魯豫

摘要：為了解百草枯對(duì)哺乳動(dòng)物肝臟損傷的特性，以便有效尋找針對(duì)性治療藥物，試驗(yàn)建立了小鼠模型，分別向昆明白雄鼠腹腔注射30、60、90 mg/kg不同濃度的百草枯，各處理分別于6、12 h以及1、3、7 d后測(cè)定血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性，對(duì)百草枯染毒的各濃度處理小鼠肝臟進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，觀察其病理學(xué)變化，然后選取中劑量60 mg/kg處理的不同時(shí)間組（6、12 h以及1、3、7 d），通過Realtime PCR檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3、Caspase-8基因表達(dá)變化。結(jié)果表明，百草枯30、60、90 mg/kg不同濃度處理的血清ALT、AST活性在不同處理時(shí)間上均高于對(duì)照，在7 d后各血清ALT、AST活性均又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)在處理3 d后的30 mg/kg的小鼠肝臟病理學(xué)變化不明顯，90 mg/kg處理出現(xiàn)較為明顯的炎癥變化。Realtime PCR結(jié)果顯示，60 mg/kg不同時(shí)間處理的IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3、Caspase-8基因表達(dá)從6 h后開始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在3 d后基因表達(dá)略有下降。不同濃度的百草枯對(duì)小鼠肝臟均有損傷，高劑量百草枯對(duì)肝臟損傷較嚴(yán)重，且對(duì)血清中免疫因子和相關(guān)基因的表達(dá)有顯著影響。

關(guān)鍵詞：百草枯；小鼠；肝臟損傷；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S482.4：R994.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）18-3515-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.031

Abstract： In order to study the liver damage characteristics of Paraquat in mammals. This experiment by establishing mice model were studied. Respectively to the male mice celiac injection of different concentration of Paraquat（30，60，90 mg/kg）， the experimental group were determined in the serum ALT and AST activity on 6 h，12 h，1 d，3 d and 7 d. Observe the patholodical changes of mice liver tissue was contaminated by various concentrations PQ after three days，then select 60 mg/kg dose group concentration in treatment group at different times（6 h，12 h，1 d，3 d，7 d）. We detected the expression of IL-1β，IL-6，TNF-α，Caspase-3，Caspase-8 by Realtime PCR. Different concentrations of experimental group serum ALT， AST activity in different time were significantly higher than the control group， the activity were lower after 7 days. The coloration results showed that liver histopathological changes （30 mg/kg） is not significant on 3 days， and the 90 mg/kg experimental group was changed significantly. Realtime PCR results showed that the related gene（60 mg/kg） expression began to rise after 6 hours，and the gene expression declined after 3 days. All the liver damage was serious， high dose concentration of Paraquat on liver tissue damage more serious. Different doses of Paraquat on serum immune factors and has remarkable effect on the expression of related genes.

Key words： Paraquat； mice； liver injury； gene expression

百草枯（Paraquat，PQ）又名克無(wú)蹤，化學(xué)名稱為1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，是世界各國(guó)農(nóng)作物常用的除草劑，具有較強(qiáng)的毒性，尤其對(duì)人的毒性極大，是一種潛在的環(huán)境危險(xiǎn)因素，因此要重視百草枯的殘留問題。有報(bào)道稱百草枯中毒表現(xiàn)為早期的肺水腫、肺出血及肺不張等急性肺損傷癥狀，后期多死于呼吸衰竭[1]。沈明浩等[2]發(fā)現(xiàn)妊娠末期大鼠注射百草枯會(huì)引起胎鼠動(dòng)脈管的收縮。夏勇等[3]發(fā)現(xiàn)百草枯導(dǎo)致斑馬魚各項(xiàng)指標(biāo)變化，延緩斑馬魚胚胎發(fā)育，造成胚胎致死或畸型。百草枯攝入后能分布于機(jī)體的各組織器官，但主要聚集在肺、腎、肝等器官中，會(huì)導(dǎo)致其氧化損傷與纖維化病變[4]。百草枯中毒后在體內(nèi)主要作用于肺組織，重度中毒患者常出現(xiàn)急性肝功能障礙[5]。肝臟是機(jī)體代謝的重要器官，肝組織細(xì)胞一旦受損傷，將影響機(jī)體的代謝平衡。試驗(yàn)通過設(shè)置不同劑量的百草枯及染毒的不同時(shí)間處理，觀察肝組織的病理學(xué)變化、血液生化反應(yīng)以及相關(guān)基因分子水平上的變化、不同劑量的百草枯及染毒的不同時(shí)間對(duì)小鼠肝臟的損傷情況，以便有針對(duì)性地尋找有效的治療性藥物。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用百草枯購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

采用清潔級(jí)昆明種系的21 dpp雄性小鼠為參試動(dòng)物，體重范圍在14～16 g，購(gòu)自菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校。按隨機(jī)法將小鼠分為4組：對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，不給予任何處理；染毒組分別腹腔注射濃度為30、60、90 mg/kg的百草枯。每個(gè)染毒組再分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只，分別染毒6 h、12 h、1 d、3 d、7 d后處死，采集血液及組織標(biāo)本。

1.3 肝組織病理學(xué)觀察

取各組梁毒3 d小鼠的肝組織，一部分組織放入液氮中凍存，用于提取RNA，另外一部分組織置于4%的多聚甲醛中固定，然后進(jìn)行梯度乙醇脫水（30%、40 min，50%、40 min，70%、1 h，83%、1 h，95%、40 min，無(wú)水乙醇、30 min，無(wú)水乙醇、20 min），接著在二甲苯中透明，再將浸好蠟的組織進(jìn)行包埋，切片，烤片。然后進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度乙醇復(fù)水，再用蘇木精-伊紅染液進(jìn)行HE染色。通過鏡檢，觀察肝組織的病理學(xué)變化。

1.4 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，將小鼠通過摘眼球取血液1 mL，離心分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 肝組織基因表達(dá)變化檢測(cè)

選取60 mg/kg百草枯的5個(gè)不同時(shí)間處理，通過Realtime PCR檢測(cè)5種基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3和Caspase-8）表達(dá)的變化，首先提取小鼠肝組織的RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成單鏈的cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA按照TaKaRa SYBR Premix EX Taq試劑盒說(shuō)明書在ABI7500 Realtime PCR系統(tǒng)中反應(yīng)，基因特異性引物序列見表1，以GAPDH作為內(nèi)參（對(duì)照）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有處理都3次重復(fù)，取均值，最終數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表述。對(duì)多于2個(gè)處理的數(shù)據(jù)用單因素方差分析，2個(gè)處理用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒表征

觀察發(fā)現(xiàn)，百草枯染毒后，對(duì)照組小鼠精神表現(xiàn)正常，食欲正常，呼吸均勻，體重沒有減輕；百草枯30 mg/kg劑量組在染毒1 d后出現(xiàn)輕微的食欲不振等現(xiàn)象，無(wú)其他明顯癥狀，在6～7 d時(shí)食欲逐漸恢復(fù)；百草枯60 mg/kg劑量組在染毒1 d后表現(xiàn)出較明顯的中毒癥狀，進(jìn)食少，體重下降，嗜睡；百草枯90 mg/kg劑量組在染毒6 h后就表現(xiàn)出較明顯的中毒癥狀，步態(tài)不穩(wěn)，煩躁，在3 d后癥狀更明顯，表現(xiàn)為呼吸急促、進(jìn)食少、反應(yīng)遲鈍、嗜睡、體重下降、易捕捉等癥狀。

2.2 小鼠肝組織病理學(xué)變化

百草枯染毒后小鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果見圖1。從圖1可知，對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常并且整齊排列，肝組織血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常；百草枯30 mg/kg劑量組在3 d后肝組織細(xì)胞排列緊密，但肝細(xì)胞略微腫脹；百草枯60 mg/kg劑量組在3 d后肝細(xì)胞略有腫脹，肝血竇和中央靜脈周圍開始有輕微淤血；百草枯90 mg/kg劑量組在3 d后肝組織細(xì)胞排列稍顯松散，肝細(xì)胞腫脹明顯，肝血竇和中央靜脈周圍出現(xiàn)淤血，肝血竇萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 小鼠血清中的ALT、AST水平比較

小鼠血清中ALT和AST水平常作為肝細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)，試驗(yàn)里百草枯染毒后，小鼠血清中ALT、AST活性測(cè)定結(jié)果分別見表2、表3。從表2可見，百草枯90 mg/kg劑量組的ALT活性最高，在處理12 h、1 d、3 d后均顯著高于對(duì)照（P<0.05），在 7 d后不同百草枯濃度處理的ALT活性都略有降低。從表3可見，百草枯90 mg/kg處理的AST活性在處理6 h、12 h、1 d、3 d后均顯著高于對(duì)照（P<0.05），不同處理均在1 d后的AST活性最高，在3 d后和7 d后的AST活性略有降低。

2.4 小鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3和Caspase-8基因表達(dá)變化

IL-1β、IL-6、TNF-α是肝組織中相關(guān)炎性表達(dá)基因，Caspase-3和Caspase-8是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因。試驗(yàn)選取中劑量60 mg/kg百草枯的不同時(shí)間進(jìn)行處理，分別是6 h、12 h、1 d、3 d、7 d。通過Realtime PCR檢測(cè)IL-1β等的mRNA水平在處理后的變化，結(jié)果見圖2。從圖2可見，60 mg/kg百草枯處理6 h后，IL-1β表達(dá)水平明顯高于對(duì)照，在1 d時(shí)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照（P<0.05）；IL-6的表達(dá)水平也是在1 d后顯著高于對(duì)照（P<0.05）。同時(shí)檢測(cè)TNF-α的表達(dá)水平在1 d后達(dá)到最高，在3 d后表達(dá)水平開始下降。Caspase-3基因表達(dá)在處理1 d、 3 d后顯著高于對(duì)照（P<0.05），之后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；Caspase-8的表達(dá)則是在1 d后顯著高于對(duì)照（P<0.05），3 d后開始下降。

3 小結(jié)

百草枯是一種強(qiáng)有機(jī)氧化劑，農(nóng)業(yè)上多用作除草劑使用，一旦被誤食進(jìn)入人體內(nèi)，會(huì)經(jīng)過一系列氧化還原反應(yīng)形成高活性自由基，進(jìn)而誘導(dǎo)過氧化反應(yīng)，損傷體內(nèi)臟器[6]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)百草枯中毒病人其肺部蓄積量最多，進(jìn)而會(huì)影響機(jī)體呼吸系統(tǒng)導(dǎo)致呼吸衰竭[7]。此外，腎臟作為主要的代謝器官，高劑量的百草枯同樣會(huì)對(duì)腎臟造成嚴(yán)重?fù)p傷[8]。肝臟是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最重要的排毒代謝器官，高活性自由基的蓄積不僅會(huì)損傷肝組織，還會(huì)影響肝臟正常的代謝功能[9]。百草枯對(duì)機(jī)體的損傷研究較多的器官是肺臟，也有研究發(fā)現(xiàn)百草枯同樣會(huì)損傷肝臟。試驗(yàn)在此研究基礎(chǔ)上，深入研究了百草枯對(duì)小鼠肝臟的損傷特點(diǎn)。結(jié)果表明，百草枯對(duì)小鼠肝臟造成損傷后出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，這其中，血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α等免疫因子表達(dá)基因發(fā)揮著重要的作用；百草枯進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)通過多個(gè)途徑誘導(dǎo)這些免疫因子的基因表達(dá)，其中TNF-α發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它可以將中性粒細(xì)胞引進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)，并誘導(dǎo)肝庫(kù)浦弗細(xì)胞釋放氧自由基，同時(shí)加重肝臟微循環(huán)障礙，使肝組織出現(xiàn)缺血缺氧性損傷[10-12]。另外，TNF-α在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生后還會(huì)誘導(dǎo)IL-1β的生成。endprint

Caspase是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一組結(jié)構(gòu)類似的蛋白酶，在細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，起始Caspase和執(zhí)行Caspase共同組成細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的級(jí)聯(lián)分子網(wǎng)絡(luò)。Caspase-8在復(fù)合物中通過自身切割而被激活，進(jìn)而切割執(zhí)行者Caspase-3，產(chǎn)生有活性的Caspase-3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。

試驗(yàn)通過對(duì)不同濃度百草枯處理3 d后的小鼠肝臟組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，發(fā)現(xiàn)90 mg/kg劑量組在處理3 d后的肝組織中細(xì)胞排列稍顯松散，肝血竇和中央靜脈周圍出現(xiàn)淤血，肝血竇萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。通過測(cè)量小鼠血清中ALT和AST的活性，發(fā)現(xiàn)在處理12 h、1 d、3 d后ALT均顯著高于對(duì)照，7 d后不同濃度處理中ALT活性開始下降；同時(shí)90 mg/kg處理的AST活性在6 h、12 h、1 d、3 d后均顯著高于對(duì)照。通過Realtime PCR檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平，均在1 d后達(dá)到最高；Caspase-3和Caspase-8分別是在處理3 d后和1 d后表達(dá)最高。說(shuō)明不同劑量的百草枯對(duì)血清中免疫因子以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)均產(chǎn)生顯著影響。

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