楊 潔， 馬英慧， 董微麗， 崔秀成， 石 晶， 賈淑君

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科, 河北 承德 067000)

基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性研究

楊 潔， 馬英慧， 董微麗， 崔秀成， 石 晶， 賈淑君

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科, 河北 承德067000)

目的研究基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9) -1562C/T基因多態(tài)性與中國(guó)北方漢族人群2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系。方法采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)方法檢測(cè)了180名健康對(duì)照者和400例2型糖尿病患者(其中單純2型糖尿病患者180例、糖尿病視網(wǎng)膜病變患者220例)的MMP-9基因型,比較各組之間基因型及等位基因頻率的差別。結(jié)果MMP-9-1562C/T正常對(duì)照組,糖尿病組,糖尿病視網(wǎng)膜病變組三組C、T等位基因頻率分別為8.3%，91.7%；7.8%，92.2%；91.4%，8.6%，三組等位基因頻率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=790.09，P=0.000)。三組C/C，C/T，T/T基因型頻率分別為0%，16.7%，83.3%；2.2%，11.1%，86.7%；84.1%，14.5%，1.4%，三組基因型頻率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=470.16，P=0.000)，其中正常對(duì)照組與糖尿病視網(wǎng)膜病變組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；正常對(duì)照組與糖尿病組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)；糖尿病組與糖尿病視網(wǎng)膜病變組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與T等位基因型相比，C等位基因可能會(huì)增加2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性可能與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生有關(guān),T等位基因可能是2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)基因。

糖尿病視網(wǎng)膜病變； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9； 基 因； 單核苷酸多態(tài)性

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者中常見(jiàn)的并發(fā)癥，是導(dǎo)致2型糖尿病患者視力喪失的最主要的原因，嚴(yán)重影響了糖尿病患者的生存質(zhì)量，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變與多種危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，如年齡、高血壓、性別等[2]，但不同地區(qū)、不同種族患病率存在差異[3]。提示基因在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs) 的一員, 主要參與血管基底膜主要結(jié)構(gòu)成分，IV型膠原的降解,與糖尿病血管病變密切相關(guān)[4]。MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)-1562C/T,已經(jīng)被證實(shí)是一種能影響其功能的突變[5]。本研究旨在探討MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1一般資料:本研究采用病例對(duì)照的研究方法。所有受試對(duì)象均為中國(guó)北方漢族人。病例來(lái)源：2014年5月至2015年8月我院內(nèi)分泌科收治的2型糖尿病患者400例，均經(jīng)1999年WHO 關(guān)于糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]確診，其中單純2型糖尿病患者(DM組)180例，男91例，女89例；2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者(DR組)220例，男112例，女108例，所有2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者經(jīng)過(guò)檢查均不合并其他糖尿病并發(fā)癥。正常對(duì)照組為性別、年齡、地區(qū)與病例組相匹配的180名健康者，男92例，女88例，來(lái)自我院體檢中心。所有受檢者均接受詳細(xì)的眼科檢查，包括：最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、眼底照相等檢查。眼底照相可疑DR的受試者行眼底血管造影檢查以確診DR。DR的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均告知研究目的并簽署知情同意書。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1記錄所有受檢人員的姓名、性別、年齡以及身高、體重、糖尿病病程、空腹血糖、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓等指標(biāo)。

1.2.2受檢者DNA的提取：抽取所有受檢人員肘靜脈血4mL，加EDTA抗凝，于-80℃保存，通過(guò)蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取基因組DNA[8]。

1.2.3MMP-9基因-1562C/T多態(tài)性檢測(cè)：應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)。引物序列參考文獻(xiàn)[2]設(shè)計(jì),由上海生化生物工程公司合成,上游引物:5’-GCCTGGCACATAGATGGCCC-3’,下游引物:5’-CTTCCTAGCCAGCC-GGCATA-3’。PCR反應(yīng)體系為20μL，包括滅菌去離子水10.4μL，DNA模板2.0μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，10×PCR緩沖液2.4μL，PCR染料2.4μL，三磷酸脫氧核糖核酸(dNTPs)0.4μL和上下游引物各1.0μL。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5min；以后按95℃變性20s，50℃退火30s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)后，最后一步為72℃繼續(xù)延伸7min。10μL酶切反應(yīng)體系中加入8μL PCR產(chǎn)物后再加入10IU的限制性內(nèi)切酶，置于37℃水浴過(guò)夜消化。消化后的產(chǎn)物置于經(jīng)溴化乙錠染色的4%瓊脂糖凝膠中電泳。

2 結(jié) 果

2.1三組研究對(duì)象基本資料分析：正常對(duì)照組、DM組、DR組三組之在年齡、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓等指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。但空腹血糖三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),病程DM組和DR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 三組間臨床資料對(duì)比

2.2MMP-9基因Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)三組中CC、CT、TT 基因型分布觀測(cè)值與期望值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg定律，說(shuō)明能夠達(dá)到遺傳平衡，具有很好的群體代表性(見(jiàn)表2)。

表2 MMP-9基因型頻率的Hardy-Weinberg 遺傳平衡性檢驗(yàn)

2．3MMP-9 C-1562T基因多態(tài)性和糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系：( 見(jiàn)表3)。正常對(duì)照組, 糖尿病組, 糖尿病視網(wǎng)膜病變組三組C、T等位基因頻率分別為8.3%，91.7%；7.8%，92.2%；91.4%，8.6%。三組C和T等位基因頻率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=790.09，P=0.000)。三組C/C，C/T，T/T 基因型頻率分別為0%，16.7%，83.3%；2.2%，11.1%，86.7%；84.1%，14.5%，1.4%。三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=470.16，P=0.000)?？ǚ椒指钸M(jìn)行兩兩比較，認(rèn)為P<0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三組兩兩之間比較結(jié)果：正常對(duì)照組與糖尿病組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.12，P=0.047>0.01)；糖尿病組與糖尿病視網(wǎng)膜病變組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=322.56，P=0.000<0.01)；正常對(duì)照組與糖尿病視網(wǎng)膜病變組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=325.55，P=0.000<0.01)。與C/T+T/T基因型比較，C/C基因型有可能增加2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

2.4糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)危險(xiǎn)因素分析：以有無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)橐蜃兞?有糖尿病視網(wǎng)膜病變=1，無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病變=0)，自變量為：病程、空腹血糖及MMP-9-1562C/T分別進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示病程、空腹血糖及MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)-1562C/C基因型是DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素(見(jiàn)表4)。

3 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是2型糖尿病最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，對(duì)糖尿病患者的生活質(zhì)量造成了極為嚴(yán)重的影響。隨著全球糖尿病發(fā)病率的不斷升高，2013年全球糖尿病患者已高達(dá)3.82 億，估計(jì)到2035年將會(huì)高達(dá)5.92億[9]；而在國(guó)內(nèi)，2013年最數(shù)據(jù)顯示我國(guó)糖尿病發(fā)病率為11.6%，18 歲以上糖尿病患者約有1.14億[10]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)DR的發(fā)生與發(fā)展不僅與糖尿病的病程、血糖控制情況有關(guān)，還受一定的遺傳因素[11]影響。目前認(rèn)為DR的發(fā)病受多種基因的影響，其中每個(gè)基因都存在多態(tài)性現(xiàn)象。研究表明[12]多種基因多態(tài)性與DR有關(guān)，如一氧化氮合酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、糖基化終末產(chǎn)物受體、醛糖還原酶等基因多態(tài)性都與DR發(fā)生有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶 9(MMP-9)又稱IV型膠原酶, 在生理和病理?xiàng)l件下, MMP-9 可以降解許多細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分, 對(duì)細(xì)胞遷移, 組織重建, 血管新生起重要作用[13]。近年研究指出, MMP-9 在糖尿病視網(wǎng)膜病進(jìn)展中, 參與組織的破壞, 是其進(jìn)展的值得引起注意的危險(xiǎn)因子[14]。這種MMP-9基因多態(tài)性參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。人類的MMP-9基因位于20號(hào)染色體長(zhǎng)臂的11 區(qū)1帶～13區(qū)1帶之間(20q11.1～13.1)。MMP-9的表達(dá)主要是轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)節(jié)，MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)含有許多順式作用元件，這些順式作用元件在其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面起非常重要的作用，其中就包括MMP-9基因啟動(dòng)子-1562區(qū)域C/T基因多態(tài)位點(diǎn)，它是一個(gè)很重要的調(diào)節(jié)元件，可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，影響MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄水平[15]。當(dāng)MMP-9基因-1562位點(diǎn)C突變成基因T以后，DNA-蛋白質(zhì)的相互作用被消除，由此產(chǎn)生高的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性[16],導(dǎo)致MMP-9的表達(dá)增加，從而加速了Ⅳ型膠原的降解，減少了視網(wǎng)膜細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，阻止或延緩DR的發(fā)生與發(fā)展。相反，當(dāng)T等位基因的頻率減少時(shí)會(huì)加速DR的發(fā)生和進(jìn)展。

本研究結(jié)果表明DR組的TT基因型頻率和T等位基因低于正常對(duì)照組和DM組，T等位基因攜帶者DR的發(fā)病率明顯降低，提示T等位基因可能是DR的保護(hù)性基因,這可能是由于攜帶T等位基因的MMP-9啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，導(dǎo)致MMP-9在組織中的表達(dá)增加[16],從而促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的降解,抑制了DR的發(fā)生和發(fā)展。由此可見(jiàn)MMP-9-1562C/T多態(tài)性與DR的發(fā)生相關(guān)，突變型T等位基因可能是DR的保護(hù)基因。

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AStudyoftheAssociationbetweenPolymorphismsoftheMMP-9Geneandtype2DiabeticRetinopathy

YANGJie,MAYinghui,DONGWeili,etal

(TheAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,HebeiChengde067000,China)

Objective:To study of the association between polymorphism of the MMP-9 gene(-1562C/T)and type 2 diabetic retinopathy.MethodsMMP-9 -1562C/T SNP was genotyped by polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism (PCR-RFLP) ,analysis in 180 healthy persons as control and 400 patients with type 2 diabetes including 180 complication-free cases and 220 with diabetic retinopathy (DR).ResultsAssociation between the MMP-9 -1562C/T SNP in promoter region and diabetic retinopathy: the C and T allele frequencies in Control, DM, DR groups are 8.3%，91.7%; 7.8%, 92.2%; 91.4%, 8.6% respectively. And the results have a significant deviation (χ2=790.09，P=0.000). The C/C, C/T , T/T genotypic frequencies of cases in the three groups are 0%，16.7%，83.3%；2.2%，11.1%，86.7%；84.1%，14.5%，1.4%.There's a significant deviation of C and T allele frequency of MMP-9 -1562C/T between the Control group、the DM group and DR group(χ2=470.16，P=0.000).There's a significant deviation of C/C,C/T,T/T genotypic frequencies between the Control group and DM group(P<0.01),or the DM group and DR group(P<0.01),while there is no significant deviation between the Control group and DM group(P>0.01) .Compared with the T allele, the C allele may increase the onset risk of diabetic retinopathy.ConclusionThe MMP-9 -1562C/T SNP may play a role in the genetic susceptibility to the invasion of diabetic retinopathy. T allele is a protective gene for diabetic retinopathy.

Diabetic retinopathy； Matrix metalloproteinase-9； Gene； Single nucleotide polymorphism

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.10.023

1006-6233(2017)10-1663-05

馬英慧