陳小明 何福林 李志忠 袁志輝

(1. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；2. 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425199；3. 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；4. 湖南省恒偉藥業(yè)股份有限公司，湖南 永州 425199；5. 永州市畜牧水產(chǎn)局，湖南 永州 425199)

產(chǎn)銀杏內(nèi)酯內(nèi)生真菌的分離與鑒定

陳小明1,2,3,4何福林1,2,3李志忠5袁志輝1,2,3

(1. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；2. 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425199；3. 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；4. 湖南省恒偉藥業(yè)股份有限公司，湖南 永州 425199；5. 永州市畜牧水產(chǎn)局，湖南 永州 425199)

利用組織塊培養(yǎng)法從健康的銀杏根、莖中分離得到116株內(nèi)生真菌。通過高效液相色譜(HPLC)法對內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物進行分析，最終篩選出1株能夠產(chǎn)銀杏內(nèi)酯的內(nèi)生真菌，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其發(fā)酵液和菌絲體中總內(nèi)酯產(chǎn)量約為11.4 mg/L。形態(tài)學(xué)特征和真菌rDNA間隔序列(internal transcribed spacer，ITS)的系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，該菌株屬于毛霉屬，為產(chǎn)銀杏內(nèi)酯內(nèi)生真菌的首次報道。

銀杏；內(nèi)生真菌；內(nèi)酯類化合物；鑒定

Abstract： In the present study, the method of tissue culturing was used to isolate the endophytic fungi from healthy ginkgo roots and stems. After repeated separation and purification, 116 Ginkgo endophytes were isolated. Metabolites of these fungi were preliminarily analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), and a ginkgolide producing endophyte strain was finally screened out. The production of ginkgolides by this strain was more than 11.4 mg/L. The endophytic fungi strain was identified asMucorspp. by morphology characteristics and phylogenetic analysis of internal transcribed spacer (ITS), and It was the first report in the ginkgolides producing endophytic fungus fromGinkgobiloba.

Keywords：Ginkgobiloba; endophytes; ginkgolides; identification

植物內(nèi)生微生物是指在植物組織內(nèi)部度過其全部或部分生命周期的所有微生物[1-2]。內(nèi)生微生物對藥用植物具有重要的誘導(dǎo)作用[3]，能轉(zhuǎn)化植物次生代謝產(chǎn)物[4]，可促進植物有效成分的合成和積累[5]。且部分植物內(nèi)生微生物可體外培養(yǎng)，通過基因工程或工業(yè)發(fā)酵手段可大量獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次生物質(zhì)，使得內(nèi)生微生物成為活性天然產(chǎn)物資源開發(fā)和研究的熱點之一[6]。

銀杏是一種古老的藥食兩用植物[7]，多個部位均可入藥，如銀杏果中的某些蛋白質(zhì)具有抗氧化劑和抗菌的作用[8]。最常見的入藥物質(zhì)是銀杏提取物(Extracts ofGinkgobiloba, EGb)，其主要有效成分是黃酮類和萜內(nèi)酯類化合物[9]，且EGb是目前得到銀杏內(nèi)酯的唯一途徑[10]，且受限于含量低、分離純化困難和來源單一。銀杏內(nèi)生微生物具有合成與宿主植物相同或相似的活性成分的功能[11]，但產(chǎn)銀杏內(nèi)酯內(nèi)生真菌的分離研究僅集中在中國少數(shù)幾家單位。嚴鑄云等從銀杏組織中分離到的內(nèi)生真菌發(fā)酵液進行檢測發(fā)現(xiàn)，4株曲霉屬、1株盤長孢屬、1株色串孢屬和1株組絲菌屬共7株內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯C或其類似物[12]；在此基礎(chǔ)上進一步篩選出一株銀杏內(nèi)酯B產(chǎn)量較高的煙曲霉原變種FG052，總內(nèi)酯產(chǎn)量為0.13 mg/mL[13]；對該菌株進行紫外線和亞硝酸復(fù)合誘變并優(yōu)化發(fā)酵條件后，其產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了56%[14]。包飛等[15]從分離到的109株銀杏內(nèi)生真菌中篩選出一株產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B的卵形孢霉屬菌株，發(fā)酵產(chǎn)量為9.3 mg/L。Qian等[10]也獲得了一株產(chǎn)白果內(nèi)酯的銀杏內(nèi)生真菌PestalotiopsisuvicolaGZUYX13。Cui等[16]篩選到一株同時產(chǎn)銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的內(nèi)生菌株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)SY0056。而對于自然界常見且已在銀杏組織中檢測到的毛霉屬(Mucorsp.)真菌，尚未見其具有產(chǎn)萜內(nèi)酯類物質(zhì)能力的報道。本研究以銀杏為研究對象，利用組織塊分離法從根、莖等部位分離內(nèi)生真菌，并從中篩選出產(chǎn)銀杏內(nèi)酯的菌株，為后期利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)內(nèi)酯類化合物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏組織材料：取自湖南省永州市雙牌縣桐子坳村，樹約為800年齡的銀杏根、莖組織。樣品放入經(jīng)滅菌的廣口瓶，在24 h內(nèi)運至實驗室進行處理。內(nèi)生真菌分離采用PDA培養(yǎng)基和馬丁氏(MMN)培養(yǎng)基，用前按30 mg/L加入鏈霉素。發(fā)酵采用不加瓊脂的PDA培養(yǎng)液，即PDB培養(yǎng)液。

銀杏內(nèi)酯A、B、C標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

白果內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品：上海哈靈生物科技有限公司；

KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、乙醇、鹽酸、鏈霉素、葡萄糖、瓊脂：分析純；

乙酸乙酯、甲醇：色譜純。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀杏組織的表面消毒 參考文獻[17]的方法，略作修改，分別選取新鮮銀杏根、莖，用清水洗凈后，流水沖洗0.5 h，放入裝有蒸餾水的燒杯中。

洗凈的材料各取5 g，首先用體積分數(shù)為75%酒精漂洗1 min，無菌水沖洗3次；再用0.1%的次氯酸鈉漂洗(根1.5 min，莖0.5 min)，無菌水沖洗3次；最后一次洗液置于滅菌的小燒杯中。

表面消毒后的材料在空白PDA培養(yǎng)基上滾動數(shù)圈，將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)2 d，檢測消毒效果。

1.2.2 銀杏內(nèi)生真菌的分離、純化和保藏 經(jīng)無菌處理后，樣品表面用無菌濾紙吸干，在超凈工作臺內(nèi)，用滅菌的剪刀將莖剪成約0.5 cm長小段；根剪成大小適中的組織塊。每個PDA和MMN平板放置4～5塊組織塊，將切口面置于培養(yǎng)基上。將無菌處理過程中樣品的最后一次清洗液涂于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，作為對照，分別編號記錄。操作完成后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄內(nèi)生微生物生長情況。

待樣品表面或邊緣長出菌絲后，在超凈工作臺中用無菌剪刀或挑針挑取菌絲轉(zhuǎn)接到新的對應(yīng)培養(yǎng)基上，進行編號。繼續(xù)置于28 ℃恒溫箱中閉光培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況。

待接種的菌體萌發(fā)后，用菌絲頂端分離法對分離得到的內(nèi)生真菌進行多次傳代直至獲得典型的純化菌落。將已純化的菌株分別轉(zhuǎn)移至固體斜面培養(yǎng)基上，每株保存2支斜面，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌株生長旺盛時，取出置4 ℃保藏。1～2月后轉(zhuǎn)接入新的斜面。

1.2.3 檢測樣品的制備 用打孔器在長滿菌絲的培養(yǎng)基上打孔，將其接入裝有100 mL PDA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，每瓶接入3個菌絲塊；置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，28 ℃，120 r/min培養(yǎng)5～7 d，3層紗布過濾分離菌體和發(fā)酵液。

取過濾后的發(fā)酵液50 mL，加入等體積乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入5 mL甲醇溶解固體物質(zhì)，并用0.22 μm濾膜過濾待用；菌絲體在55 ℃烘箱中烘干后取2 g于研缽中，加入10 mL 50%甲醇溶液充分研磨，加入20 mL乙酸乙酯進行萃取，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mL甲醇溶解固體物質(zhì)，并用0.22 μm濾膜過濾待用。

1.2.4 樣品中內(nèi)酯類物質(zhì)的測定 采用HPLC-UV法銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算，標(biāo)準(zhǔn)品為銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯。

1.2.5 產(chǎn)銀杏內(nèi)酯內(nèi)生真菌的鑒定 采用形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析方法進行鑒定。

(1) 形態(tài)學(xué)特征分析：挑取純化的菌株尖端菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后觀察菌落的大小、顏色等形態(tài)特征；然后采用插片法進行菌絲體制片，在顯微鏡下觀察菌絲體和分生孢子的形態(tài)等特征，根據(jù)《真菌鑒定手冊》[18]進行初步鑒定。

(2) ITS序列分析：采用CTAB法提取目標(biāo)菌株的基因組DNA[19]。ITS序列特異性引物[20](北京六合華大基因科技有限公司合成)為ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACC-TGCGG-3’和ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增片段與pMD19-T載體[寶生物工程(大連)有限公司]連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，陽性克隆經(jīng)菌落PCR鑒定正確后，交由北京六合華大基因科技有限公司測序。測序結(jié)果提交NCBI進行序列比對分析，選取同源性最高的前幾條序列，利用MEGA7.0軟件[21]，基于鄰接法(Neighbor Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap檢驗值≥50%，1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)銀杏內(nèi)酯內(nèi)生真菌的篩選

從銀杏根、莖組織中共分離出內(nèi)生真菌116株，其中根莖中分別為76，40株。采用HPLC對發(fā)酵液和菌絲提取物樣品進行分析。由圖1、2可知，菌株Gbph112的發(fā)酵液和菌絲提取物中均含有與標(biāo)準(zhǔn)品銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯相對應(yīng)的色譜峰，表明菌株Gbph112可產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯，并且白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B和C大部分分泌到細胞之外，而銀杏內(nèi)酯A有相當(dāng)一部分存在于菌絲細胞內(nèi)。除此之外，HPLC色譜圖上還存在對應(yīng)3種標(biāo)準(zhǔn)品之外的吸收峰，說明發(fā)酵液和菌體中還含有其它種類的化合物。標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定菌株Gbph112的發(fā)酵液和菌絲提取物中內(nèi)酯類物質(zhì)總量分別為(7.60±0.12)，(3.80±0.06) mg/L。

白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C保留時間分別為3.05，3.41，3.81，4.48 min

圖1 銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜

Figure 1 HPLC chromatograms of four ginkgolides standards

圖2 銀杏內(nèi)生真菌Gbph112產(chǎn)內(nèi)酯類物質(zhì)的HPLC圖譜Figure 2 HPLC chromatograms of the gingkolides produced by Ginkgo biloba endophytic fungus strain Gbph112

2.2 產(chǎn)銀杏內(nèi)酯菌株的鑒定

菌株Gbph112菌落及其分生孢子呈現(xiàn)毛霉屬真菌典型特征見圖3。在28 ℃于PDA平板上生長較快，菌落形狀多樣，初期為疏松白色菌絲，中后期菌絲逐漸生長密集，顏色漸變?yōu)闇\黃色，產(chǎn)生孢子后菌落整體呈淺黃至褐色茸毛狀，菌落背面呈黃色。氣生菌絲無隔，呈分枝狀，無匍匐菌絲和假根；菌絲體上直接生出總狀分枝的孢囊梗，頂端著生球形孢子囊，無囊托，產(chǎn)圓形、光滑的孢囊孢子。其ITS序列通過BLAST搜索后獲取相關(guān)種屬的ITS序列，用MEGA 7.0軟件按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，菌株Gbph112與Mucoramphibiorum的序列最大相似性達到99%，見圖4。綜合菌落、菌體形態(tài)和ITS序列分析信息，將該菌株鑒定為毛霉屬。

圖3 菌株Gbph112菌落及其分生孢子形態(tài)

圖4 基于ITS序列的菌株Gbph112與其相關(guān)種系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論

本研究從銀杏根、莖組織中分離出內(nèi)生真菌116株。通過HPLC檢測分析，從中篩選出1株產(chǎn)銀杏內(nèi)酯內(nèi)生真菌，即菌株Gbph112，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示其為毛霉屬真菌，為首次從銀杏組織中分離篩選到的能夠產(chǎn)銀杏內(nèi)酯的毛霉屬菌株。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定該菌發(fā)酵液和菌絲體中總內(nèi)酯產(chǎn)量約為11.4 mg/L，高于包飛等[15]分離到的卵形孢霉屬菌株，但低于嚴鑄云等[12-14]篩選和誘變之后的煙曲霉原變種FG052。

研究[22]表明，銀杏提取物中含有30余種黃酮化合物和萜類、酚類、微量元素及氨基酸等有效成分，其研究和藥效利用已較為成熟。同時，對銀杏提取物的植物病原菌如柑橘青霉病菌[23]的抑制活性研究也正逐步開展。而利用內(nèi)生真菌生產(chǎn)藥用活性成分才剛剛起步，許多基礎(chǔ)性工作有待深入研究。就銀杏內(nèi)生微生物而言，雖然本研究篩選到的產(chǎn)銀杏內(nèi)酯內(nèi)生真菌相對來說有較高的產(chǎn)量，但目前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生微生物極少達到工業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。所以，應(yīng)繼續(xù)擴大內(nèi)生微生物分離的數(shù)量和種類，篩選產(chǎn)量更高且植物體外傳代產(chǎn)量穩(wěn)定的菌株，對分離得到菌株進行生理特性和菌體內(nèi)內(nèi)酯類物質(zhì)代謝途徑的研究，并通過誘變選種、生長培養(yǎng)基設(shè)計、發(fā)酵條件和工藝優(yōu)化等方法和手段，提高微生物發(fā)酵內(nèi)酯類物質(zhì)的產(chǎn)量及內(nèi)生微生物植物體外傳代的穩(wěn)定性，使利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)內(nèi)酯類物質(zhì)成為可能。

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Isolation and identification of ginkolides-producing endophytic fungi from Ginkgo biloba Linn.

CHEN Xiao-ming1,2,3,4HEFu-lin1,2,3LIZhi-zhong5YUANZhi-hui1,2,3

(1.CollegeofChemistryandBioengineeringinHunanUniversityofScienceandEngineering,Yongzhou,Hunan425199,China; 2.HunanProvincialEngineeringResearchCenterforGinkgoBiloba,Yongzhou,Hunan425199,China; 3.KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationofAdvantagePlantsResourcesinHunanSouth,Yongzhou,Hunan425199,China; 4.HunanHengweiPharmaceuticalCo.,Ltd.,Yongzhou,Hunan425199,China; 5.YongzhouBureauofAnimalHusbandryandFishery,Yongzhou,Hunan425199,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.007

湖南省教育廳科研項目(編號：15C0585)；湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室開放基金項目(編號：XNZW15C11)

陳小明，男，湖南科技學(xué)院講師，碩士。

袁志輝(1981—)，男，湖南科技學(xué)院副教授，碩士。 E-mail：zhh_yuan@126.com

2017—05—22