張海容， 趙 婷

(忻州師范學院生化分析技術研究所,材料與計算化學山西省高等學校 重點實驗室，山西忻州 034000)

室溫磷光(Room Temperature Phosphorimetry,RTP)法[1 - 8]因具有簡單快速、取樣量少、靈敏度高、檢出限低和選擇性好，受到分析工作者的廣泛關注。在環(huán)糊精(CD)-RTP法中,人們發(fā)現(xiàn)一些不含重原子的第三組分[9 - 10]分子， 也可與CD、磷光分子形成三元包合物產(chǎn)生磷光發(fā)射。由于磷光發(fā)射受外界因素如CD及第三組分用量、酸堿度、除氧劑等影響，傳統(tǒng)的磷光測定一般是通過單因素實驗來確定最佳實驗條件，無法考慮不同影響因素之間的相互作用，更無法預測最優(yōu)實驗條件下磷光發(fā)射強度。響應面法(Response Surface Methodology,RSM)法是一種流行的優(yōu)化過程參數(shù)的有效工具，它集合了傳統(tǒng)的單因素法與正交試驗法優(yōu)點，具有實驗周期短、求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點[11 - 12]，可用于優(yōu)化外界因素及其交互作用對響應值的影響。應用正交設計優(yōu)化室溫磷光分析測定條件已有報道[13 - 15]，但未見用RSM優(yōu)化RTP實驗條件報道。本文初次研究了RSM優(yōu)化α-溴代萘的RTP實驗條件，為改進RTP分析特性提供了一種新途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

F-4500 熒光光譜儀(日本，日立公司)；AB204-N電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司 )；KQ-100DB型數(shù)控超聲清洗器(昆山市榮華儀器制造有限公司)。

α-溴代萘(α-BrN，上海試劑一廠)，β-環(huán)糊精(β-CD，上海化學試劑采購供應站)，NaOH(天津市福晨化學試劑廠)，無水Na2SO3(天津市北辰方正試劑廠)，環(huán)己烷(天津市福晨化學試劑廠)，KH2PO4(北京紅星化工廠)，甲醇(天津市風船化學試劑科技有限公司)，以上試劑皆分析純。β-CD溶液：用二次蒸餾水配制成0.01 mol/L。磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.28)：稱取KH2PO40.68 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液29.10 mL，用水稀釋至100 mL。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

移取適量α-BrN標準溶液，3.5 mL 0.01 mol/Lβ-CD溶液，1.5 mL磷酸鹽緩沖溶液，6 μL環(huán)己烷，以及1.2 mL 0.01 mol/L Na2SO3溶液，用水定容后測量磷光強度。儀器測量條件：激發(fā)/發(fā)射狹縫：10/20 nm,測定波長：λex/λem=337/525 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 β -CD溶液用量對α -BrN磷光強度的影響

按照實驗方法，考察0.01 mol/Lβ-CD溶液的用量對α-BrN磷光強度的影響，結(jié)果表明隨著β-CD溶液用量的增加，α-BrN的磷光強度逐漸升高，當用量達到3.5 mL時，α-BrN的磷光強度達到最大。

2.2 環(huán)己烷用量對α -BrN磷光強度的影響

在上述優(yōu)化條件下，在10 mL比色管中，分別加入0、2、4、6、8、10、15 μL的環(huán)己烷，定容后測其磷光強度。結(jié)果表明，隨著環(huán)己烷濃度的增加，α-BrN的磷光強度逐漸升高，當達到1.2 mL時，其磷光強度出現(xiàn)了一次大的突躍。

2.3 Na2SO3濃度對α -BrN磷光強度的影響

考察了Na2SO3溶液濃度對磷光強度的影響。結(jié)果表明，隨著Na2SO3濃度的增加，α-BrN的磷光強度逐漸升高，當Na2SO3濃度達到1.2 mL時，其磷光強度達到最大。

2.4 RSM法優(yōu)化實驗條件

2.4.1RSM分析因素水平的選取綜合單因素實驗的結(jié)果，選取β-CD濃度、環(huán)己烷濃度、Na2SO3濃度三個因素進行中心組合設計(Central Composite Design,CCD)，利用Design Expert 7.1.3軟件進行數(shù)據(jù)擬合，以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，因子編碼及水平見表1。

表1 RSM分析因素水平實驗設計Table 1 Factors level and experiment design by the response surface analysis

2.4.2RSM分析方案及結(jié)果以A=(a-3.5)/0.5，B=(b-8)/2，C=(c-1)/0.2為自變量，以α-BrN的磷光強度為響應值(Y)，進行RSM分析實驗。中心組合設計的結(jié)果及其預測值見表2。

表2 RSM分析方案及實驗結(jié)果Table 2 The response surface analysis and the experimental results

通過對實驗數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸，建立回歸方程:Y=+6044.40+75.38×A+73.38×B+62.25×C-162.25×A×B-28.00×A×C-30.00×B×C-242.08×A2-348.58×B2+151.82×C2。對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，本實驗所選實驗模型差異極顯著(模型的P值<0.05),說明實驗方法可靠；變異系數(shù)較低，說明實驗有良好的穩(wěn)定性。模型相關系數(shù)R2=0.9424，說明有94.24% 的實驗數(shù)據(jù)與預測模型一致，該模型可以用于α-BrN室溫磷光分析和預測。調(diào)節(jié)相關系數(shù)(R2)與預測相關系數(shù)值差異較大，表明方程需要進行進一步的優(yōu)化。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

從回歸方程模型因變量的方差分析可知，模型的一次項A(P=0.0319)差異極顯著，而一次項B(P=0.5535)、C(P=0.1622)差異不顯著；交互項AB(P=0.0747)、 AC(P=0.0843) 差異顯著，交互項BC(P=0.4161)差異不顯著；二次項A2(P=0.0002)差異極顯著，B2(P=0.008)、C2(P=0.0089)差異顯著。表明β-CD濃度對α-BrN的磷光發(fā)光的主效應顯著，且β-CD濃度、環(huán)己烷用量、Na2SO3濃度之間存在交互作用。由表3可知，各實驗因素的主效應關系為：β-CD濃度>Na2SO3濃度>環(huán)己烷用量。

2.4.3RSM圖分析利用Design Expert 7.1.3軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的RSM。從圖1結(jié)果可知，當環(huán)己烷濃度不變時，隨著β-CD濃度的增加，α-BrN的磷光強度先快速増加，后緩慢下降；當β-CD濃度不變時，隨著環(huán)己烷濃度的增大，α-BrN的磷光強度亦呈現(xiàn)先增大，后逐漸下降趨勢。結(jié)果與單因素實驗結(jié)果相吻合。從圖2結(jié)果可知，當β-CD濃度不變時，隨著Na2SO3濃度的增加，α-BrN的磷光強度呈現(xiàn)先增大后下降趨勢。當Na2SO3濃度不變時，β-CD濃度的變化對磷光的影響與Na2SO3濃度影響類似，這與單因素實驗分析時的結(jié)果相吻合。

圖1 β -CD濃度和環(huán)己烷用量對α -BrN的磷光強度的RSM圖Fig 1 The response surface plots of β -CD concentration and cyclohexane amount on α -BrN phosphorescence

圖2 亞硫酸鈉濃度和β -CD濃度對α -BrN的磷光強度的RSM圖Fig.2 The response surface plots of Na2SO3 and β -CD concentration on α -BrN phosphorescence

從圖3結(jié)果可知，環(huán)己烷濃度不變時，隨著Na2SO3濃度的增加，α-BrN的磷光強度呈現(xiàn)先緩慢增大，后逐漸下降趨勢。當Na2SO3濃度不變時，隨著環(huán)己烷濃度的增加，α-BrN的磷光強度亦呈現(xiàn)先快速增加，隨后很快下降趨勢。與單因素實驗分析時的結(jié)果相吻合。α-BrN的磷光強度的變化曲率顯示環(huán)己烷濃度主效應大于Na2SO3濃度，與統(tǒng)計結(jié)果相符。

圖3 Na2SO3濃度和環(huán)己烷用量對α -BrN的磷光強度的RSM圖Fig.3 The response surface plots of Na2SO3 concentration and cyclohexane amount on α -BrN phosphorescence

2.4.4最優(yōu)工藝條件為了進一步確證最佳條件值，對回歸方程取一階偏導等于零，可以得到曲面的最大點，求導方程整理后得：75.38-162.25×B-28.00×C-242.08×2×A=0；73.38-162.25×A+30.00×C-348.58×2×B=0；62.25-28.00×A+30.00×B+151.82×2×C=0。求解方程，最后求得β-CD 的濃度為3.4×10-3mol/L,環(huán)己烷濃度為0.78 μL/mL，Na2SO3濃度為9.6×10-2mol/L，此時磷光強度理論最大值為6 067.6。經(jīng)過中心組合優(yōu)化，修正后測定α-BrN條件為：β-環(huán)糊精的濃度為3.4×10-3mol/L,環(huán)己烷濃度為0.8 μL/mL，Na2SO3濃度為9.5×10-2mol/L。實驗測得的磷光強度為6 153，與理論值相對誤差為1.4%。說明優(yōu)化室溫磷光測量條件參數(shù)相對可靠。

2.5 工作曲線

在最佳實驗條件下，對比測定了單因素法、RSM優(yōu)化α-BrN的工作曲線，其分析特性見表4。結(jié)果表明，對比單因素實驗，RSM優(yōu)化法測定α-BrN的室溫磷光的線性范圍寬、檢出限低。

表4 α -溴代萘室溫磷光的分析特性比較Table 4 The comparison of the analytical characteristics of α -BrN RTP

3 結(jié)論

本研究以RSM優(yōu)化α-BrN RTP實驗條件。與傳統(tǒng)的單因素實驗法相比，其分析檢出限低，線性范圍寬，對改進實際樣品RTP分析特性有一定的參考價值。