邊雅倩， 許國(guó)超， 倪 曄

（江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

重組大腸桿菌產(chǎn)雙乙酰還原酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

邊雅倩， 許國(guó)超， 倪 曄*

（江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

光學(xué)純2，3-丁二醇是重要的手性合成砌塊。采用雙乙酰還原酶催化還原雙乙酰底物是一種合成光學(xué)純2，3-丁二醇的綠色方法。作者在搖瓶中對(duì)產(chǎn)雙乙酰還原酶重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘油5 g/L，酵母浸膏10 g/L，魚粉蛋白胨 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L；優(yōu)化后的誘導(dǎo)條件為37℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基中，37℃和0.1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)發(fā)酵6 h，單位菌體（干重）產(chǎn)雙乙酰還原酶量達(dá)13.84 kU/g，產(chǎn)酶水平達(dá)33.65 kU/L，分別為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的2.04和4.23倍，LB培養(yǎng)基的1.16和1.71倍。在此最優(yōu)條件，在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了重組大腸桿菌產(chǎn)雙乙酰還原酶的驗(yàn)證，發(fā)酵8 h時(shí)酶活最高，單位菌體產(chǎn)雙乙酰還原酶量達(dá)14.09 kU/g，產(chǎn)酶水平達(dá)64.62 kU/L。本研究為高效制備可用于不對(duì)稱還原合成光學(xué)純2，3-丁二醇的雙乙酰還原酶奠定了基礎(chǔ)。

重組大腸桿菌；雙乙酰還原酶；發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化；誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2，3-丁二醇是一種非常重要的化合物，在防凍劑、油墨、香水和軟化劑等的合成中具有廣泛的用途，還可作為液體燃料以及用于制備甲乙酮及1，3-丁二烯[1]等化工原料。2，3-丁二醇有兩個(gè)手性碳原子，因此存在三種立體異構(gòu)體：（2S，3S）-2，3-丁二醇，（2R，3R）-2，3-丁二醇及 meso-2，3-丁二醇。 三種單一立體構(gòu)型的2，3-丁二醇由于存在不同手性基團(tuán)而具有不同的性質(zhì)，均可作為合成精細(xì)化學(xué)品、手性藥物及手性試劑的重要砌塊，例如：（2R，3R）-2，3-丁二醇可用于合成光學(xué)活性的2-甲基-1，4-丁二醇，而（2S，3S）-2，3-丁二醇對(duì)動(dòng)物體內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶活性具有抑制作用[2]。鑒于其重要的應(yīng)用價(jià)值，近些年國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)其合成進(jìn)行了研究。據(jù)報(bào)道許多微生物能夠發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇，但是產(chǎn)生的2，3-丁二醇一般至少為兩種立體異構(gòu)體的混合物[3]，因而其應(yīng)用具有一定的局限性。利用基因工程改造的微生物細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞生物催化可生產(chǎn)單一立體構(gòu)型的2，3-丁二醇，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注。其中，將雙乙酰還原酶在大腸桿菌中異源過(guò)量表達(dá)，并以雙乙酰為底物，通過(guò)連續(xù)兩步還原生成 （2S，3S）-2，3-丁二醇， 是合成光學(xué)純2，3-丁二醇的綠色、高效方法之一。

李理想等從陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae中克隆了一個(gè)2，3-丁二醇脫氫酶 （雙乙酰還原酶）基因并異源表達(dá)于大腸桿菌中，構(gòu)建了含有雙乙酰還原酶的重組大腸桿菌。以雙乙酰為底物，經(jīng)全細(xì)胞催化合成了（2S，3S）-2，3-丁二醇，產(chǎn)量達(dá) 26.8 g/L[4]。Wang Z等從紅平紅球菌Rhodococcus erythropolis中克隆了一個(gè)雙乙酰還原酶基因并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，該酶同時(shí)具有氧化1-苯乙醇的活力，可通過(guò)添加1-苯乙醇實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的循環(huán)。利用該重組酶不對(duì)稱還原雙乙酰生產(chǎn) （2S，3S）-2，3-丁二醇，產(chǎn)量最高可達(dá)5.24 g/L[5]。本課題組從地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis中克隆了一個(gè)具有高活性和選擇性的雙乙酰還原酶基因，將其成功異源表達(dá)于大腸桿菌中。為了實(shí)現(xiàn)重組酶在大腸桿菌的大量表達(dá)，降低重組酶制備的成本，作者對(duì)基因工程菌 Escherichia coli BL21 （DE3）/pET24abdh的發(fā)酵培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，并在發(fā)酵罐中進(jìn)行了重組大腸桿菌的放大培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 E.coli BL21（DE3）/pET24a-bdh，作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 （OXOID）10， 酵母提取物（OXOID）5，NaCl 10；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 5，酵母浸膏 5，魚粉蛋白胨5，NaCl 5。使用250 mL搖瓶，裝液量為30 mL。將上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽替換成不同的成分以進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。

1.1.3 試劑 發(fā)酵培養(yǎng)基各種成分：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；IPTG、卡那霉素：購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將甘油管保藏菌接入LB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按體積分?jǐn)?shù)5%轉(zhuǎn)接入發(fā)酵（基礎(chǔ)）培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時(shí)，加入0.2 mmol/L IPTG，于30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

1.2.2 細(xì)胞光密度分析 將菌懸液適當(dāng)稀釋，于分光光度計(jì)（600 nm）測(cè)定其吸光值。

OD600=讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.3 菌體生物量的測(cè)定 取相同體積不同濃度的菌體，測(cè)定其OD600后，于8 000 r/min下離心10 min，棄上清液后用去離子水懸浮菌體，再離心，棄上清液后，將菌體放置于70℃烘干至恒質(zhì)量。菌體質(zhì)量濃度（g/L）與OD600呈線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。

y=0.331x-0.088 7 （R2=0.999 6）

其中 x為 OD600，y為菌體質(zhì)量濃度（g/L）。

圖1 菌體質(zhì)量濃度與OD600的線性關(guān)系Fig.1 Relationship between the dry cell weight and the OD600

1.2.4 菌體破碎 誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，用 7 mL 磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 6.0）懸浮菌體，使用超聲波破碎儀對(duì)菌體破碎10 min，結(jié)束后于4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.5 酶活測(cè)定 使用酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）測(cè)定雙乙酰還原酶的活力，酶活測(cè)定體系如下（200 μL）：檸檬酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 5.0），NADH 1 mmol/L，雙乙酰5 mmol/L，適量上清粗酶液。通過(guò)測(cè)定340 nm處吸光值的下降來(lái)計(jì)算雙乙酰還原酶的活力。酶活定義如下：在上述條件下，每分鐘催化1 μmol NADH氧化所需要的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響 研究了4種較廉價(jià)的碳源：葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉（均5 g/L）對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。并且通過(guò)SDS-PAGE觀察不同碳源對(duì)雙乙酰還原酶可溶性表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

表1 不同碳源對(duì)重組大腸桿菌菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of different carbon sources on cell growth and diacetyl reductase production of recombinant E.coli

結(jié)果表明：以葡萄糖為碳源時(shí)菌體質(zhì)量濃度最高（1.41 g/L），單位菌體產(chǎn)酶量最低（12.37 kU/g），可見(jiàn)葡萄糖容易被菌體利用進(jìn)行生長(zhǎng)，但不利于產(chǎn)酶；而以蔗糖和可溶性淀粉為碳源時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量雖然較高，但是不利于菌體生長(zhǎng)（<1.0 g/L）；而以甘油為碳源時(shí)，菌體產(chǎn)量為1.35 g/L，且單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平均是最高的。同時(shí)SDS-PAGE顯示，4種碳源對(duì)重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)沒(méi)有影響。因此，最終選擇甘油為碳源。

圖2 不同碳源對(duì)重組雙乙酰還原酶可溶性表達(dá)的影響Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme expressed in different carbon sources

通過(guò)單因素優(yōu)化，確定了最佳的甘油添加質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3?？芍?，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平均已達(dá)到最高，繼續(xù)增加甘油對(duì)單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平無(wú)顯著影響，因此確定最適甘油質(zhì)量濃度為5 g/L。

圖3 不同質(zhì)量濃度的甘油對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effectofdifferentglycerolconcentration on diacetyl reductase production

2.1.2 氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響 無(wú)機(jī)氮源相比于有機(jī)氮源更易于被大腸桿菌所利用，促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。但是以無(wú)機(jī)氮源為惟一氮源時(shí)菌體的生長(zhǎng)緩慢[6-7]，因此在含有機(jī)氮源培養(yǎng)基（酵母浸膏5 g/L、魚粉蛋白胨5 g/L）的基礎(chǔ)上，研究無(wú)機(jī)氮源（NH4）2SO4和 NH4Cl（各 1.5 g/L）對(duì)菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的作用，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Table 2 Effect of inorganic nitrogen sources on cell growth and diacetyl reductase production

表2顯示，無(wú)機(jī)氮源添加后，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶均有提高，菌體產(chǎn)量由1.60 g/L提高至2.17、1.92 g/L，產(chǎn)酶水平由 25.51 kU/L提高至 33.29、31.84 kU/L，但單位菌體產(chǎn)酶量無(wú)明顯變化。由此可知，（NH4）2SO4和NH4Cl的添加可以明顯地促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，可以作為有機(jī)氮源的必要補(bǔ)充。與 NH4Cl相比，添加（NH4）2SO4后單位菌體產(chǎn)酶量略微提高，由于重組雙乙酰還原酶是胞內(nèi)酶，單位菌體產(chǎn)酶量的提高對(duì)于降低生物催化反應(yīng)的催化劑用量非常重要，因此最終選擇（NH4）2SO4為無(wú)機(jī)氮源。進(jìn)一步研究3種有機(jī)氮源牛肉膏、酵母浸膏、魚粉蛋白胨及其組合的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同有機(jī)氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Table 3 Effect of organic nitrogen sources on cell growth and diacetyl reductase production

由表3可知，添加單一有機(jī)氮源牛肉膏和魚粉蛋白胨及這兩種氮源組合均不利于菌體生長(zhǎng)，菌體質(zhì)量濃度均小于1.0 g/L，而酵母浸膏可明顯促進(jìn)大腸桿菌菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)雙乙酰還原酶，在僅添加酵母浸膏時(shí)，菌體質(zhì)量濃度和單位菌體產(chǎn)酶量分別為1.40 g/L和24.84 kU/g。進(jìn)一步將酵母浸膏分別與牛肉膏和魚粉蛋白胨進(jìn)行組合，在酵母浸膏與魚粉蛋白胨各為5 g/L時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量最高（26.32 kU/g），考慮到雙乙酰還原酶是胞內(nèi)酶，選擇酵母浸膏與魚粉蛋白胨的組合單位菌體產(chǎn)酶量更高，且工業(yè)級(jí)魚粉蛋白胨的價(jià)格低于牛肉膏，因此最終確定有機(jī)氮源為酵母浸膏和魚粉蛋白胨。另外，通過(guò)SDSPAGE觀察重組蛋白在不同有機(jī)氮源中的可溶性表達(dá)情況，見(jiàn)圖4。

圖4 不同有機(jī)氮源對(duì)重組蛋白可溶性表達(dá)的影響Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme expressed in different nitrogen sources

圖4顯示，不同有機(jī)氮源對(duì)重組蛋白的可溶性表達(dá)沒(méi)有影響，因此最終確定酵母浸膏與魚粉蛋白胨的組合作為發(fā)酵培養(yǎng)基的有機(jī)氮源。參照LB培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的總質(zhì)量濃度為15g/L（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L），在控制總氮源質(zhì)量濃度為15 g/L下，進(jìn)一步研究酵母浸膏與魚粉蛋白胨的不同比例對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5?？芍?，當(dāng)酵母浸膏與魚粉蛋白胨的比例為2∶1時(shí)，單位菌體產(chǎn)酶量及產(chǎn)酶水平均為最高，因此確定酵母浸膏10 g/L、魚粉蛋白胨5 g/L作為最佳有機(jī)氮源添加量。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響 在確定碳源及氮源的種類和添加量后，使用正交方法對(duì)無(wú)機(jī)鹽種類及質(zhì)量濃度進(jìn)行了優(yōu)化。無(wú)機(jī)鹽對(duì)微生物有非常重要的生理功能，例如：滲透壓的維持、酶的激活劑、pH的穩(wěn)定、細(xì)胞組成成分等。研究了4種重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶中較常用的無(wú)機(jī)鹽（檸檬酸鈉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl）對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)雙乙酰還原酶的影響，以產(chǎn)酶水平為考察指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。

圖5 酵母浸膏與魚粉蛋白胨比例對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of ratio between yeast extract and peptone on diacetyl reductase production

表4 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of orthogonal experiment for optimization of inorganic salts

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，檸檬酸鈉對(duì)產(chǎn)酶的影響最顯著（R 值為 15.00），其次為 NaCl（R 值為 3.42），MgSO4·7H2O和KH2PO4對(duì)產(chǎn)酶的影響最小。檸檬酸是TCA循環(huán)的關(guān)鍵物質(zhì)，因此推測(cè)檸檬酸鈉的添加可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量，也可促進(jìn)細(xì)胞的產(chǎn)酶[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，細(xì)胞干重隨檸檬酸鈉濃度的增大而增大，產(chǎn)酶水平及單位菌體產(chǎn)酶量也逐漸提高。其中最優(yōu)組合為 A3B1C1D1，即檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L。

2.1.4 不同培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶比較 經(jīng)過(guò)優(yōu)化，確定了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：甘油5 g/L，酵母浸膏 10 g/L，魚粉蛋白胨 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L。進(jìn)一步比較了重組菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶比較Table 5 Comparison ofcellgrowth and enzyme production in different medium

表5顯示，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基相比，發(fā)酵相同時(shí)間優(yōu)化培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶均得到了提高，菌體干重2.43 g/L，單位菌體產(chǎn)酶量達(dá)13.84 kU/g，產(chǎn)酶水平達(dá)33.65 kU/L。雖然單位菌體產(chǎn)酶量的數(shù)值低于氮源優(yōu)化的結(jié)果，但是產(chǎn)酶水平相當(dāng)，主要是由于批次間的操作差異所致。采用該優(yōu)化的國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基后，單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平分別為L(zhǎng)B進(jìn)口培養(yǎng)基的1.16和1.71倍，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的2.04和4.23倍。

2.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 在25、30、37℃三個(gè)誘導(dǎo)溫度下對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)雙乙酰還原酶的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖6。37℃下單位菌體產(chǎn)酶量與產(chǎn)酶水平均最高。通過(guò)SDS-PAGE觀察三個(gè)溫度下重組蛋白的可溶性表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖7。蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)都較好。由于37℃下發(fā)酵時(shí)間短，產(chǎn)酶量高，因此最終選定37℃為最適誘導(dǎo)溫度。

圖6 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化Fig.6 Optimization of inducing temperature

2.2.2 誘導(dǎo)劑IPTG濃度的優(yōu)化 對(duì)4種IPTG濃度 0.1、0.3、0.5、1.0 mmol/L 進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖8。

結(jié)果顯示，高濃度的IPTG對(duì)菌體產(chǎn)雙乙酰還原酶不利，當(dāng)濃度為0.1 mmol/L時(shí)，產(chǎn)酶水平最高（40.29 kU/L），但隨著IPTG濃度的逐漸增加，菌體生長(zhǎng)受到抑制且產(chǎn)酶水平有所降低?？紤]到發(fā)酵成本的經(jīng)濟(jì)性，最終確定最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.1 mmol/L。

圖7 不同誘導(dǎo)溫度下蛋白質(zhì)表達(dá)情況Fig.7 SDS-PAGEanalysisofrecombinantenzyme expressed under different inducing temperatures

圖8 IPTG濃度的優(yōu)化Fig.8 Optimization of IPTG concentration

2.3 重組大腸桿菌在3 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)束后，在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行重組大腸桿菌產(chǎn)雙乙酰還原酶的驗(yàn)證。發(fā)酵罐的裝液量為1 L，將過(guò)夜培養(yǎng)的種子液（OD600=2.16）按體積分?jǐn)?shù)5%接種至發(fā)酵罐，37℃下培養(yǎng)。當(dāng)菌體生長(zhǎng)到OD600=3.09（約3 h）時(shí)，加入IPTG（終濃度0.1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，控制溶氧水平在10%～30%之間，pH在7.0左右。在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)流加碳源及氮源來(lái)保證菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶所需的營(yíng)養(yǎng)，補(bǔ)加碳源體積分?jǐn)?shù)50%、甘油約20 mL，且加IPTG誘導(dǎo)后即停止。以恒定的速度補(bǔ)加氮源（酵母浸膏30 g/L、魚粉蛋白胨15 g/L、（NH4）2SO44.5g/L），直至發(fā)酵結(jié)束。定時(shí)取樣測(cè)定OD600及酶產(chǎn)量（kU/L），結(jié)果見(jiàn)圖 9。

圖9 發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線Fig.9 Cell growth and diacetyl reductase production in the fermenter

圖9顯示，培養(yǎng)8 h時(shí)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)酶活最高，單位菌體產(chǎn)酶量達(dá)14.09 kU/g，產(chǎn)酶水平達(dá)64.62 kU/L，均高于搖瓶水平。繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶水平不再繼續(xù)提高。目前，尚無(wú)關(guān)于重組大腸桿菌產(chǎn)雙乙酰還原酶的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的報(bào)道。作者采用國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基替換進(jìn)口培養(yǎng)基后，仍然可達(dá)到比進(jìn)口培養(yǎng)基更高的酶產(chǎn)量，降低了重組雙乙酰還原酶的制備成本。

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基各組分后，確定重組大腸桿菌產(chǎn)雙乙酰還原酶的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：甘油5 g/L，酵母浸膏 10 g/L，魚粉蛋白胨 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L；最適誘導(dǎo)溫度為 37℃，IPTG 濃度為0.1 mmol/L。在此條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，單位菌體產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶水平分別為L(zhǎng)B進(jìn)口培養(yǎng)基的1.16和1.71倍，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的2.04和4.23倍。并在3 L發(fā)酵罐對(duì)最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究為制備可用于不對(duì)稱還原法合成光學(xué)純2，3-丁二醇的雙乙酰還原酶奠定了基礎(chǔ)。

[1]FLORA T，PENKA P，KALOYAN P.2，3-Butanediol production from starch by engineered Klebsiella pneumonia G31-A[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98：2441-2451.

[2]SHEN Mengqiu，JI Xiaojun，NIE Zhikui，et al.Biotechnology production of 2，3-butanediol stereoisomers：synthetic mechanism and realized methods[J].Chinese Journal of Catalysis，2013，34：351-360.（in Chinese）

[3]JI X J，HUANG H，OUYANG P K.Microbial 2，3-butanediol production：a state-of-the-art review[J].Biotechnology Advances，2011，29：351-364.

[4]LI L X，WANG Y，ZHANG L J，et al.Biocatalytic production of （2S，3S）-2，3-butanediol from diacetyl using whole cells of engineered Escherichia coli[J].Bioresource Technology，2012，115：111-116.

[5]WANG Z，SONG Q Q，YU M L，et al.Characterization of a stereospecific acetoin （diacetyl） reductase from Rhodococcus erythropolis WZ010 and itsapplication forthe synthesis of（2S，3S）-2，3-butanediol[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98：641-650.

[6]CHENG Zhijing，DENG Xu，LU Yinghua，et al.Optimization of recombinant Escherichia coli fermentation medium affecting β1-3，1-4-glucanase production[J].Industrial Microbiology，2006，36：26-30.（in Chinese）

[7]YANG Hailin，WANG Changcheng，ZHANG Ling，et al.Optimization of culture conditions for production of cholesterol oxidase using recombinant E.coli[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28：670-674.（in Chinese）

[8]WANG Q F，HOU Y H，XU Z，et al.Optimization of cold-active protease production by the psychrophilic bacterium Colwellia sp.NJ341 with response surface methodology[J].Bioresource Technology，2008，99：1926-1931.

Optimization of Fermentation Conditions for Production of Diacetyl Reductase Using Recombinant Escherichia coli

BIAN Yaqian， XU Guochao， NI Ye*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Optically pure 2，3-butanediol is one of the important building blocks.Bioreduction of diacetyl using diacetyl reductase is an environmentally friendly method for chiral 2，3-butanediol production.The medium components and induction conditions of diacetyl reductase produced by recombinant Escherichia coli were optimized in flasks.The optimal medium composition for the production of diacetyl reductase was listed as follows：glycerol 5 g/L，yeast extract 10 g/L，peptone 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，sodium citrate 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L and NaCl 2 g/L.The optimal induction conditions were listed as follows：37 ℃ and 0.1 mmol/L IPTG.After induced for 6 h under the optimized conditions，the enzyme activities reached to 13.84 kU/g dry cell weight and 33.65 kU/L，which were 2.04 and 4.23 folds of those in basic medium，1.16 and 1.71 folds ofthose in LB medium.In a 3 L fermenter，under the optimized conditions，the maximum enzyme activities achieved at 14.09 kU/g and 64.62 kU/L after cultured for 8 h，which were both higher than those in flasks.This study provides useful guidance on the highly efficient preparation of diacetyl reductase by recombinant Escherichia coli for the preparation of chiral 2，3-butanediol.

recombinantEscherichia coli，diacetylreductase，medium optimization，induction condition

Q 93

A

1673—1689（2017）09—0944—07

2015-03-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21276112）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2011CB710800）。

*通信作者：倪 曄（1975—），女，江蘇無(wú)錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物催化和酶工程方面研究。

E-mail：yni@jiangnan.edu.cn

邊雅倩，許國(guó)超，倪曄.重組大腸桿菌產(chǎn)雙乙酰還原酶的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（09）：944-950.