譚仕旦

摘要：為研究豬鏈球菌2型對(duì)恩施黑豬的致病性，采用分組試驗(yàn)法，選取同窩8頭恩施黑豬，隨機(jī)分組，試驗(yàn)組（6頭）注射豬鏈球菌2型菌液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對(duì)照組（2頭）正常飼喂，觀察記錄50 h的試驗(yàn)情況。結(jié)果表明，試驗(yàn)組豬全部發(fā)病，體溫升高、呼吸迫促、敗血癥和神經(jīng)癥狀；剖檢病（處）死豬尸體可見(jiàn)不同程度的腦膜充血淤血、關(guān)節(jié)炎、心肌炎、肺淤血、出血性炎癥等病理變化，對(duì)照組無(wú)異常。證實(shí)了豬鏈球菌2型對(duì)恩施黑豬有很強(qiáng)的致病性。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌2型；恩施黑豬；致病性；攻毒試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S858.28；S855.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2017）010-0007-02

豬鏈球菌?。⊿wine streptococcosis）是由豬鏈球菌引起豬的一種發(fā)病急、死亡率高的細(xì)菌性傳染病，被列入我國(guó)動(dòng)物傳染病中的二類病，人畜共患病，嚴(yán)重地威脅著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和人類食品公共衛(wèi)生安全，引起了人們的高度重視。近年來(lái)，依據(jù)鏈球菌莢膜抗原的不同，人們將其分為 35 個(gè)血清型（1～34型和1/2 型）[1]。其中豬鏈球菌 2型（Strptococcus suis type 2， 簡(jiǎn)稱SS2）被認(rèn)為是豬鏈球菌 35個(gè)血清型中分布最廣致病性最強(qiáng)的一個(gè)血清型，人感染后可引起化膿性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合癥等[2]。1998年江蘇海安縣暴發(fā)豬鏈球菌病，25人感染，死亡14人；2005年7月四川省資陽(yáng)市暴發(fā)豬鏈球菌病，并見(jiàn)有人感染而引起死亡的報(bào)道[1]。

近年來(lái)，因恩施黑豬的肉質(zhì)好，養(yǎng)殖效益高，恩施黑豬養(yǎng)殖量日益增加，但在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，時(shí)常發(fā)生疑似鏈球菌混合感染的病例。為了有效防控黑豬鏈球菌病的發(fā)生，特開(kāi)展本次試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 菌株

豬鏈球菌2型菌株[3]來(lái)源于長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離制備的菌液。

1.2 試劑

TSA、TSB購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，按說(shuō)明書(shū)制備培養(yǎng)基；生化鑒定試劑購(gòu)自杭州天河微生物有限公司；豬鏈球菌2型高免血清由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院制備并保存[4]。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)豬選取90日齡、體重25 kg左右的同窩恩施黑豬，購(gòu)自恩施咸豐尖山鄉(xiāng)某農(nóng)戶。

選擇豬群采食量正常，試驗(yàn)前用滅菌拭子采集鼻腔、扁桃體樣本檢測(cè)SS2為陰性，同時(shí)對(duì)頸靜脈采血，用ELISA方法檢測(cè)其SS2抗體均為陰性。

1.4 菌種的復(fù)蘇與菌液的制備

室溫下解凍菌種，在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取少許菌種，以分區(qū)劃線法接種在TSA平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。眼觀復(fù)蘇菌種在TSA平板上的菌落大小、邊緣整齊度、濕潤(rùn)度、隆起度、表面光滑度、顏色等。挑選單個(gè)可疑菌落作標(biāo)記后，挑取少許按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色，觀察革蘭氏染色后細(xì)菌在顯微鏡下的狀態(tài)。取鏡檢后確認(rèn)的細(xì)菌按常規(guī)方法接種于TSA平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。挑取單菌落接種THB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。各菌平板法計(jì)數(shù)后，調(diào)整菌液濃度至1×109 CFU/mL，備用。

1.5 試驗(yàn)豬的感染與臨床觀察

本試驗(yàn)分A、B兩個(gè)組，A組為6頭恩施黑豬，B組為2頭恩施黑豬。試驗(yàn)前將A、B兩組分別飼養(yǎng)在獨(dú)立的欄中，預(yù)試期7 d。攻毒試驗(yàn)前測(cè)量每頭豬的體溫。

取“1.4”中制備好的菌液，對(duì)A組豬采用頸部肌肉注射，每頭注射6 mL，為試驗(yàn)組。B組不注射為對(duì)照組。攻毒后，保障充足的飼料和飲水，每天觀察豬的臨床表現(xiàn)，如飲食情況、體溫變化、跛行和神經(jīng)癥狀等。每4 h測(cè)量全部豬的直腸溫度。

1.6 試驗(yàn)豬的病料采集與處理

死后立即解剖、拍照，無(wú)菌收集其肝臟、脾臟、心血、腦脊液、胃大小彎水腫液、腸淋巴結(jié)等，分別放入液氮罐和甲醛中固定，觀察記錄病死豬的病理學(xué)變化。對(duì)未死的試驗(yàn)豬50 h后進(jìn)行人工處死，記錄各器官的病理變化，進(jìn)行細(xì)菌涂片、染色及鏡檢，并在TSA平板上劃線分離培養(yǎng)。

1.7 病料細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)

尸體剖檢取實(shí)質(zhì)器官，淋巴結(jié)、肝、脾、肺、腎稱重后按10 mL/g加滅菌生理鹽水，充分研磨，倍比稀釋至10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13稀釋度。每個(gè)稀釋度取10 μL涂布法接種3個(gè)TSA平板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，檢驗(yàn)平板。

1.8 免疫器官的病理學(xué)觀察

將試驗(yàn)豬主要病變組織按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)及組織病理學(xué)檢驗(yàn)，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

對(duì)照組的豬飲食、體溫等均正常，無(wú)明顯的臨床癥狀。試驗(yàn)組的豬接種豬鏈球菌2型菌液均出現(xiàn)臨床癥狀和病理變化，接種3 h后出現(xiàn)了如扎堆、精神委頓、食欲不振或廢食、結(jié)膜潮紅、樹(shù)枝狀充血，流淚，可見(jiàn)黏液樣鼻涕流出。仔細(xì)觀察黑豬的皮膚色澤，可見(jiàn)頸部、耳廓、腹下及四肢下端皮膚發(fā)紺，有出血點(diǎn)，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程豬喜臥，皮膚肌肉顫抖，糞便干燥，便秘且個(gè)別糞便夾血，有個(gè)別豬拉稀。病情嚴(yán)重的臨死前出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、角弓反張等神經(jīng)癥狀。其中有兩頭豬在接種后35～48 h內(nèi)死亡。攻毒后體溫上升。

2.2 病理變化

對(duì)照組進(jìn)行剖檢，眼觀和顯微鏡下觀察組織切片均為正常組織狀態(tài)，無(wú)病變。

對(duì)試驗(yàn)組已經(jīng)死亡的豬及瀕死期處死的病豬進(jìn)行剖檢，病變主要表現(xiàn)為敗血癥癥狀（圖1），病豬腹部皮下有出血點(diǎn)，血液凝固不良；腎臟有點(diǎn)狀出血點(diǎn)，被膜難剝離，腎皮質(zhì)彌散性出血；肝臟腫大，表面有出血點(diǎn)，質(zhì)度變脆；肺臟水腫，淤血；全身淋巴結(jié)腫大、出血，尤其頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)表現(xiàn)最為明顯；心臟內(nèi)膜有出血點(diǎn)，心肌質(zhì)地變軟；脾臟腫大、出血；扁桃體腫大，有出血點(diǎn)；胃內(nèi)膜出血。endprint

2.2.1 心臟病變 試驗(yàn)組豬心肌組織結(jié)構(gòu)破壞，閏盤(pán)消失；心肌細(xì)胞顆粒變性，腫大，胞漿中見(jiàn)大量紅色蛋白性顆粒（圖2）；心肌細(xì)胞水泡變性，腫脹、淡染，有的細(xì)胞呈空泡狀。對(duì)照組豬心肌結(jié)構(gòu)清晰（圖3）。

2.2.2 肝臟病變 試驗(yàn)組豬肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，索狀結(jié)構(gòu)消失，肝竇擴(kuò)張，充滿紅細(xì)胞和其他血細(xì)胞（圖4）；細(xì)胞核凝固溶解，肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)空泡樣變性，中央靜脈發(fā)生淤血。對(duì)照組豬肝細(xì)胞索明顯可見(jiàn)。

2.2.3 脾臟病變 試驗(yàn)組豬脾臟可見(jiàn)大面積出血，紅白髓混亂，脾小結(jié)不明顯，嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴細(xì)胞減少；壞死性脾炎，出血壞死部分細(xì)胞脫落。

2.2.4 肺臟病變 試驗(yàn)組豬肺臟可見(jiàn)間質(zhì)性肺炎，肺泡隔充血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間隔明顯增寬，肺泡縮??；有的在肺泡間質(zhì)可見(jiàn)大量纖維素滲出物和少量中性炎性粒細(xì)胞，脫落的肺泡上皮細(xì)胞。對(duì)照組豬肺泡壁薄、肺泡腔內(nèi)沒(méi)有黏液等異物。

2.2.5 腎臟病變 試驗(yàn)組豬腎小球體積腫大，充滿整個(gè)腎小囊；腎小管上皮細(xì)胞腫脹、出血（圖5），管壁增厚，局部腎小管上皮細(xì)胞開(kāi)始脫落。對(duì)照組豬腎小球、腎小管清晰可辨，未見(jiàn)異常。

2.3 細(xì)菌分離鏡檢

取實(shí)質(zhì)器官淋巴結(jié)、肝、脾、肺、腎病料培養(yǎng)的菌落進(jìn)行細(xì)菌染色、鏡檢，病料中培養(yǎng)出了與攻毒株SS2形態(tài)特征完全相同的細(xì)菌菌落。

3 小結(jié)與討論

以鏈球菌2型對(duì)恩施黑致病性的臨床觀察和組織病理學(xué)觀察得出結(jié)論，豬鏈球菌2型對(duì)恩施黑豬具有很強(qiáng)的致病性。從試驗(yàn)的組織病理學(xué)觀察結(jié)果可見(jiàn)，感染豬呈現(xiàn)多器官組織出血為主的急性敗血癥變化，特別是肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和腎臟出血較為嚴(yán)重，此外也可見(jiàn)腦膜炎、心肌炎和關(guān)節(jié)炎等病變，這與崔立等[5]用SPF巴馬小型豬研究結(jié)果一致。本次試驗(yàn)用豬鏈球菌2型菌株對(duì)恩施黑豬進(jìn)行攻毒成功復(fù)制了該病，其臨床癥狀和病理變化已基本清楚，但由于豬鏈球菌的血清型多，致病性復(fù)雜多變，關(guān)于豬鏈球菌2型感染動(dòng)物的致病機(jī)制雖有一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了一定的研究，但仍不完全清楚，還有待于繼續(xù)深入研究。

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