徐金柱 秦長(zhǎng)生 楊 華 趙丹陽 揭育澤 邱華龍

（廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520）

綠僵菌產(chǎn)毒素能力及產(chǎn)毒素動(dòng)態(tài)分析*

徐金柱 秦長(zhǎng)生 楊 華 趙丹陽 揭育澤 邱華龍

（廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520）

以綠僵菌素A（DxtA）和綠僵菌素B（DxtB）的產(chǎn)量為指標(biāo)，分析了僵菌屬5個(gè)種15個(gè)菌株液體培養(yǎng)的產(chǎn)毒素能力差異，確定了高產(chǎn)毒素優(yōu)良菌株，并擬合了高產(chǎn)毒菌株在搖瓶條件下的產(chǎn)毒素動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，不同種綠僵菌間的產(chǎn)毒素能力差異極顯著（P＜0.01），黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride）、戴氏綠僵菌（M. taii）和蚱蜢綠僵菌（M. acridum）均不產(chǎn)生毒素，鱗腮綠僵菌（M. lepidiotae）可產(chǎn)少量毒素，金龜子綠僵菌（M. anisopliae）產(chǎn)毒素能力最強(qiáng)，其中M19的DxtA產(chǎn)量最高（144.12 μg·mL-1），M25菌株的DxtB產(chǎn)量最高（65.31 μg·mL-1）；M25菌株的綜合表現(xiàn)最佳；M25菌株在液體搖瓶培養(yǎng)條件下DxtA產(chǎn)量經(jīng)SPSS擬合，符合Logist模型：Y=84.99/(1+11.82×e-0.3X），即前4 d是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，毒素分泌量較少，4 d后生物量維持平衡，第5天起毒素產(chǎn)量進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，9 d后毒素產(chǎn)量進(jìn)入平臺(tái)期。

綠僵菌；毒素；動(dòng)態(tài)曲線

昆蟲病原真菌具有廣泛的生活方式和代謝方式，能在不同環(huán)境下生長(zhǎng)，如貧瘠的營(yíng)養(yǎng)條件[1]和存在對(duì)其他真菌致死的化合物條件等[2-3]。綠僵菌（Metarhizium spp.）能通過在皮層根細(xì)胞內(nèi)或皮層根細(xì)胞間生長(zhǎng)而在根際定殖[4]，并能將昆蟲內(nèi)的氮轉(zhuǎn)移給植物。蟲生真菌可起到持續(xù)控制害生發(fā)生的作用，作為其中的代表性物種，綠僵菌已成為生物藥劑開發(fā)的重要研究對(duì)象，并已在分子和生化水平上進(jìn)行了全面深入的研究，篩選出多種對(duì)不同害蟲具強(qiáng)毒力的菌株，研制出多種農(nóng)林業(yè)害蟲的生防制劑。

產(chǎn)毒素能力是影響綠僵菌殺蟲毒力的重要因子，具有抑制血淋巴免疫、觸殺、胃毒、拒食、殺卵及產(chǎn)卵忌避作用和內(nèi)吸輸導(dǎo)作用[5]。本文分析了綠僵菌屬5個(gè)種15個(gè)菌株在液體培養(yǎng)條件下的產(chǎn)毒素能力，及其種間差異性，篩選出高產(chǎn)毒素菌株，確定其在液體培養(yǎng)條件下的產(chǎn)毒素動(dòng)態(tài)，為綠僵菌素制劑及應(yīng)用提供重要參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試綠僵菌為廣東省林業(yè)科學(xué)研究院分離保存的15株綠僵菌（表1）。斜面種子培養(yǎng)基(PPDA)：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 40 g，蛋白胨 5 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL。種子培養(yǎng)基：NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，蛋白胨5 g，水 1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基[6]：麥芽糖質(zhì)量濃度2.55%，蛋白胨質(zhì)量濃度0.75%，β-丙氨酸質(zhì)量濃度0.02%，葡萄糖質(zhì)量濃度0.5%。

1.2 綠僵菌培養(yǎng)

1.2.1 種子培養(yǎng) 供試菌株（表1）的斜面分生孢子用0.05%吐溫-80溶液洗脫，經(jīng)高速分散，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋成1×107孢子/mL孢子懸浮液。取1 mL孢子懸浮液接種于裝有49 mL種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶，200 rpm，（26±1）℃培養(yǎng) 3 d，備用。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 分別取 10 mL 液體種子接種于裝有 190 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 mL 三角瓶，200 rpm，（26±1）℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3重復(fù)。培養(yǎng)至第 10天，每瓶取 1 mL 發(fā)酵液，10 000 g離心10 min，取上清液，0.45 μm 濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，根據(jù)DxtA和DxtB的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定供試菌株液體條件下產(chǎn)毒素量。

1.3 綠僵菌素檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 DxtA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma公司，DxtB標(biāo)準(zhǔn)品由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)胡瓊波教授提供。標(biāo)準(zhǔn)品DxtA和DxtB分別用丙酮溶解后，用乙腈梯度稀釋至6個(gè)質(zhì)量濃度（20、40、60、80、100、120 μg·mL-1），每個(gè)濃度進(jìn)行3次HPLC檢測(cè)，平均峰面積（Y）和標(biāo)樣濃度（X）間經(jīng)線性回歸分析，獲得回歸方程Y=aX+b。

1.3.2 HPLC檢測(cè) Agilent 1100高效液相色譜儀，配以G1311A泵，G1315B DAD紫外檢測(cè)器。色譜柱為反相柱為 Agilent TC-C18 柱 250×4.6 mm，5 μm，流動(dòng)相為 1:1 的 CH3CN:H2O，流速 1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng) 215 nm，檢測(cè)時(shí)間 15 min，上樣量 20 μL，室溫（25 ℃）下檢測(cè)。

1.4 綠僵菌產(chǎn)毒素動(dòng)態(tài)分析

通過HPLC檢測(cè)，確定以高產(chǎn)毒菌株M25為研究對(duì)象，在100 mL三角瓶?jī)?nèi)裝入47.5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接入2.5 mL種子液，40個(gè)重復(fù)，200 rpm，（26±1）℃培養(yǎng)，每隔24 h隨機(jī)取3瓶，每瓶?jī)?nèi)各取1 mL發(fā)酵液，10 000 rpm離心，取上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，其余發(fā)酵液經(jīng)濾紙抽濾，無菌水洗滌2次，75 ℃烘24 h，稱取菌絲重量，連續(xù)取樣12 d，分析液體培養(yǎng)條件下綠僵菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒素的動(dòng)態(tài)變化。

1.5 18SrDNA序列測(cè)定確定供試菌株種歸屬

在 PPDA 平板（D=9 cm）表面 鋪 上 玻璃紙，接入0.2 mL供試綠僵菌孢子懸浮液，涂布均勻，置26℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)34 d，取菌絲冷凍備用。氯化芐法[7]提取綠僵菌DNA，18SrDNA基因特異性擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGC GG- 3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3’），25 μL體系：dNTP 10 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，LA Taqase 0.2 μL，1 U，引 物（10 μm/μL） 各 1 μL，DNA 模 板 1 μL，ddH2O 15.3 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃，3 min；（94 ℃ 1 min；54 ℃ 1 min；72 ℃ 2 min）35 循環(huán)；72 ℃ 2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司完成序列測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 Microsoft excel 2006 對(duì) DxtA 和 DxtB 標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸，應(yīng)用SPSS 13.0擬合供試菌株M25產(chǎn)毒素的生長(zhǎng)曲線[8]。不同菌株產(chǎn)毒素量經(jīng)DPS進(jìn)行差異性分析。測(cè)定的18SrDNA經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)，確定供試菌株的種歸屬，結(jié)合供試菌株產(chǎn)毒素能力，分析不同種菌株的產(chǎn)毒差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠僵菌毒素A、毒素B標(biāo)準(zhǔn)曲線

在確定的條件下，DxtA和DxtB的出峰時(shí)間分別為8.889 和14.825 min。不同濃度的DxtA和DxtB標(biāo)樣經(jīng)HPLC獲取峰面積，經(jīng)Microsoft excel 2006以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積擬合，DxtA和DxtB線性回歸方程分別為：Y=11 301X（R2=0.999 5）和 Y=449 771X（R2=0.999 6）（圖 1）。

圖1 DxtA和DxtB標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 綠僵菌產(chǎn)毒素動(dòng)態(tài)

M25液體培養(yǎng)前4 d是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，生物量不斷增加，而毒素量增加較少，第4天后生物量維持平衡，第5天起毒素分泌量明顯加大，7～9 d毒素分泌最快，9 d后產(chǎn)毒素量趨于穩(wěn)定（圖2）。SPSS擬合結(jié)果表明，M25菌株的毒素產(chǎn)生符合Logist模型：Y=84.99/(1+11.82×e-0.3X)（圖2）。因此，在評(píng)價(jià)菌株產(chǎn)毒能力時(shí)宜選取培養(yǎng)9～10 d的發(fā)酵液進(jìn)行毒素產(chǎn)量檢測(cè)，進(jìn)行高產(chǎn)菌株篩選。

圖2 綠僵菌M25菌株液體培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及DxtA產(chǎn)量動(dòng)態(tài)

2.3 綠僵菌產(chǎn)毒素能力分析

HPLC檢測(cè)結(jié)果表明，供試的15個(gè)綠僵菌菌株的產(chǎn)生毒素能力表現(xiàn)出3種類型：高產(chǎn)毒株（M19、M25、M28、M32、M42、M50、M52）、低產(chǎn)毒株（M09、M30、M40）和不產(chǎn)毒株（M20、M43、M985、M1245、M1258）（圖 3），DxtA 和DxtB產(chǎn)量間具有一定的相關(guān)性，DxtA產(chǎn)量高的菌株，其DxtB的產(chǎn)量也比較高，而不產(chǎn)DxtA的菌株的發(fā)酵液里也未檢測(cè)到DxtB。

圖3 綠僵菌產(chǎn)毒素類型

根據(jù)綠僵菌ITS序列比對(duì)結(jié)果，鑒定了供測(cè)試的15個(gè)菌株的種歸屬，包括8株金龜子綠僵菌（M. anisopliae）、1 株 戴 氏綠 僵 菌（M. taii）、1株鱗腮綠僵菌（M.lepidiotae）、4株黃綠綠僵菌（M.flavoviride）和1株蚱蜢綠僵菌（M.acridum）（表1）。菌株間產(chǎn)毒能力差異極顯著（P＜0.01），其中金龜子綠僵菌的產(chǎn)毒素能力較其它菌株強(qiáng)，除M09菌株的產(chǎn)毒量較低外，其它菌株DxtA的產(chǎn)量均在100 μg·mL-1以上，而戴氏綠僵菌和黃綠綠僵菌均不產(chǎn)生毒素。DxtA產(chǎn)量最高的菌株為M19（144.12 μg·mL-1），DxtB 產(chǎn)量最高是 M25菌株（65.31 μg·mL-1）。

表1 供試綠僵菌毒素產(chǎn)量及種歸屬

3 結(jié)論與討論

綠僵菌主要是通過在昆蟲體內(nèi)快速繁殖菌絲或產(chǎn)生毒素使寄主致病[9-10]，綠僵菌分生孢子在寄主體表萌發(fā)后，進(jìn)入寄主血腔大量繁殖致死寄主。研究表明[11-12]，綠僵菌對(duì)寄主具有較強(qiáng)的專一性，一些綠僵菌種，如羅伯特綠僵菌（M. robertsii）和金龜子綠僵菌，寄主范圍較廣，而另一些種只對(duì)某一類昆蟲表現(xiàn)出特異性，如蚱蜢綠僵菌對(duì)直翅目昆蟲，大孢綠僵菌（M. majus）對(duì)甲蟲類特異。本文探討的5種綠僵菌毒素分泌能力，證明了金龜子綠僵菌是高產(chǎn)毒毒菌株，其它4種為低產(chǎn)毒或不產(chǎn)毒菌株，與寄主?；员３忠恢?，說明綠僵菌毒素在這一過程中起到重要作用，毒素的產(chǎn)生對(duì)增加寄主范圍具有重要作用。王賓等[13]證明了綠僵菌破壞素的生物合成是由非核糖體蛋白合成酶完成，綠僵菌產(chǎn)毒素能力的差異主要取決于是否有dtxS1基因。產(chǎn)毒素種能殺死多個(gè)目標(biāo)昆蟲，而不產(chǎn)毒素綠僵菌只有很少的寄主，在綠僵菌進(jìn)化過程中，毒素的生物合成基因簇的獲得和保持，與真菌寄主?；韵嘁恢隆?/p>

綠僵菌為水溶性胞外蛋白，綠僵菌毒素的分泌與菌絲的生長(zhǎng)同步，但主要是在菌絲生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期后，即培養(yǎng)的第5～8天是毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵時(shí)期，毒素產(chǎn)生量呈現(xiàn)指數(shù)增加，第9天后達(dá)平臺(tái)期，是提取毒素的最佳時(shí)期。本研究篩選出最佳菌株并確定該菌株在液體培養(yǎng)條件下毒素產(chǎn)量的變化動(dòng)態(tài)，為毒素的提取和深入研究提供了參考。

[1] RANGEL D E, ANDERSON A J, ROBERTS D W.Evaluating physical and nutritional stress during mycelial growth as inducers of tolerance to heat and UV-B radiation in Metarhizium anisopliae conidia[J]. Mycological Research, 2008, 112(t 11): 1362-1372.

[2] ROBERTS D W, LEGER R S J. Metarhizium spp,cosmopolitan insect-pathogenic fungi:Mycological Aspects[J]. Advances in Applied Microbiology, 2004,54(54): 1-70.

[3] RANGEL D E N, Everton K K Fernandes,DETTENMAIER S J, et al. Thermotolerance of germlings and mycelium of the insect-pathogenic fungus Metarhizium spp. and mycelial recovery after heat stress[J]. Journal of Basic Microbiology, 2010, 50(4): 344-350.

[4] HU G, LEGER R S J. Field studies using a recombinant mycoinsecticide (Metarhizium anisopliae) reveal that it is rhizosphere competent[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2002, 68(12): 6383-6387.

[5] MENG X, XU X, HU J, et al. Toxicity and differential protein analysis following destruxin a treatment of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) SL-1 cells[J].Toxicon Official Journal of the International Society on Toxinology, 2011, 58(4): 327-335.

[6] LIU B L, CHEN J W, TZENG Y M. Production of Cyclodepsipeptides Destruxin A and B from Metarhizium anisopliae[J]. Biotechnology Progress, 2000, 16(6): 993-999.

[7] 朱衡, 瞿峰, 朱立煌.利用氯化芐提取適于分子生物學(xué)分析的真菌 DNA[J].菌物學(xué)報(bào), 1994 (1): 34-40.

[8] 戴國(guó)俊, 王金玉, 楊建生, 等.應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS擬合生長(zhǎng)曲線方程[J].畜牧與獸醫(yī), 2006, 38(9): 28-30.

[9] 童應(yīng)華, 李萬里, 馬淑娟.金龜子綠僵菌及其粗提物對(duì)樟巢螟幼蟲的致病性 [J].昆蟲學(xué)報(bào), 2014, 57(4): 418-427.

[10] 何廣位, 胡維娜, 胡瓊波. 綠僵菌素對(duì)四種昆蟲細(xì)胞的毒性[J]. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2015, 52(6): 1466-1473.

[11] WANG S, FANG W, WANG C S, et al. Insertion of an esterase gene into a specific locust pathogen(Metarhizium acridum) enables it to infect caterpillars[J].PLOS Pathogens, 2011,7(6): e1002097.

[12] AMIRIBESHELI, KHAMBAY, CAMERON, et al. Inter-and intra-specific variation in destruxin production by,insect pathogenic Metarhizium spp. and its significance to pathogenesis[J]. Mycological Research, 2000, 104(4):447-452.

[13] WANG B, KANG Q, LU Y, et al. Unveiling the biosynthetic puzzle of destruxins in Metarhizium species[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(4): 1287-1292.

Production and Dynamic of Destruxins from Metarhizium spp.

XU Jinzhu QIN Changsheng YANG Hua ZHAO Danyang JIE Yuze QIU Hualong

（Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization/Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou,Guangdong 510520, China）

Taking the yield of DxtA and DxtB as indexes, the difference of the destruxin producing ability of 15 Metarhizium strains (belonged to 5 species) was analyzed. The DxtA dynamic curve of the best strain was fitted under shaking flask culture by sampling every day. The results showed that there was a significant difference in the destruxin producing ability among 5 species. Metarhizium anisopliae strains showed highest production, while M. flavoviride, M. taii and M. acridum did not produce DxtA or DxtB, M. lepidiotae produce a little destruxin.Among them, the M19 strain was the best to produce DxtA (144.12 μg·mL-1), and the M25 strain was the best to produce DxtB (65.31 μg·mL-1). The M25 was selected to be the best in DxtA and DxtB production. Under shaking flask culture, the DxtA production of M25 was fitted by SPSS, and showed to accord with Logist model Y=84.99/(1+11.82×e-0.3X）: produce a little destruxin in the first 4 days vegetative growth and from the fifth day，it change into exponential growth and reached platform period from the ninth day.

Metarhizium; destruxin; dynamics curve

S763

A

2096-2053（2017）05-0001-05

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“新型高效綠僵菌生物殺蟲劑研究”（201304408）。

徐金柱（1978— ），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事生物殺蟲劑研究與利用工作，E-mail: 282272693@qq.com。

秦長(zhǎng)生（1967— ），男，研究員，主要從事森林病蟲害綜合防治研究工作，E-mail: 919824595@qq.com。