田宇曦　閔勇　楊自文

摘要：多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是重要的根際有益生物，也被用于生物醫(yī)藥、流程制造、生物修復(fù)等方面，具有較大利用價(jià)值。綜述了多粘類芽孢桿菌的菌株新特性和基因組特點(diǎn)、諸多功能領(lǐng)域的研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用、分子操作系統(tǒng)、菌株的選育以及發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)化。

關(guān)鍵詞：多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；功能；產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用；分子操作系統(tǒng)；菌株選育；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）18-3401-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.001

Abstract： Paenibacillus polymyxa is an important beneficial rhizosphere organism， which may also be applied in biomedical industry， process manufacturing， bioremediation and so on， with great value of utilization. The new characteristics of bacterial strain and genome， study and industrial application in many functional areas，molecular operating system，breeding of strain and optimization of fermentation technology of Paenibacillus polymyxa were summarized.

Key words： Paenibacillus polymyxa； function； industrial application； molecular operating system； breeding of strain； optimization of fermentation condition

類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）是廣泛存在于自然界的一類好氧-兼性厭氧、可產(chǎn)生內(nèi)生孢子的桿狀細(xì)菌。多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是類芽孢桿菌的模式菌種，是一類重要的根際有益細(xì)菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）[1]，兼具促進(jìn)植物生長(zhǎng)和生物防治的作用，在生物醫(yī)藥、流程制造、生物修復(fù)等方面有重要利用[2]。多粘類芽孢桿菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如酶、抗菌物質(zhì)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及絮凝劑等，多是蛋白質(zhì)、多糖、多肽[3]。為了從多粘類芽孢桿菌獲得更多的活性物質(zhì)，一般采用誘變和篩選技術(shù)選育優(yōu)良菌株[4]，進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，菌株的制劑化、復(fù)合使用方案等也皆有研究。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，多粘類芽孢桿菌分子操作也在進(jìn)一步完善，為多粘類芽孢桿菌功能和分子機(jī)理的研究、改造菌株打開了新的天地。

1 菌株新特性及基因組特點(diǎn)

研究發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌細(xì)菌細(xì)胞可以從玉米、黃瓜等植物的根部轉(zhuǎn)移到莖部和葉部，和革蘭氏陰性固氮菌巴西固氮螺菌Yu62、革蘭氏陽性菌巨大芽孢桿菌的定植模式相似，可成為一種聯(lián)合固氮菌[5]。多粘類芽孢桿菌的菌落會(huì)發(fā)生分化，研究表明，多粘類芽孢桿菌GBR-1在不同的接種濃度下分離的菌落形態(tài)有較大的差異，多粘類芽孢桿菌SC2在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下菌落形態(tài)也表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。SC2的頻繁分化影響了它的應(yīng)用，分化的突變株不再產(chǎn)生芽孢且抗病能力下降很多。目前，對(duì)多粘類芽孢桿菌的分化現(xiàn)象還少有全面的研究，研究其分化機(jī)制很有必要。侯曉陽[6]發(fā)現(xiàn)SC2分化后的突變株表型變化與基因組變化有關(guān)。

到2011年4月30日，完成全基因組測(cè)序的微生物共有1 545株，正在進(jìn)行的微生物基因組測(cè)序項(xiàng)目有4 856個(gè)，已經(jīng)完成測(cè)序的真細(xì)菌全基因組共有893個(gè)。其中已測(cè)序的模式微生物有大腸桿菌K12[7]、枯草芽孢桿菌[8]等，迄今為止已完成及正在進(jìn)行測(cè)序的類芽孢桿菌菌株有14株，目前已經(jīng)公布序列的多粘類芽孢桿菌菌株有多粘類芽孢桿菌E681和SC2。多粘類芽孢桿菌SC2注釋的抗生素合成和促生相關(guān)基因有Fusaricidin、Lantibiotic、 Microcystin、Bacillorin、Inturin、Bacitracin、Polyketide、Gramicidin S、Polymyxin等，其大多與非核糖體肽和聚酮類化合物合成相關(guān)。多粘類芽孢桿菌SC2產(chǎn)生的非核糖體肽作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有多樣性和統(tǒng)一性，使得該桿菌具有廣譜抗菌能力。隨著20世紀(jì)70年代開始研究肽生物合成非核糖體機(jī)制，以及全基因組測(cè)序的開展，越來越多的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的相關(guān)基因被克隆和分析，產(chǎn)生了大量關(guān)于次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和調(diào)控的信息[6]。李舒清[9]確定多粘類芽孢桿菌SQR-21的Fusaricidin啟動(dòng)子的最小功能區(qū)域，發(fā)現(xiàn)宿主存在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，導(dǎo)致不同的啟動(dòng)子片段在不同宿主存在不同的轉(zhuǎn)錄水平。

2 功能領(lǐng)域的研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

多粘類芽孢桿菌具有促生長(zhǎng)和生物防治兩方面作用，通過固氮、溶解磷、獲取鐵和產(chǎn)生植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)植物生長(zhǎng)；通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、產(chǎn)生殺蟲或殺菌物質(zhì)，如抗菌肽、細(xì)菌素、非核糖體合成的脂肽、環(huán)狀陽離子脂肽或非環(huán)狀陽離子脂肽等，實(shí)現(xiàn)生物防治[2]。它產(chǎn)生的微生物多糖，如黃原膠、結(jié)冷膠等，也頗具產(chǎn)業(yè)價(jià)值，廣泛應(yīng)用于工、農(nóng)業(yè)。蹇華麗等[10]研究多粘類芽孢桿菌PS04多糖結(jié)構(gòu)，從一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定其為果聚糖。多粘類芽孢桿菌在醫(yī)藥、加工、生物修復(fù)等方面也有一定研究[2]。尹艷[11]發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌可以降解轉(zhuǎn)化褐煤，并采用正交試驗(yàn)研究褐煤微生物的影響因素，優(yōu)化了降解方案。宿燕明等[12]發(fā)現(xiàn)，施氮肥時(shí)添加多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液，能明顯降低油菜中硝酸鹽含量。徐匆等[13]將多粘類芽孢桿菌用于桂味荔枝果實(shí)采后保鮮，輔以0.3 g/L納他霉素、1%乳酸鈉復(fù)配成生物保鮮劑，能顯著提高果實(shí)的商品率，延長(zhǎng)貨架期，證實(shí)多粘類芽孢桿菌dgnkzx004對(duì)荔枝炭疽病菌及霜疫霉菌生長(zhǎng)有抑制作用。endprint

多粘類芽孢桿菌在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用方面，學(xué)者做了探索。Hu等[14]發(fā)現(xiàn)井岡霉素和多粘類芽孢桿菌防治水稻紋枯病有明顯的協(xié)同效應(yīng)，以3%井岡霉素A加多粘類芽孢桿菌水劑（2億芽孢/mL），對(duì)水稻紋枯病發(fā)病的初期預(yù)防效果良好。尹薇等[15]將腐殖酸與多粘類芽孢桿菌配合施用，提高肥料的效果，減輕了土傳病害，提高了黃瓜產(chǎn)量。在動(dòng)物保健方面，多粘類芽孢桿菌被應(yīng)用于微生態(tài)制劑。微生態(tài)制劑是調(diào)整并穩(wěn)定腸道微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平的有益菌群及其代謝產(chǎn)物和選擇性促進(jìn)宿主正常菌群生長(zhǎng)制劑的總稱，以多功能、綠色無害、無殘留的特性成為飼用抗生素的完美替代品。張宏福[16]將多粘類芽孢桿菌A11和枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌混合成新型微生態(tài)制劑，該制劑各菌株具有一定的耐受性且對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能具有顯著的改善作用，對(duì)細(xì)胞因子和抗氧化因子也有一定的促進(jìn)作用。劉振華[17]發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌的田間應(yīng)用適宜采用高芽孢含量發(fā)酵液制成的可濕性粉劑，可作為一種廣譜性微生物農(nóng)藥，有效防治多種植物土傳病害和葉部病害。多粘類芽孢桿菌多糖在農(nóng)藥制備方面，有助懸浮、熱保護(hù)和紫外保護(hù)功能，研究此多糖作為微生物農(nóng)藥專用助劑，可優(yōu)化可濕性粉劑配方和加工工藝，降低生產(chǎn)成本，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

3 分子操作系統(tǒng)

多粘類芽孢桿菌是一種相對(duì)研究較少的實(shí)驗(yàn)菌，分子遺傳學(xué)工具相對(duì)缺乏，尚處在探索階段，其分子機(jī)制的研究進(jìn)展尚未深入。近幾年其工具和理論方法的研究速度明顯地加快。

3.1 常規(guī)克隆和表達(dá)

在基因克隆、鑒定、表達(dá)和應(yīng)用分析方面，多粘芽孢桿菌諸多功能基因被克隆和延伸研究，比如多糖水解酶基因、β-葡聚糖酶基因、吲哚-3-丙酮酸脫羧酶基因、Fusaricidins基因簇、多粘菌素合成酶基因簇等[18]。陳雪麗等[19]采用硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-50柱層析，采用抑菌活性和SDS-PAGE跟蹤檢測(cè)，從多粘類芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中分離純化到一種對(duì)大豆立枯絲核菌具有拮抗活性的大小為35.4 kD的抗菌蛋白。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶是一類有著廣泛應(yīng)用前景的飼料添加劑，還有抗稻瘟病菌的活性作用，文鳳云等[20]從多粘類芽孢桿菌CP7克隆、表達(dá)和應(yīng)用β-1，3-1，4-葡聚糖酶，從基因工程角度證明了β-1，3-1，4-葡聚糖酶是多粘類芽孢桿菌CP7抗真菌的活性組分，為飼用酶制劑的發(fā)開研究提供了新思路。

3.2 生物轉(zhuǎn)化

生防菌功能基因研究需簡(jiǎn)捷高效的基因組改造工具，基因組操作基礎(chǔ)是將外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞并使其與目的DNA發(fā)生同源重組。早期是利用Spizizen自然感受態(tài)轉(zhuǎn)化法將外源DNA以線性單鏈的形式導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，與基因組具有同源性的外源DNA在RecA重組酶的作用下通過重組載體以單交換或雙交換方式整合到染色體上。隨著研究的深入，電擊轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和堿金屬離子轉(zhuǎn)化等方法逐漸被建立并用于DNA轉(zhuǎn)化研究[21]。電擊轉(zhuǎn)化法廣泛應(yīng)用于革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌中。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法應(yīng)用較多，但也存在缺陷，比如大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率較低，再生培養(yǎng)基要求高。堿金屬離子轉(zhuǎn)化法是新發(fā)展起來的一種適合芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法，在枯草芽孢桿菌和短短芽孢桿菌研究中已有使用。采用接合轉(zhuǎn)移法，已有含前毒素基因的質(zhì)粒從蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)移到蘇云金芽孢桿菌或者蠟狀芽孢桿菌、含有內(nèi)毒素基因的重組質(zhì)粒從枯草芽孢桿菌或糞鏈球菌轉(zhuǎn)移到蘇云金芽孢桿菌的報(bào)道。

3.3 基因敲除

基因敲除是后基因組時(shí)代研究生防基因功能的手段，也可以用于去除細(xì)菌基因組上的冗余片段。

3.3.1 基因敲除載體的構(gòu)建方法 基因敲除載體的構(gòu)建有4種方法：①傳統(tǒng)酶切連接。傳統(tǒng)酶切連接方法是將待敲除基因的上游和下游DNA片段和抗生素抗性基因片段分別通過酶切和連接的方法克隆到基因敲除載體的多克隆位點(diǎn)。該方法的操作屬于分子生物學(xué)常規(guī)操作，缺陷是工作步驟繁瑣，不利于提高工作效率，且受內(nèi)切酶選擇的限制。②使用Sfi I內(nèi)切酶的酶切連接。Kamper[22]利用特殊的限制性內(nèi)切酶Sfi I建立了一套相對(duì)快速、適用范圍廣的基因敲除載體構(gòu)建方法。內(nèi)切酶Sfi I識(shí)別相隔5個(gè)任意核苷酸的2組GGCC序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增靶標(biāo)基因的上下游片段和抗生素抗性基因片段引物時(shí)，在5′端加入該接頭，用Sfi I酶切這些片段并連接后就可得到待敲除基因DNA和抗生素抗性基因片段連接體。③高通量轉(zhuǎn)座子隊(duì)列法構(gòu)建基因敲除載體。構(gòu)建Cosmid或Fosmid基因組文庫(kù)，通過轉(zhuǎn)座酶促反應(yīng)將攜帶篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入Cosmid或Fosmid破壞其中的基因，帶有被轉(zhuǎn)座子破壞基因的Cosmid或Fosmid可作為基因敲除載體。④融合PCR體系構(gòu)建基因敲除載體。融合PCR技術(shù)簡(jiǎn)便快捷，不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理就可以實(shí)現(xiàn)不同來源DNA片段的體外連接?？蓪⒒虻纳嫌纹?、抗生素的抗性基因和基因的下游片段的末端設(shè)計(jì)成反向互補(bǔ)的末端，通過融合PCR方法構(gòu)建基因敲除載體[23]。

3.3.2 基因敲除的方式 大體可分為定點(diǎn)敲除和隨機(jī)敲除兩類。定點(diǎn)敲除可采用基于自殺性質(zhì)粒的同源重組、采用λ-Red系統(tǒng)的線性DNA介導(dǎo)的同源重組和位點(diǎn)特異性重組對(duì)目的敲除片段進(jìn)行精確敲除；隨機(jī)敲除則利用轉(zhuǎn)座子能夠隨機(jī)插入或切離的特性，引起染色體內(nèi)部同源重組，可以切除兩段重復(fù)序列之間的染色體DNA序列。在多粘類芽孢桿菌研究中，基因組基因敲除采用較多的是溫敏型自殺性質(zhì)粒[24]及Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[21]。

3.4 其他分子操作手段

Han等[25]采用iTRAQ （Isobaric tag for relative and absolute quantitation）技術(shù)，在蛋白質(zhì)組層面研究多粘類芽孢桿菌JSa-9廣譜抗革蘭氏陽性細(xì)菌、絲狀真菌的環(huán)狀脂酯肽抗生素LI-F型肽段AMP-jsa9拮抗蠟狀芽孢桿菌的作用模式。endprint

4 菌株選育

菌種選育是發(fā)酵產(chǎn)量提高的前提和基礎(chǔ)，一般是將菌株經(jīng)過物理或化學(xué)誘變，從中篩選出正突變菌株。紫外線等射線等化學(xué)物理方法是常見的誘變手段，等離子體近年也作為誘變方法。這些方法可單獨(dú)使用，也可組合使用[4]。閆冬等[26]采用亞硝基胍（NTG）、60Co-λ射線和低能N+離子注入3種方法誘變多粘類芽孢桿菌JSa-9，從300株突變株中發(fā)現(xiàn)了2株LI-F類抗菌脂肽產(chǎn)量均提高的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，2菌株遺傳穩(wěn)定性良好。有研究者基于代謝工程選育高產(chǎn)菌，如Okonkwo等[27]研究產(chǎn)2，3-丁二醇多粘類芽孢桿菌對(duì)高濃度2，3-丁二醇的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生2，3-丁二醇的最高濃度為47 g/L，2，3-丁二醇濃度超過極限值60 g/L后多粘類芽孢桿菌會(huì)將2，3-丁二醇轉(zhuǎn)化成乙偶姻。因此得出，設(shè)計(jì)多粘類芽孢桿菌2，3-丁二醇高產(chǎn)菌要克服2，3-丁二醇毒性和消除2，3-丁二醇的降解。還有研究者采用定向進(jìn)化技術(shù)、組合生物合成和合成生物學(xué)等改造菌株。左佃光等[28]綜述了微生物非核糖體肽組合生物合成的研究策略，如NRPS基因簇的定點(diǎn)突變、NRPS模塊的替換、NRPS模塊的插入、NRPS模塊的刪除、NRPS組成模塊的“洗牌”以及NRPS基因簇的異源表達(dá)。多粘類芽孢桿菌EJS-3是從中藥植物組織中篩選分離到，其體外溶栓效果良好，但此菌株纖溶酶活性較低，錢輝等[29]克隆了纖溶酶基因整合到有AOX強(qiáng)效啟動(dòng)子的畢赤酵母中分泌表達(dá)，獲得了纖溶酶產(chǎn)量是野生菌株2.6倍的重組酵母。

5 發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化

發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化一般考慮培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化和發(fā)酵過程優(yōu)化3個(gè)角度。培養(yǎng)基優(yōu)化主要是選擇適宜菌株生長(zhǎng)、有利于目的產(chǎn)物大量表達(dá)、成本低、后處理工藝簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，工業(yè)生產(chǎn)還要注重培養(yǎng)基原料的穩(wěn)定性[4]。正交試驗(yàn)（Orthogonal experiment）和響應(yīng)面分析方法（Response surface methodology）常用于發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化[30-33]。

多粘類芽孢桿菌是目前發(fā)現(xiàn)惟一能高效生產(chǎn)光學(xué)純（R，R）-2，3-丁二醇的天然微生物，李億等[34]利用玉米粉高效發(fā)酵多粘類芽孢桿菌生產(chǎn)（R，R）-2，3-丁二醇。杜敬河等[35]采用單因素試驗(yàn)探索多粘類芽孢桿菌生產(chǎn)甲殼素酶的最佳條件。程愛芳等[36]采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化多粘類芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件。程愛芳等[37]采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化多粘類芽孢桿菌HD-1產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件。孫仲奇等[38]為了提高多粘菌素E產(chǎn)量，研究了5種碳源，發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉有助于延長(zhǎng)多粘菌素E的產(chǎn)素期和提高其合成速率。韓俊華等[39]采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化多粘類芽孢桿菌HT16產(chǎn)生抗菌蛋白的培養(yǎng)基。趙國(guó)群等[40]采用新鮮鴨梨渣為主要原料，固態(tài)發(fā)酵多粘類芽孢桿菌，采用單因素試驗(yàn)法研究培養(yǎng)條件對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)芽孢的影響，發(fā)現(xiàn)鴨梨渣是多粘類芽孢桿菌良好的固態(tài)發(fā)酵原料。

6 結(jié)語

學(xué)者們對(duì)多粘類芽孢桿菌功能和應(yīng)用領(lǐng)域已有比較全面的了解，在其分子生物學(xué)作用機(jī)制以及菌株的分子生物學(xué)改造技術(shù)等方面還有較大的研究空間，進(jìn)一步完善其分子操作系統(tǒng)、相關(guān)基礎(chǔ)研究，能為其深入利用提供前提條件。目前，多粘類芽孢桿菌的田間應(yīng)用等領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化推廣還存在一些限制條件，需要通過研究加以突破，比如田間應(yīng)用中多粘類芽孢桿菌易受環(huán)境的影響，需深入研究其在復(fù)雜土壤環(huán)境中的表現(xiàn)。

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