姚君亮

摘 要 目的：研究SMCC在不同溶液中的降解情況。方法：將SMCC分別用ACN、DMA和DMSO等有機溶劑溶解并制成一定濃度（約3 mg/ml）的儲備液，再用不同的緩沖液稀釋10倍并混勻作為供試品溶液，采用高效液相色譜法觀察主峰的降解情況。結(jié)果：對于SMCC的水解，堿性環(huán)境以及DMSO或DMA的存在有顯著的促進作用，而酸性環(huán)境以及ACN的存在則有一定的抑制作用。結(jié)論：交聯(lián)反應(yīng)可在弱堿環(huán)境下以DMA/DMSO作溶劑，而色譜分析則可在酸性環(huán)境下以ACN作溶劑。

關(guān)鍵詞 SMCC ADC 水解 HPLC

中圖分類號：TQ464.7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）19-0073-05

A study on degradation behavior of SMCC in different solutions

YAO Junliang*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the degradation phenomenon of SMCC in different solutions. Methods： Stock solutions of SMCC were prepared in ACN， DMA and DMSO， respectively， to give a final concentration of 3 mg/ml. Working solutions were prepared by 10-fold dilution of stock solutions in several buffer solutions. The degradation of SMCC was monitored by an HPLC method. Results： The hydrolysis of SMCC could be accelerated with the introduction of basic buffer solution or DMA/DMSO， while it could be hindered with the introduction of acidic solution or ACN. Conclusion： Cross-linking reaction could be performed in weakly alkaline condition by using solvent of DMA/DMSO， while HPLC analysis could be carried out in acidic condition by using solvent of ACN.

KEY WORDS SMCC； ADC； hydrolysis； HPLC

抗體-藥物偶聯(lián)劑（antibody-drug conjugates， ADC），是由單克隆抗體和化學(xué)藥物分子偶聯(lián)而成的新型生物制劑[1-3]，是近年來發(fā)展迅速的一類腫瘤靶向治療藥物[4-5]。ADC通常由一個抗體（antibody），一個彈頭藥物（cytotoxic drug）和一個活性連接子（linker）組成[6]（圖1）。其中，連接子通常需要具備以下特性：一是進入目標(biāo)細(xì)胞前能夠保證ADC在血漿中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；二是進入細(xì)胞后能夠使藥物順利釋放[7-8]。按照細(xì)胞中的藥物釋放行為，可將連接子分為兩大類：可剪切型（Cleavable Linkers）和非剪切型（Non-cleavable Linkers）[9]。前者通過細(xì)胞內(nèi)化學(xué)環(huán)境的變化或酶解作用使其與藥物間的化學(xué)鍵斷裂，從而釋放完整的藥物分子；而后者則是通過蛋白酶的水解作用將抗體部分降解，剩余的藥物分子上通常依然保留著連接子和部分氨基酸殘基[7]。目前僅有的兩個批準(zhǔn)上市的ADC藥物，Adcetris[10]和Kadcyla[11]，分別采用了可剪切型連接子vc（valine-citrulline）和非剪切型連接子琥珀酰亞胺-4-（N-馬來酰亞胺）環(huán)已烷-1-1羥酸酯（succinimidyl-4-（N-maleimidomethyl） cyclohexane-1-carboxylate，SMCC）。本文將以SMCC為研究對象進行相關(guān)的試驗和討論。

Kadcyla（T-DM1）原研藥廠Genentech曾對多個連接子進行了篩選，最終SMCC脫穎而出，這也說明其在T-DM1中有獨到之處[12]。如圖2所示，SMCC主要由三部分組成：右側(cè)為NHS（N-琥珀酰亞胺）活性酯，負(fù)責(zé)與抗體分子中的伯胺生成酰胺鍵結(jié)合；左側(cè)為馬來酰亞胺基，負(fù)責(zé)與藥物分子中的巰基發(fā)生特異性交聯(lián)結(jié)合；中間為環(huán)己烷，可通過位阻效應(yīng)降低其水解作用[7]。雖然其結(jié)構(gòu)特征和交聯(lián)機理已得到了廣泛的研究[13-14]，但有關(guān)其交聯(lián)反應(yīng)化學(xué)環(huán)境以及色譜分析條件的研究卻鮮見報端。因此，本文通過分析化學(xué)的手段初步模擬探討了SMCC在各種介質(zhì)中的穩(wěn)定性，以期對交聯(lián)工藝的篩選和優(yōu)化以及分析和檢測方法的開發(fā)提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SMCC（博瑞生物醫(yī)藥（蘇州）股份有限公司，批號：20150812）；乙腈（Fisher，HPLC級，批號：158031，ACN）；磷酸（Sigma，HPLC級，批號：STBF-7157V）；DMA（Sigma，99.8%，批號：SHBG0465V）；DMSO（Merck，HPLC級，批號：K46802100530）；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，純度為AR或GR；水為自制高純水。endprint

1.2 實驗儀器

XS105DU電子天平（梅特勒），PB-10酸度計（賽多利斯），高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 mm），流動相A為0.05%的磷酸水溶液、B為乙腈，洗脫梯度見表1。柱溫30 ℃，流速1.0 ml/min，

1.3.2 樣品制備與測定方法

1）SMCC母液 取SMCC樣品約60 mg，精密稱定，置于20 ml容量瓶中，用乙腈/DMA/DMSO（視考察條件而定）溶解并稀釋至刻度，混勻后備用。

3）測定方法 用移液管準(zhǔn)確移取SMCC母液適量，再用PBS緩沖液稀釋10倍（SMCC濃度為0.3 mg/ml），混勻后迅速進樣，記錄色譜圖，每隔0.5 h進樣1次，觀察SMCC隨著時間的變化情況。

4）計算和作圖 將所得圖譜中色譜峰的峰面積與0 h時主峰的峰面積進行對比，以所得比值對時間（h）作圖，觀察主峰/雜峰的相對含量隨時間的變化趨勢。

2 結(jié)果

SMCC在常溫下不吸潮，不溶于水、甲醇和乙醇，易溶于乙腈，DMSO，DMA等有機溶劑。SMCC和抗體交聯(lián)時需要在水溶液中進行，所以先要用有機溶劑制成母液，待反應(yīng)時再加入反應(yīng)液。本研究采用若干有機溶劑聯(lián)合PBS水溶液，模擬考察其在交聯(lián)環(huán)境中的降解情況。

2.1 SMCC在DMA-H2O/PBS中的變化

將DMA配制的SMCC母液分別用緩沖液A、B、C和H2O稀釋10倍后，在樣品瓶中連續(xù)進樣，記錄SMCC主峰面積的變化情況，所得實驗結(jié)果如圖3所示（圖中緩沖液A、B、C和H2O中情況分別用■、●、△和▼表示）。由圖3可知，SMCC在四種溶液體系里都發(fā)生了明顯的降解，而程度卻明顯不同：在DMAbuffer A和DMA-H2O中降解較緩慢，而在DMA-buffer B和DMA-buffer C中降解極為顯著。上述結(jié)果初步說明SMCC對堿性PBS環(huán)境極其敏感，中性次之，酸性最惰。同時，Buffer B和C的情況說明，鉀和鈉離子類型對其降解影響甚微。

2.2 SMCC在ACN/DMX/H2O中的變化

為了進一步闡明SMCC的降解機制，我們也研究了其在不含PBS緩沖液時主峰的變化。如圖4所示，SMCC在ACN-DMA和ACN-H2O體系中穩(wěn)定無降解，而在DMA-H2O和DMSO-H2O均出現(xiàn)了明顯降解。說明在無水參與時，SMCC在上述有機溶劑中至少6 h內(nèi)穩(wěn)定；有水參與時，ACN條件下依然穩(wěn)定，而DMA和DMSO條件下不穩(wěn)定。因此可以推斷ACN能夠抑制SMCC在水中降解，而DMA和DMSO則促進其降解，說明SMCC在水中的降解跟母液溶劑有很大的關(guān)系。

2.3 SMCC在ACN-PBS中的變化

在得知ACN可能會抑制SMCC在純水中的降解之后，我們又對酸性和堿性PBS緩沖液中的情況進行了對比研究（圖5）。從圖5可以看出，SMCC在ACN-buffer A中基本無降解，在ACN-buffer B和ACN-buffer C中降解劇烈?？梢夾CN的存在的確可以抑制SMCC的降解，只不過在酸性至中性條件下顯著，堿性條件下不明顯。

2.4 SMCC在ACN-NH4 PBS中的變化

對于PBS緩沖鹽的選擇，除了上述實驗用到的鉀鹽和鈉鹽之外，我們也考察了銨鹽（Buffer D和E）對SMCC降解的影響。圖6中的（●）和（▲）分別表示ACN-buffer D和ACN-buffer E中SMCC主峰的變化趨勢。與ACN-H2O（■）中相比，SMCC在pH 4.0的ACNNH4 PBS體系中出現(xiàn)了較為明顯的降解，而當(dāng)磷酸銨鹽的pH為7.0時，SMCC發(fā)生了劇烈降解，在1 h內(nèi)主峰甚至完全消失。這一結(jié)果表明，銨鹽對SMCC穩(wěn)定性的影響要遠大于鉀鹽和鈉鹽，因此可以推斷銨離子或游離氨可能直接參與了其降解反應(yīng)。

2.5 SMCC降解雜質(zhì)統(tǒng)計

上述實驗中我們主要考察了SMCC在多種溶液環(huán)境中主峰的變化趨勢，在此本文將進一步對其降解雜質(zhì)進行簡單的研究。表2中列出了各降解實驗中產(chǎn)生雜質(zhì)的相對保留時間，結(jié)果表明SMCC的降解雜質(zhì)主要有4種，相對保留時間分別為0.16，0.42，0.60和0.67，我們依次命名為Imp-1，Imp-2，Imp-3和Imp-4。為了更直觀地展示降解情況，我們將各條件下反應(yīng)2 h后SMCC主峰和雜質(zhì)峰的含量作柱形圖對比（圖7）。圖中顯示，除了DMA-ACN、ACN-H2O和ACN-buffer A之外，SMCC在其他條件下均有降解，只是雜質(zhì)產(chǎn)生情況各有不同，說明其在不同溶液中的降解機理可能有所差異。endprint

3 討論

如前所述，我們通過高效液相色譜法分別研究了SMCC在多種溶液環(huán)境中的降解情況。總體來看，其降解反應(yīng)只在有水相存在時才會發(fā)生，因此可以推斷該反應(yīng)屬于水解反應(yīng)，這一點也可以通過其結(jié)構(gòu)特點加以印證。SMCC分子中兩側(cè)的NHS酯和馬來酰亞胺都可以在一定條件下發(fā)生水解，從而阻礙交聯(lián)進程，因此在與抗體和藥物交聯(lián)時要盡量控制SMCC的水解程度。

實驗中，我們引入了不同的有機溶劑（DMA，DMSO，can）、水和緩沖溶液（buffer A-F），所有最終的反應(yīng)液中均含90%的水相和10%的有機相。結(jié)果表明SMCC的水解不僅與水相有關(guān)，也和有機相密切相關(guān)，當(dāng)有機相為DMA/DMSO，水相為堿性時，水解更容易發(fā)生。推測可能是因為DMA/DMSO在NHS酯水解過程中起催化劑的作用，而堿性則利于水解反應(yīng)平衡的正向移動。

不同的反應(yīng)產(chǎn)生不同的雜質(zhì)，因此可以根據(jù)雜質(zhì)類型逆推水解機制。配合表2和圖7，我們可以大致將反應(yīng)類型分為以下幾類：①只生成Imp-1和Imp-4的反應(yīng)，推測可能是NHS酯的水解，因為其活性較馬來酰亞胺強，在弱酸性至中性時就可以發(fā)生；②同時生成Imp-1、Imp-3和Imp-4的反應(yīng)，推測可能是NHS酯和馬來酰亞胺同步水解的反應(yīng)，因為在堿性較強時出現(xiàn)，強堿環(huán)境突破馬來酰亞胺的穩(wěn)定臨界點，其水解動力學(xué)曲線非線性亦側(cè)面折射出可能為兩步反應(yīng)；③出現(xiàn)雜質(zhì)Imp-2的反應(yīng)，可能是NH3參與的酰胺化反應(yīng)，因為在pH 7.0的銨溶液中含量極高，而在其他條件下均未出現(xiàn)。由于本研究旨在探討適宜的檢測和交聯(lián)環(huán)境，并非研究詳細(xì)的降解機理，因此未對各雜質(zhì)做進一步的鑒定研究。

綜上所述，對于交聯(lián)過程來說，一方面應(yīng)避免強堿和銨鹽環(huán)境，以防水解過快而無法交聯(lián)；另一方面也不宜在酸性條件進行，使得SMCC活性低交聯(lián)困難。同時有機助溶劑則宜采用DMA和DMSO等既不易使蛋白變性又能高效溶解SMCC的溶劑。對于色譜分析來說，稀釋劑宜采用ACN等溶解度高且有利于SMCC結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的溶劑，流動相則宜控制在酸性，不可用銨鹽。此外，我們在實驗過程中還發(fā)現(xiàn)，SMCC在反應(yīng)時需注意其濃度和環(huán)境溫度，在溫度較低濃度較高時容易產(chǎn)生絮狀沉淀，大大影響反應(yīng)進程。

參考文獻

[1] Papachristos A， Pippa N， Demetzos C， et al. Antibody-drug conjugates： a mini-review. The synopsis of two approved medicines[J]. Drug Deliv， 2016， 23（5）： 1662-1666.

[2] Gebleux R， Casi G. Antibody-drug conjugates： current status and future perspectives[J]. Pharmacol Ther， 2016， 167： 48-59.

[3] Bakhtiar R. Antibody drug conjugates[J]. Biotechnol Lett， 2016， 38（10）： 1655-1664.

[4] Polakis P. Antibody drug conjugates for cancer therapy[J]. Pharmacol Rev， 2016， 68（1）： 3-19.

[5] Thomas A， Teicher BA， Hassan R. Antibody–drug conjugates for cancer therapy[J]. Lancet Oncol， 2016， 17（6）： e254-e262.

[6] Ducry L， Stump B. Antibody-drug conjugates： linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies[J]. Bioconjug Chem， 2010， 21（1）： 5-13.

[7] McCombs JR， Owen SC. Antibody drug conjugates： design and selection of linker， payload and conjugation chemistry[J]. AAPS J， 2015， 17（2）： 339-351.

[8] Jain N， Smith SW， Ghone S， et al. Current ADC linker chemistry[J]. Pharm Res， 2015， 32（11）： 3526-3540.

[9] Nolting B. Linker technologies for antibody-drug conjugates[J]. Methods Mol Biol， 2013， 1045： 71-100.

[10] Katz J， Janik JE， Younes A. Brentuximab vedotin （SGN-35）[J]. Clin Cancer Res， 2011， 17（20）： 6428-6436.

[11] Verma S， Miles D， Gianni L， et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer[J]. N Engl J Med， 2012， 367（19）： 1783-1791.

[12] Lewis Phillips GD， Li G， Dugger DL， et al. Targeting HER2-positive breast cancer with trastuzumab-DM1， an antibodycytotoxic drug conjugate[J]. Cancer Res， 2008， 68（22）： 9280-9290.

[13] Mattson G， Conklin E， Desai S， et al. A practical approach to crosslinking[J]. Mol Biol Rep， 1993， 17（3）： 167-183.

[14] Partis MD， Griffiths DG， Roberts GC， et al. Crosslinking of protein by ω-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters[J]. J Protein Chem， 1983， 2（3）： 263-277.endprint