppercase letters mean significant difference (P<0.05) in proximal and distal intestine, respectively. Bars with two asterisks mean extremely significant difference (P<0.01) between foreintestine and hindintestine, while one means significant difference (P<0.05). It is same for Fig.3 and Fig.4.)

圖2 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚胰蛋白酶活性的影響
Fig.2 Effects of probiotics on the trypsin of hybrid grouper

2.2.3 脂肪酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚脂肪酶活性的影響見圖3。CB3處理組石斑魚前腸脂肪酶活性顯著高于CB1、CB2和對(duì)照組(P<0.05)。CBM處理組石斑魚前腸脂肪酶活性與CB1、CB2、CB3處理組和對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。CB3處理組后腸脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組和CB1處理組(P<0.05)，CBM處理組后腸脂肪酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與CB1、CB2和CB3處理組差異不顯著(P>0.05)。

圖3 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚脂肪酶活性的影響Fig.3 Effect of probiotics on the lipase activity of hybrid grouper

2.2.4 淀粉酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚淀粉酶活性的影響見圖4。CB3處理組石斑魚前腸淀粉酶活性顯著高于CB1、CB2和對(duì)照組(P<0.05)。CBM處理組石斑魚前腸淀粉酶活性與CB1、CB2、CB3處理組和對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。CB1、CB2、CB3和CBM處理組與對(duì)照組之間石斑魚后腸淀粉酶活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于前腸淀粉酶活性(P<0.05)。

圖4 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚淀粉酶活性的影響Fig.4 Effect of probiotics on the amylase activity of hybrid grouper

2.3 血清抗氧化酶和溶菌酶

2.3.1 超氧化物歧化酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚血清SOD活性的影響見圖5。CB3和CBM處理組SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與CB1、CB2處理組差異不顯著(P>0.05)。

圖5 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清超氧化物歧化酶活性的影響Fig.5 Effect of probiotics on the serum superoxide dismutase activity of hybrid grouper

2.3.2 過(guò)氧化物酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚血清CAT活性的影響見圖6。CB3處理組CAT活性顯著高于CB1、CB2和對(duì)照組(P<0.05)，CBM處理組CAT活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，CB1、CB2、CBM處理組之間CAT活性差異不顯著(P>0.05)。

圖6 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清過(guò)氧化物酶活性的影響

2.3.3 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚血清GPx活性的影響見圖7。CB2、CB3和CBM處理組GPx活性顯著高于CB1和對(duì)照組(P<0.05)，且CB2、CB3、CBM處理組之間GPx活性差異顯著(P<0.05)，活性高低依次為CB3>CBM>CB2。

圖7 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響Fig.7 The effect of probiotics on the serum glutathione peroxidase activity of hybrid grouper

2.3.4 溶菌酶 飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液對(duì)石斑魚血清LSZ活性的影響見圖8。CB3處理組LSZ活性顯著高于CB1、CB2和對(duì)照組(P<0.05)。CBM處理組LSZ活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但與CB1、CB2、CB3處理組差異不顯著(P>0.05)。

圖8 益生菌添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清溶菌酶活性的影響Fig.8 Effect of probiotics on the serum lysozyme activity of hybrid grouper

3 討論

3.1 酪酸菌對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長(zhǎng)的影響

益生菌增進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的作用已受到廣泛研究。張彩云等[30]研究發(fā)現(xiàn)，1‰的酪酸菌能顯著提高斷奶仔豬的平均日增重，當(dāng)添加量提高到3‰時(shí)，料重比顯著下降。賈聰慧等[23]研究表明，飼料中添加108cfu/kg的酪酸菌能顯著提高肉雞的生長(zhǎng)性能。Yang等[31]、Zhang等[32]和Liao等[33]均報(bào)道飼料中添加合適劑量的酪酸菌可顯著提高肉雞的平均日增重，且促長(zhǎng)效果與抗生素添加組無(wú)顯著差異。目前，關(guān)于酪酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物上的應(yīng)用研究還少見報(bào)道，公開報(bào)道僅見于酪酸菌對(duì)鮸魚(Miichthysmiiuy)影響的相關(guān)研究[25]。Song等[25]發(fā)現(xiàn)1012cfu/g的酪酸菌可顯著提高鮸魚的總增重、相對(duì)增重率、食物利用率和特定生長(zhǎng)率，且作用效果與酪酸菌劑量呈正相關(guān)。在本研究中，添加1×1011cfu/kg的酪酸菌CBYG01活菌菌體顯著提高了石斑魚的末體重、特定生長(zhǎng)率、日攝食量和食物轉(zhuǎn)化效率。然而，也有少數(shù)研究表明，飼料添加酪酸菌對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能并不產(chǎn)生影響。例如，Zhang等[34]報(bào)道酪酸菌對(duì)肉雞的生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響。這些結(jié)果的差異性可能與動(dòng)物種類、基礎(chǔ)飼料、益生菌添加劑量和動(dòng)物自身的健康狀況有關(guān)[23,33,35]。從現(xiàn)有的報(bào)道看，酪酸菌在水產(chǎn)動(dòng)物上應(yīng)用的適宜劑量可能要遠(yuǎn)高于陸生動(dòng)物，例如在豬和肉雞上的適宜添加量多在108～109cfu/kg，而在鮸魚、珍珠龍膽石斑魚和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvanamei，未發(fā)表數(shù)據(jù))上適宜的濃度則達(dá)1011～1012cfu/kg。酪酸菌促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的準(zhǔn)確作用機(jī)制尚無(wú)法確定，但可能與其生物學(xué)特性有密切關(guān)系。酪酸菌能夠產(chǎn)生孢子，耐受胃液、膽汁液和消化液的作用，從而有利于其在腸道內(nèi)定植，還能產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制病原菌及腐敗菌在腸道內(nèi)異常增殖而促進(jìn)有益菌的增殖發(fā)育，進(jìn)而糾正腸道菌群紊亂，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡[36-37]。同時(shí)，酪酸菌主要代謝產(chǎn)物丁酸對(duì)維持動(dòng)物腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性和促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖與成熟發(fā)揮重要作用[23]。此外，酪酸菌產(chǎn)生的氨基酸、B族維生素和維生素K，能促進(jìn)VE吸收，補(bǔ)充必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；分泌淀粉酶、糖苷酶和纖維素酶等酶類促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[23-24,36-37]。

3.2 酪酸菌對(duì)珍珠龍膽石斑魚消化酶活性的影響

研究表明，在飼料中添加適量的益生菌如酵母、芽孢桿菌和乳酸菌等，可提高水產(chǎn)動(dòng)物的消化酶活性，從而改善魚類對(duì)飼料的消化，提高了飼料的利用水平[41]。Tovar-Ramirez等[42]報(bào)道，飼料中添加活性酵母(Debaryomyceshansenii)有效提高了歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)幼魚的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等消化酶活性。而Wang和Xu[20]則發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌(Bacillussp.)作為益生菌添加劑能顯著提高鯉魚(Cyprinuscarpio)的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等消化酶活性。Suzer等[13]也報(bào)道了飼料中添加乳酸菌(Lactobacillusspp.)能顯著提高了金頭鯛(Sparusaurata)幼魚腸道堿性磷酸酶、亮氨酸-丙氨酸肽酶和胰腺蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。本研究結(jié)果表明，添加1×1011cfu/kg的酪酸菌活菌顯著提高了石斑魚的胃蛋白酶、腸道胰蛋白酶、腸道脂肪酶和前腸淀粉酶的活性。由此推測(cè)，添加酪酸菌同添加酵母、芽孢桿菌、乳酸菌等益生菌相似，可以有效提高魚類消化器官的消化酶活性，促進(jìn)食物大分子分解為易于被細(xì)胞吸收的小分子，從而提高對(duì)蛋白、脂肪和淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。酪酸菌是腸道有益菌群，在消化道中定植后萌發(fā)生長(zhǎng)成具有代謝活性的“營(yíng)養(yǎng)型”細(xì)胞后，可以調(diào)節(jié)腸道微生物群，改善腸道微生態(tài)環(huán)境以及腸道的生理活動(dòng)。同時(shí)，微生物通過(guò)在腸道內(nèi)分泌多種酶類，進(jìn)入宿主腸道的“酶池”中，從而提高宿主腸道消化酶活性[41]。值得注意的是，在腸道不同部位，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性存在明顯差異。Wang[17]報(bào)道了在草魚(Ctenopharyngodonidella)魚苗的益生菌研究中發(fā)現(xiàn)，草魚前腸蛋白酶活性顯著高于后腸，而后腸纖維素酶活性則顯著高于前腸。從本研究結(jié)果看，石斑魚前腸胰蛋白酶活性顯著高于后腸，后腸淀粉酶活性顯著高于前腸，前腸脂肪酶活性也高于后腸，這表明不同的腸道部位對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力可能存在差異，如前腸可能對(duì)蛋白和脂肪等物質(zhì)的消化能力高于后腸，而后腸可能對(duì)淀粉等物質(zhì)的消化能力高于前腸，這種差異是否與珍珠龍膽石斑魚的肉食性有關(guān)尚需進(jìn)一步研究確定。

3.3 酪酸菌對(duì)珍珠龍膽石斑魚血清抗氧化和溶菌酶活性的影響

細(xì)胞在正常代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧，而細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)及時(shí)清理細(xì)胞內(nèi)的自由基，二者一般處于動(dòng)態(tài)平衡中。但當(dāng)體內(nèi)自由基過(guò)多時(shí)，就會(huì)對(duì)細(xì)胞DNA、蛋白和細(xì)胞膜脂類造成損傷[38-39]。超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶類，主要功能是清除體和分解體內(nèi)的自由基。已有的研究表明，乳酸菌和雙歧桿菌作為益生菌添加劑具有抗氧化功能，能夠抑制脂質(zhì)氧化和活性氧累積，從而減弱動(dòng)物氧化脅迫[39]。然而，有關(guān)酪酸菌添加對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化功能影響的研究還尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，添加1×1011cfu/kg的酪酸菌菌體和1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液能顯著提高血清抗氧化酶活性。研究表明，酪酸菌能夠產(chǎn)生 T-SOD 和還原型輔酶Ⅰ/還原型輔酶Ⅱ(NADH /NADPH) 過(guò)氧化物酶，可以直接清除體內(nèi)活性氧[23,40]。此外，其代謝產(chǎn)物丁酸和氫氣則具有通過(guò)增加抗氧化酶活性和減少活性氧產(chǎn)物，進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化脅迫的功能。酪酸菌抗氧化作用的機(jī)制可能與丁酸和氫氣影響抗氧化酶的基因表達(dá)、減少活性氧產(chǎn)生、刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)減少炎癥反應(yīng)和氧化損傷等原因有關(guān)[33]。

溶菌酶是脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分之一，能水解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖而使之細(xì)胞裂解，從而殺滅病原微生物。它存在于大多數(shù)魚類的黏液、淋巴組織、血清和其它組織液中，在病原菌入侵宿主時(shí)，發(fā)揮重要的防御功能[25]。很多研究表明，魚類攝入添加益生菌的飼料時(shí)，其血清溶菌酶活性會(huì)升高[7,25-26]。Song等[25]在其研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加酪酸菌可顯著提高鮸魚血清溶菌酶活性，且隨添加劑量的增加溶菌酶活性也呈升高趨勢(shì)。Pan等[26]也發(fā)現(xiàn)鮸魚攝食有活性或滅活的酪酸菌添加的飼料之后，黏液和血清中溶菌酶活性均顯著升高。本研究中，添加1×109、1×1011cfu/kg的酪酸菌活菌菌體以及1×109cfu/kg酪酸菌發(fā)酵液后，石斑魚血清溶菌酶活性均顯著升高，表明酪酸菌能夠有效提高石斑魚的非特異性免疫反應(yīng)。

4 結(jié)語(yǔ)

飼料中添加酪酸菌活菌菌體和酪酸菌發(fā)酵液可以促進(jìn)珍珠龍膽石斑魚的生長(zhǎng)，提高消化酶、血清抗氧化酶和溶菌酶的活性。酪酸菌活菌菌體的最佳添加量為1×1011cfu/kg，而酪酸菌發(fā)酵液的最佳添加濃度有待進(jìn)一步研究確定。

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Abstract:Clostridiumbutyricumis a new potential probiotic bacterium with important physiological function, but fewer studies about it in aquatic organisms have been done. This study investigated the effects of dietary supplement ofC.butyricumCBYG01 on the growth and activities of digestive and serum antioxidant enzymes and lysozyme of hybrid grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂). Four treatments were designed,i.e., hybrid grouper fed diet with 1×107, 1×109and 1×1011cfu/kg live cells ofC.butyricum(CB1, CB2 and CB3), respectively; hybrid grouper fed diet with 1×109cfu/kg C. butyricum fermentation broth (CBM); and hybrid grouper fed diet without probiotics (Control). After 60 days of feeding trail, the body weight, specific growth rate, food consumption and food conversion efficiency of fish in CB3 were significantly higher than those of control (P<0.05) as well as the pepsin, trypsin, lipase activities and amylase activity in proximal intestine. The pepsin activity, lipase and amylase activities in proximal intestine of fish in CB3 were significantly higher relative to CB1 and CB2 (P<0.05), while which were not significantly different with those in CBM (P>0.05). The superoxide dismutase of fish in CB3 was significantly higher than that of control (P<0.05), the glutathione peroxidase, catalase and lysozyme activities were significantly higher than those of CB1, CB2 and control (P<0.05), while the superoxide dismutase, catalase and lysozyme activities were not significantly different with those of CBM (P>0.05). The glutathione peroxidase and lysozyme activities of fish in CB2 were significantly higher in comparison with control (P<0.05). These findings indicated thatC.butyricum-supplementation could improve the growth and the activities of digestive and serum antioxidant enzymes and lysozyme of hybrid grouper, and the optimal dosage was 1×1011cfu/kg.

Key words:Epinephelusfuscoguttatus(♀) ×E.lanceolatus(♂);Clostridiumbutyricum; growth; digestive enzyme; antioxidant enzyme; lysozyme

責(zé)任編輯 朱寶象

Effects of Dietary Supplementation ofClostridiumbutyricumon the Growth and Activities of Digestive and Serum Antioxidant Enzymes and Lysozyme of Hybrid Grouper (Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)

HE Rui-Peng, FENG Jie, TIAN Xiang-Li, DONG Shuang-Lin, LI Hai-Dong

(The Key Laboratory of Mariculture (Ocean University of China), Ministry of Education, Qingdao 266003, China)

S917.1

A

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山東省杰出青年基金項(xiàng)目(JQ201009)；廣東省海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項(xiàng)(GDHY2013-B03-005)； 青島市民生科技計(jì)劃項(xiàng)目(15-9-2-96-NSH)資助 Supported by the Program for Excellent Youth Foundation of Shandong Province (JQ201009); The Specialized Project of Regional Demonstration for the Innovation and Development of Marine Economy of Guangdong Province (GDHY2013-B03-005); The Scientific and Technical Programs for People's Livelihood of Qingdao (15-9-2-96-NSH)

2016-12-07；

2017-03-27

何瑞鵬(1988-)，男，博士生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究。E-mail:heruip.happy@163.com

** 通訊作者：E-mail:xianglitian@ouc.edu.cn