張偉鑫，曾 仲

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院器官移植中心，昆明 650000)

研究報告

小鼠CD4+T細胞外泌體分離及鑒定

張偉鑫，曾 仲*

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院器官移植中心，昆明 650000)

目的探討CD4+T細胞是否具有分泌外泌體的能力，以及CD4+T細胞外泌體參與炎癥及腫瘤免疫過程的可能。方法應用斷頸處死的方法取出小鼠的脾臟，用磁珠分選的方法從小鼠脾臟細胞中分選出CD4+T細胞，并嘗試從培養(yǎng)基上清液中提取CD4+T細胞的外泌體，在透射電鏡下觀察，后用PCR技術分析miR-23a、miR-214的表達情況。結果在透射電鏡下能夠觀察到提取出的CD4+T細胞外泌體，且用PCR技術能檢測到小鼠CD4+T細胞外泌體中miR-23a、miR-214這兩個炎癥及腫瘤相關的miRNA的表達。結論小鼠CD4+T細胞有分泌外泌體的能力，且為CD4+T細胞外泌體參與炎癥及腫瘤相關過程提供了可能。

CD4+T細胞；外泌體；分離；鑒定；miRNA

外泌體(exosomes)是可由各種細胞脫落釋放的大小均一的直徑約為30～150 nm的脂質雙分子層結構的囊泡，其外面的脂質雙分子層膜可保護它內含物不受降解。其囊泡內含有脂質、蛋白質、mRNA、miRNA、siRNA等多種遺傳物質[1]。自1985年Pan等[2]人首次在成熟哺乳動物的網織紅細胞中觀察到后，眾多學者研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有細胞都可產生外泌體，其廣泛存在于血液、尿液、腹水

等體液中[3]。外泌體參與著人體許多重要的生理及病理過程,它在細胞的通訊及遷移、血管新生、炎

癥及免疫反應和腫瘤細胞的生長及遷徙浸潤等方面有著極為重要的作用[4]，因此外泌體的研究引起了眾多的關注。本文就小鼠CD4+T細胞是否能夠分泌外泌體進行驗證從而探尋CD4+T細胞外泌體參與炎癥及腫瘤相關過程提供可能。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級雄性BALB/c小鼠，體重20～22 g，6～8周齡，購自昆明醫(yī)學院(實驗動物中心)[SCXK(滇)2015-0008]，小鼠的組織取材于中國科學院昆明動物研究所動物實驗設施內進行[SYXK(滇)2013-0004]。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2主要試劑

小鼠淋巴細胞分離液(達科為公司)免疫磁珠分選儀(Miltenyi Biotec公司)；流式細胞儀(BD Biosciences公司)；小鼠CD4+T細胞磁珠分選試劑盒(Miltenyi Biotec公司)；培養(yǎng)細胞Exosome提取試劑盒(唯輝公司)；Exosome透射電鏡分析試劑盒(唯輝公司)；RPMI1640培養(yǎng)液和青霉素、鏈霉素雙抗(Hyclone公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(Hyclone公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 小鼠脾臟淋巴細胞懸液的制備

將小鼠斷頸處死后浸泡于75%的乙醇中，于超凈臺取出小鼠脾臟置于細胞篩網(70 μm)中，將細胞篩網置于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，加入5 mL小鼠淋巴細胞分離液，仔細研磨后將懸有脾臟細胞的分離液轉移到15 mL的離心管中，并小心覆蓋上500 μL的RPMI1640培養(yǎng)基，室溫下2600 r/min離心30 min(需設置較慢的加速度和減速度)。后小心吸出中間的淋巴細胞層，加入10 mL的RMPI1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌，于室溫下1600 r/min離心10 min，棄去上清液，收集細胞并計數(shù)。

1.3.2 CD4+T細胞懸液的制備

將得到的小鼠脾臟淋巴細胞懸浮于PBS磷酸鹽緩沖液中并調整細胞濃度為107個/90 μL。添加美天旎CD4(L3T4)磁性微珠并混勻4℃放置15 min，后加入PBS磷酸鹽緩沖液沖洗并1600 r/min離心10 min，棄去上清液，加入PBS磷酸鹽緩沖液重新懸浮細胞并調整濃度為108個/500 μL，將細胞加入已經沖洗好的美天旎MS型號分選柱中，待柱內細胞懸液流干后再加入500 μL PBS緩沖液沖洗3次，取下分選柱，放置在15 mL離心管上并加入1 mL緩沖液用柱塞沖洗出磁性標記細胞。

1.3.3 CD4+T細胞純度檢測

取上述經磁珠分選后的細胞于室溫下1600 r/min離心10 min后，棄去上清液，加入PBS磷酸鹽緩沖液調節(jié)細胞濃度為106/mL吹打混勻，取80 μL的細胞懸液，置于200 μL的離心管中，加入FITC anti-mouse CD3e和PE anti-mouse CD4各10 μL混勻后室溫避光放置30 min，之后上流式細胞儀進行檢測分析。

1.3.4 CD4+T細胞外泌體的提取

將細胞室溫下1600 r/min離心8 min后棄去上清液，用無血清的RMPI1640培養(yǎng)基調整CD4+T淋巴細胞濃度為2×107個/mL，在24孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入1 mL懸浮好的CD4+T淋巴細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中饑餓處理細胞48 h后收集2 mL細胞培養(yǎng)基，于4℃下4200 r/min離心10 min去除細胞和細胞碎片，轉移2 mL上清液到玻璃管中并加入現(xiàn)配好的exosome提取液，渦旋混勻并于4℃中靜置30 min，可見玻璃管中出現(xiàn)明顯分層，吸出管中的exosome層置于1.5 mL微量離心管中9000 r/min離心3 min后棄去管中上層和底層再將中間的exosome層轉移到0.5 mL微量離心管中9000 r/min離心3 min后棄去管中上層和底層只留下中間的exosome層，將管蓋打開晾干5 min后加入80 μL PBS緩沖液到微量離心管中并用移液槍劇烈吹打后在水平搖床上高速搖動管子10 min使exosome層再次懸浮，將管子9000 r/min離心5 min，轉移上清液到試劑盒提供的過濾柱中，將柱子4200 r/min離心5 min，收集到的液體即為exosome懸液。

1.3.5 CD4+T細胞外泌體的電鏡觀察

在干凈的Parafilm膜上滴10 μL exosome懸液，取一張exosome透射電鏡分析試劑盒中提供的EM網，將其涂層面朝下貼在exosome懸液表面讓其在干燥環(huán)境中吸收10 min。用鑷子將EM網(涂層面朝下)轉移到清洗緩沖液中清洗30 s后再重復清洗一次。于干凈的封口膜上，滴10 μL的EM溶液，轉移EM網(涂層面朝下)到EM溶液中靜置10 min后，轉移EM網到清洗緩沖液中清洗30 s后再重復清洗一次。轉移EM網到濾紙上(涂層面朝上)，室溫下風干過夜。將EM網置于透射電鏡下觀察。

1.3.6 PCR技術檢測相關的miRNA的表達

利用PCR技術檢測miR-23a、miR-214這兩個炎癥及腫瘤相關的miRNA其在小鼠CD4+T細胞外泌體中的表達。(見表1)

表1 引物列表

2 結果

2.1CD4+T純度檢測

從小鼠脾臟細胞中利用磁珠分選的方法分離獲得的CD4+T細胞純度為(90.1±5.8)%可以用于后續(xù)實驗(見圖1)。

圖1 CD4+T細胞純度檢測結果Fig.1 CD4+T cells purity test results

2.2CD4+T細胞外泌體的電鏡觀察

將CD4+T細胞經饑餓處理后通過分離與純化其上清液中的外泌體，在透射電鏡下觀察到小鼠CD4+T細胞外泌體呈圓形或橢圓形，其大小不一，直徑約在80 nm左右，可見有明顯的膜性結構，其腔內為低電子密度成分(見圖2)。

圖2 透射電鏡下觀察到的CD4+T細胞外泌體Fig.2 CD4+T cell exosomes observed under TEM

2.3利用PCR技術檢測特定miRNA的表達

利用PCR技術能檢測到外泌體中miR-23a、miR-214這2個miRNA的表達。在普通PCR電泳中在約100 bp處，5個樣品都出現(xiàn)條帶，由于產物大小和引物二聚體大小比較接近，因此從電泳圖上看起來是一條單一的條帶(見圖3)。而在Real Time PCR中溶解曲線上出現(xiàn)不單一峰，說明除了目標miRNA外可能存在其他產物。但是本實驗采用的方法為莖環(huán)法，其特異性相對較高。產物不單一，存在的可能引物二聚體，因此，膠圖和曲線二者結果基本吻合。(見圖4)

注：(1)為引物mmu-miR-23-3p-F/mmu-miR-R組；(2)為引物mmu-miR-23-5p-F/mmu-miR-R組；(3)為引物mmu-miR-214-5p-F/mmu-miR-R組；(4)為引物mmu-miR-214-3p-F/mmu-miR-R組；(5)為內參U6-F/U6-R組。圖3 普通PCR結果Note.(1)Primer mmu-miR-23-3p-F/mmu-miR-R group；(2)Primer mmu-miR-23-5p-F/mmu-miR-R group；(3)Primer mmu-miR-214-5p-F/mmu-miR-R group；(4)Primer mmu-miR-214-3p-F/mmu-miR-R group；(5)Internal reference U6-F/U6-R group.Fig.3 Ordinary PCR electrophoresis results

3 討論

外泌體是由細胞內的多泡體與胞漿膜融合然后釋放到胞外的一種脂質雙分子層結構的囊泡, 直徑約30～150 nm, 其廣泛存在于各種體液中如血液、尿液、唾液等，其囊泡內含有脂質、蛋白質、mRNA、miRNA、siRNA等多種遺傳物質[5，6]。外泌體被細胞釋放入外環(huán)境后，可以通過受體介導、直接彌散、內吞作用等方式來進入靶細胞，由于其內含有生物活性脂質、蛋白、核酸等，故其可以向受體細胞傳遞各種遺傳信息進而發(fā)揮各種生物學功能，從而影響靶細胞細胞的生長狀況，進而介導疾病的發(fā)生和發(fā)展[7]。這些外泌體所攜帶的RNA被統(tǒng)稱為外泌體來源RNA(exosome shuttle RNA，esRNA)。已經有研究發(fā)現(xiàn)EsRNA擁有相對穩(wěn)定的特性，能在一定程度上代表其母細胞的miRNA水平。因此，esRNA擁有作為分子診斷標記和靶向治療的潛力[8]。在腫瘤相關方面esRNA有著誘導腫瘤細胞的侵襲性以及保持腫瘤細胞的致瘤性的能力[9]。

注：(A)熔解曲線；(B)熒光曲線；(C)擴增曲線。圖4 Real Time PCR結果Note.(A)Melting curve；(B)Fluorescence curve；(C)Amplification curve.Fig.4 Real-time PCR results

本實驗已經證實了小鼠CD4+T細胞分泌的外泌體中能夠檢測到miR-23a、miR-214這2個miRNA的表達。對于miRNA-23a，已有研究證明其參與著炎癥反應以及腫瘤相關的過程。研究學者Li等[10]研究了臨床肝炎患者血清中的miRNA表達譜后發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎患者血清中miR-23a的表達明顯升高。還有研究學者研究發(fā)現(xiàn)，在牙周炎患者其牙齦組織中的miR-23a的表達高于健康者[11，12]，提示了miR-23a極有可能與炎癥反應的發(fā)生以及發(fā)展有關。miRNA-23a在腫瘤相關方面，已有研究顯示其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有著非常密切的關系，其一般扮演致癌基因的作用，參與著多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程。如：有研究學者發(fā)現(xiàn)， miR-23a能夠直接地靶向抑制轉移抑制因子1蛋白的表達，進而能夠促進結腸癌細胞的生長以及侵襲轉移的能力。其臨床研究還說明miR-23a在結腸癌中的表達上調，并且隨著臨床分期的演進以及浸潤深度的增加而增加，其有可能成為腸黏膜惡性轉變以及結腸癌發(fā)生浸潤轉移的重要的生物學標志[13，14]。而對于miR-214，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，miR-214在多種惡性腫瘤中均有異常表達，但其在不同腫瘤中的表達情況卻不盡相同，具有一定的腫瘤特異性。有研究學者Zhang等[15]人研究發(fā)現(xiàn)，miR-214在胰腺癌中呈現(xiàn)高表達，其能夠促進胰腺癌細胞的生存并能降低腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性。還有Yang等[16]人研究發(fā)現(xiàn)：miR-214可以促進卵巢癌細胞的存活，并能夠降低對化療藥物順鉑的敏感性。而另外有一些學者報道：miR-214在腫瘤中則呈低表達，如研究顯示，在宮頸癌細胞系Hela以及Caski細胞中，TFAM蛋白的表達量明顯升高，但miR-214的表達量卻呈現(xiàn)明顯的下降。而當在這兩種細胞中上調miR-214的表達，能夠明顯的抑制宮頸癌細胞的增殖及細胞周期進展，進一步的研究顯示：TFAM是miR-214的靶基因之一，而且miR-214可以通過降低TFAM的表達來達到延緩腫瘤發(fā)展，并增加宮頸癌細胞對化療藥物的敏感性的目的[17]。

CD4+T細胞不是功能單一的一類細胞,它是一群功能復雜的細胞群。其各亞群在細胞免疫反應都有著極為重要的作用。其不僅能輔助細胞毒性T細胞,還可以協(xié)助NK細胞清除和殺滅腫瘤，甚至還有著不依賴于CD8+T細胞的腫瘤殺傷作用，它在機體抗腫瘤免疫中有著重大的意義[18，19]。在現(xiàn)階段在臨床研究中，已經有學者研究得出輸注CD4+T細胞,可以有效防止接種了血液或實體腫瘤細胞的動物發(fā)病[20]。

本實驗已經證實了CD4+T細胞具有著分泌外泌體的能力，且在其分泌的外泌體中檢測到miR-23a、miR-214，這兩個免疫及腫瘤相關的miRNA的表達，而恰恰CD4+T細胞的功能也與炎癥及腫瘤相關，是否CD4+T細胞在執(zhí)行其免疫及腫瘤相關的功能時有著miR-23a、miR-214的參與？值得我們去深入研究。本實驗為CD4+T細胞外泌體參與CD4+T細胞執(zhí)行其炎癥及腫瘤過程提供了可能，并且CD4+T細胞是一群功能較為復雜的細胞群，其分泌的外泌體必定是多種多樣的，其中所含的miRNA必定更為復雜，這些miRNA是否能發(fā)揮作用？怎樣去發(fā)揮作用？我們依舊不甚清楚，這值得廣大學者們深入探索。

總之，對外泌體的研究國內依舊處于初級階段，對外泌體的研究還有著諸多的困難，對于外泌體發(fā)揮作用的具體機制，也需進一步的探究。相信隨著科技的發(fā)展以及人們對外泌體認識的日益加深，外泌體中蘊含的豐富信息將會被人們所了解并運用到對疾病的治療中去。

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IsolationandidentificationofexosomesofCD4+Tcellsinmice

ZHANG Wei-xin， ZENG Zhong*

(Organ Transplantation Center,The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000，China)

ObjectiveTo explore whether CD4+T cells in mice can secrete exosomes and the possibility of exosomes to participate in the inflammation and immune response process.MethodsSpleen samples were taken from mice, and CD4+T cells were isolated from the spleen tissue using magnetic bead separation method. Exosomes of CD4+T cells were extracted from the supernatant and observed under transmission electron microscope. PCR assay was used to detect the expression of miR-23a and miR-214.ResultsExosomes were observed under elecron microscope,and the expression of miR-23a and miR-214 were detected by PCR assay.ConclusionsCD4+T cells in mice can secrete exosomes,which offer possibility to participate in the inflammation and immune response.

CD4+T cells; Exosome; Isolation; Identication; MiRNA

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0060-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.012

2017-02-28

云南省衛(wèi)生科技計劃基金資助項目(2014NS155)。

張偉鑫(1990-)，男，碩士研究生，主要從事肝膽外科疾病的臨床研究。E-mail: 815564969@qq.com

曾仲(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事肝膽外科疾病的臨床研究。E-mail: zzong@medmail.com.cn