王曉燕 張建華 劉玉英 尉玉杰 王俊超 董煥聲*

仔豬腹瀉大腸桿菌菌種保存的研究

王曉燕①①?gòu)埥ㄈA①劉玉英①尉玉杰①王俊超①董煥聲*①

（①青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 青島 2661091 ①山東省萊陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)局）

本文研究了4株仔豬腹瀉大腸桿菌菌株不同代次培養(yǎng)的菌液，制成甘油菌后，保存在-20 6℃?zhèn)€月，分析細(xì)菌的菌落形態(tài)、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)；4批凍干保存的菌種，經(jīng)過36個(gè)月的保存后，分析細(xì)菌的菌落形態(tài)、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。本文為大腸桿菌病的致病機(jī)理及疾病的潛伏期提供了理論依據(jù)。

仔豬 大腸桿菌 保存

仔豬大腸桿菌病是由大腸桿菌引起的一種急性高度致死性傳染病。本病最常發(fā)生于初生7日齡以內(nèi)的哺乳仔豬，因哺乳仔豬下痢，機(jī)體迅速脫水，導(dǎo)致全身衰弱而死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由于仔豬生長(zhǎng)期和病原菌血清型的差異，此病可分仔豬黃痢及仔豬白痢兩種，豬場(chǎng)傳染上該病很難根除。本文針對(duì)已經(jīng)分離得到的大腸桿菌菌株進(jìn)行保存期的試驗(yàn)，觀察大腸桿菌分離凍存后的活性及生化特性。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）甘油菌：C835491、C835492、

C835493、C8354944個(gè)批次；C836441、C836442、

C836443、C8364444個(gè)批次；C839181、C839182、

C839183、C8391844個(gè)批次。凍干菌：C835491、

C835492、C835493、C8354944個(gè)批次；C836441、

C836442、C836443、C8364444個(gè)批次；C839181、

C839182、C839183、C8391844個(gè)批次。（2）試驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠、仔豬。（3）發(fā)酵管：葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、靛基質(zhì)、枸櫞酸7種，購(gòu)于杭州天和微生物制劑有限公司。

1.2 方法 試驗(yàn)菌液分別抽樣，加入20%的甘油，分裝若干小瓶，2ml/瓶，-20℃冰箱凍結(jié)，保存1、3、6、12個(gè)月。凍干菌種-20℃冰箱凍結(jié)，保存1、3、6、12、24、36個(gè)月。定期將被試驗(yàn)的菌種取出檢測(cè)。取出的菌種檢測(cè)方法：將菌種劃線接種到Minca培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20h，觀察菌落特征，挑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體的形態(tài)。將生長(zhǎng)好的單一菌落無污染的挑到7種發(fā)酵管中

37℃培養(yǎng)12h，完成吲哚試驗(yàn)；M.R.試驗(yàn)；VP試驗(yàn)試驗(yàn)；H2S試驗(yàn)。血清學(xué)特性檢測(cè)：用相對(duì)應(yīng)的因子血清和培養(yǎng)的細(xì)菌作玻板凝集試驗(yàn)，觀察玻板凝集試驗(yàn)的結(jié)果[1-2]。毒力測(cè)定：將3種血清型致病性大腸桿菌應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)肉湯繁殖12h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，再用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，以麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)濃度至約3×106cfu/ml，采用30日齡ICR小鼠(體重約26g)隨機(jī)分成2組，以灌胃的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)行接種，0.2ml/鼠，對(duì)照組注射滅菌生理鹽水0.2ml/鼠，實(shí)驗(yàn)組小鼠均于24h開始出現(xiàn)精神委靡，飲、食欲下降，打堆，大部分小鼠尿色變深[3]；死亡多發(fā)生于接種后36～72h。對(duì)照組未見異常。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，所有死亡小鼠的腹腔內(nèi)均有漿液性滲出；脾臟壞死；肝臟邊緣壞死，肺臟無明顯病變；腸道充滿黃色液體，部分小鼠的腸系膜出現(xiàn)水腫[3-4]。死亡率為87%。從各組死亡小鼠的十二指腸采樣接種麥康凱培養(yǎng)基，均能分離到大腸桿菌。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 甘油保存菌種 在-20℃冰箱保存1、3、6、12個(gè)月的大腸桿菌甘油菌，經(jīng)過再次培養(yǎng)，完全符合大腸桿菌的菌落形態(tài)、菌落特征，菌落光滑圓整，菌種生化特性鑒定如表1所示。

表1 保存1～12個(gè)月再培養(yǎng)的菌種生化特性

用相對(duì)應(yīng)的因子血清，做玻板凝集試驗(yàn)，結(jié)果：各保存期再次培養(yǎng)的菌種，均能凝集相對(duì)應(yīng)的因子血清，完全符合大腸桿菌的血清學(xué)特性。毒力檢測(cè)結(jié)果：試驗(yàn)組小鼠均于24h開始出現(xiàn)精神委靡，飲、食欲下降，打堆，大部分小鼠尿色變深；死亡多發(fā)生于接種后36～72h。從各組死亡小鼠的十二指腸采樣接種麥康凱培養(yǎng)基，均能分離到大腸桿菌。免疫原性結(jié)果：按本規(guī)程制成疫苗，達(dá)到成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 凍干菌種 在-20℃冰箱保存1、3、6、12、24、36個(gè)月的凍干菌種，經(jīng)過再次培養(yǎng)，完全符合大腸桿菌的菌落形態(tài)、菌落特征，菌落光滑圓整，菌種生化特性鑒定如表2所示。

表2 保存1～36個(gè)月再培養(yǎng)的菌種生化特性

用相對(duì)應(yīng)的因子血清，做玻板凝集試驗(yàn)，結(jié)果：各保存期再次培養(yǎng)的菌種，均能凝集相對(duì)應(yīng)的因子血清，完全符合大腸桿菌的血清學(xué)特性。

3 結(jié)論

仔豬腹瀉大腸桿菌3個(gè)菌株的4個(gè)不同代次培養(yǎng)的菌液制備的4批甘油菌在-20℃保存6個(gè)月，細(xì)菌的菌落形態(tài)、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)；4批凍干保存的菌種，在-20℃冰箱中保存，經(jīng)過36個(gè)月，細(xì)菌的菌落形態(tài)、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

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1007-1733(2017)10-0006-02

2017–06–09）