邢文曦　王永章　劉成連

摘要：單細胞是生物體的基本單位，提取具有活性的單細胞是研究果實發(fā)育的基礎(chǔ)。以蘋果為材料，研究不同酶液組合和酶解時間對蘋果果肉單細胞分離的影響。結(jié)果表明，蘋果果肉在01%離析酶、暗酶解05 h時，為理想的蘋果果肉單細胞分離條件。

關(guān)鍵詞：蘋果；單細胞；離析酶；酶解濃度；酶解時間

中圖分類號： S661101文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0138-02

[HJ14mm]

收稿日期：2016-03-29

基金項目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目。

作者簡介：邢文曦（1990—），女，山西朔州人，碩士研究生，主要從事果樹栽培與生理等研究。E-mail：kaoyanxixi@163com。

通信作者：劉成連，教授，研究方向為果樹栽培生理與分子生物學。E-mail：fmdb@qaueducn。

單個活體細胞是生物生命活動的基本單元和進化的基本單位，對單個活體細胞的識別、分選及分析，能夠解析生命體系最深層次的異質(zhì)性和運作機制。同時，因其不依賴細胞的培養(yǎng)和擴增，單細胞技術(shù)在生物發(fā)育、生物能源、氣候變化、疾病診斷、食品安全、農(nóng)業(yè)生態(tài)等領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。分離植物精細胞用于離體培養(yǎng)，可以為通過離體有性繁殖途徑進行植物品種改良打下基礎(chǔ)；分離保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體，使研究保衛(wèi)細胞本身的生理生化特性及其與氣孔功能的關(guān)系成為可能；分離維管束組織和韌皮部組織細胞，可以進行組織特異表達基因的鑒定。利用棉纖維單細胞研究細胞壁和纖維素的形成過程，能幫助人們更好地提高棉纖維的質(zhì)量。目前，研究基因表達都是一群細胞的基因表達，這種表達實際上是每個細胞特異表達的平均情況，但是單個細胞的基因表達分析能夠提供隱藏在群體細胞中單個細胞發(fā)育的新機制[3-4]。細胞膜上有各種離子通道，如鈣離子通道、鉀離子通道及鈉離子通道等，這些通道調(diào)節(jié)離子進出，利用膜片鉗技術(shù)可研究單個細胞離子通道的特性等，從而深入地研究生物體信號傳導、細胞滲透壓、細胞營養(yǎng)及抗逆性等各種生理機制。Li等利用膜片鉗等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了控制鉀離子通道的流向轉(zhuǎn)換機制，揭開了使同一離子通道的離子流向發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因素[5]。果實的發(fā)育過程就是果肉細胞發(fā)育的過程，決定著果實的硬度、甜度、營養(yǎng)物質(zhì)含量等，與果實貯藏時間長短、病害發(fā)生等都有關(guān)系，因此研究分離活性果肉單細胞是研究果實發(fā)育的基礎(chǔ)；但是目前還沒有果樹類果肉細胞分離的相關(guān)報道，本研究以蘋果為材料，研究果肉細胞的提取方法。

1材料與方法

11材料

從青島農(nóng)業(yè)大學教學實習基地，取成熟富士蘋果，貯藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

12器材與試劑

熒光顯微鏡 （LEICA，DM2500，德國）、勻漿機、低速離心機、恒溫搖床、磁力攪拌器等。

13試驗方法

131單細胞分離

配制細胞和原生質(zhì)體洗滌溶液（cell and potoplast wash solution，簡稱CPW）：101000 mg/L KNO3，27200 mg/L KH2PO4，246000 mg/L MgSO4·7H2O，1 480000 mg/L CaCl2·2H2O，0160 mg/L KI，0025 mg/L CuSO4·5H2O，0400 mol/L 甘露醇，4 ℃低溫保存?zhèn)溆?。纖維素酶、果膠酶、離析酶溶于CPW溶液中，酶液見表1。

將蘋果表皮以下的果肉用手術(shù)刀切成邊長05 cm 的小方塊，再徒手切成薄片。將切好的蘋果薄片分別置于50 mL的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶液中（酶液的組成見表1），于70 r/min搖床中振蕩酶解05 、10、20 h（27 ℃，黑暗條件）。靜置后，用CPW溶液清洗3次，以洗去酶液，再移到50 mL燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌1 h后，在顯微鏡上檢測，比較各個酶液在不同處理時間下獲取單細胞的結(jié)果。

132采用VBL檢測細胞壁完整性

采用黃祥輝等的方法，配制VBL[4，4′-bis（4-anilino-6-hydroxyethyl-amine-S-triazin-2-ylamino）-2，2′-stilbene disulfonic acid]細胞壁染色液。先配制05 mol/L甘露醇，調(diào)節(jié)pH值為70 （Tris）。再用甘露醇溶液配制VBL，使VBL終濃度為01%。避光，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

染色步驟：（1）吸取1 mL細胞懸浮液到15 mL離心管中，吸取10 μL，滴加于載玻片上，在顯微鏡下觀察。（2）吸取400 μL細胞懸浮液至新的離心管中，加20 μL 上述01% VBL，避光，染色5 min。（3）染色后，用CPW溶液重復漂洗3次，以除去背景中的熒光。（4）漂洗后，懸浮于CPW溶液中，避光，熒光顯微鏡下觀察。VBL的激發(fā)波長為345 nm，發(fā)射波長為430 nm。

133FDA檢測細胞活性

FDA是一種非熒光化合物，滲入活細胞后才釋放出熒光素，在藍色光激發(fā)下顯示出綠色熒光[8]。

配制5 mL 濃度為5 mg/L的FDA：先配065 mol/L甘露醇，再稱取25 mg雙醋酸熒光素FDA，溶于1 mL丙酮中，完全溶解之后，加入上述甘露醇溶液4 mL，避光，4 ℃ 保存。取細胞懸浮液05 mL于15 mL離心管中，加入FDA染色液，使其終濃度為001%，室溫下靜置5 min，熒光顯微鏡下觀察，F(xiàn)DA的最大激發(fā)波長為493 nm，發(fā)射波長為510 nm。發(fā)綠色熒光的為活細胞，不發(fā)熒光的為死細胞。

2結(jié)果與分析

分離蘋果果肉單細胞過程中，在沒有酶的情況下，不能分離出果肉單細胞，用FDA染色液染色，能夠看到堆疊的有活性的細胞群（圖1-A）。當酶液中含有01%纖維素酶或 005%果膠酶時，獲得單細胞少，有碎片存在，如表2中酶液Ⅰ、酶液Ⅱ；但當酶液中只含有01%離析酶時，處理時間為05 h時，單細胞產(chǎn)量多且完整（圖1-B、1-D），當處理時間為10、20 h時，雖有較多的單細胞，但有碎片存在，因此，酶液Ⅲ是分離果肉單細胞的最佳酶液，適宜酶解時間為05 h（表2）。

VBL與植物細胞壁中的纖維素有強烈的親和力，在紫外光下產(chǎn)生熒光，利用這個特性，常被用于檢測細胞的完整性。離析酶分離得到的蘋果果肉單細胞經(jīng)VBL染色后，細胞周圍有明顯的熒光（圖1-C），這說明經(jīng)離析酶處理果肉可以獲得完整的果肉單細胞。FDA常用動植物細胞生活力的鑒定染料，當活細胞具有完整細胞膜時，細胞內(nèi)的FDA經(jīng)水解產(chǎn)生的熒光素在胞內(nèi)積累，在藍光下產(chǎn)生綠色熒光，而死細胞的細胞膜失去了選擇透性，熒光素無法在胞內(nèi)積累，不產(chǎn)生熒光[8]。分離得到的單細胞經(jīng)FDA染色5 min后，細胞內(nèi)充滿了熒光物質(zhì)（圖1-E），這表明分離得到的果肉單細胞具有活性。

3結(jié)論與討論

單細胞水平研究越來越受到關(guān)注，已被廣泛應用于單細胞PCR擴增、基因測序及細胞工程研究等，因此分離單細胞是生理和分子研究的基礎(chǔ)。據(jù)筆者所知，目前分離植物單細胞以酶解法為主，即采用纖維素酶、果膠酶等破壞植物細胞壁，使細胞相互分離，從而分離出單細胞或者原生質(zhì)體。張寧等應用酶解法分離馬鈴薯的葉片單細胞，發(fā)現(xiàn)果膠酶是細胞分離的關(guān)鍵酶，但只是統(tǒng)計了細胞的分離率，酶解時間比本研究的酶解時間長，最少為4 h，酶解時間太長會破壞細胞的完整性和活性[9]。目前還有很多研究都直接提取了原生質(zhì)體，而使細胞壁破裂。陳穎等用纖維素酶酶解擬南芥葉肉細胞，獲取了葉肉細胞的原生質(zhì)體[10]。陳愛萍等用纖維素酶、果膠酶、離析酶提取了紅豆草的原生質(zhì)體[11]。

纖維素酶和果膠酶能夠促進細胞壁的降解，在筆者的研究中，為了保護細胞壁，只采用10%離析酶進行酶解，從而獲得有完整細胞壁的單細胞。細胞壁的功能，細胞極性的形成，植物激素的定向運輸，細胞骨架的極性變化，小泡的定向分布和運輸?shù)纫幌盗屑毎l(fā)育事件都是彼此相連的。植物細胞壁在細胞生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，是細胞外圍的一層壁，有保護細胞的作用[12]。除此之外，細胞壁還參與了植物生長、細胞分化、細胞識別、抗病反應等一系列代謝活動。細胞極性是生物體的基本屬性，在多細胞生物里同時也控制細胞間的信息交換、模式生成、身份識別。因此獲取有細胞壁的單細胞對研究細胞的生理生化具有重要意義，也是在細胞水平研究蘋果生長發(fā)育的基礎(chǔ)。纖維素酶和果膠酶可以分解植物細胞壁，所以在本研究中，為了避免細胞壁的降解，只用了離析酶分離果肉細胞，通過VBL檢測，獲得了有完整細胞壁的果肉單細胞。Mcatee等把蘋果、梨等果實的果肉，一邊加熱煮沸，一邊通過磁力攪拌器攪拌05 h，直至看到果肉單細胞才停止加熱，但是獲得的單細胞已經(jīng)失去活性，只能用于檢測果肉細胞的大小和形狀[14]。而本研究分離得到的果肉細胞經(jīng)VBL染色，能看到完整的細胞壁，經(jīng)過FDA染色，單細胞具有明顯的活性。酶解處理的原則是利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時間獲得大量且有活力的原生質(zhì)體[15]。本研究只用了01%離析酶，而且酶解時間只有05 h，低于酶解獲取原生質(zhì)體的時間[16-17]。

總之，采用01%離析酶酶解蘋果果肉，再攪拌30 min，能得到細胞壁完整且具有活性的果肉單細胞。

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