張文超，張靜超，趙坤

1 教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300350

2 天津大學化工學院，天津 300350

3 天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300350

細菌顯微追蹤技術(shù)在生物被膜中的應(yīng)用

張文超1,2*，張靜超1,2*，趙坤1,2,3

1 教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300350

2 天津大學化工學院，天津 300350

3 天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300350

細菌生物被膜是粘附于物體表面的由細菌細胞及其胞外物質(zhì)組成的復(fù)雜膜樣物聚集體，具有很強的耐藥性和免疫逃逸能力。生物被膜內(nèi)細菌的代謝活性、運動狀態(tài)等與浮游細菌有明顯區(qū)別。近年來，先進的顯微成像技術(shù)結(jié)合新型圖像處理方法，在研究細菌的運動、生理等方面發(fā)揮了重要作用。本文圍繞生物被膜，概述了細菌顯微追蹤技術(shù)在其研究中的應(yīng)用。主要從細菌的運動方式和生物被膜形成過程的調(diào)控兩方面出發(fā)，介紹了在單細胞水平上利用該技術(shù)研究生物被膜的進展，包括細菌的游泳、蹭行、群集運動和多種信號通路調(diào)控下生物被膜的形成過程等，并展望了該技術(shù)在生物被膜其他相關(guān)研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

細菌顯微追蹤，生物被膜，運動方式，單細胞水平，群體行為

生物被膜(Biofilm)是指細菌粘附于接觸表面，通過其分泌的多糖、蛋白和胞外DNA等胞外物質(zhì)，將細菌自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物[1-4]。其形成過程是一個非平衡、非線性的復(fù)雜的細菌自組裝過程。細菌可以形成多種形式的生物被膜，既能夠附著在固體表面形成固體生物被膜，也能聚集在氣液界面形成液體生物被膜(Pellicle)。細菌生物被膜是引起細菌持續(xù)性感染的常見致病機制，大約60%的臨床感染病例都與細菌生物被膜的形成有關(guān)[1]，比如變形鏈球菌Streptococcus mutans在口腔形成生物被膜導(dǎo)致齲齒，粘液型銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa形成生物被膜會引起慢性肺感染[5]。與自由浮游細菌相比，生物被膜內(nèi)的細菌提高了其抗藥性和免疫逃逸能力，在食品、醫(yī)療、工業(yè)、軍事等諸多領(lǐng)域給人類社會帶來嚴重危害[6]，因此理解并設(shè)法控制生物被膜是對抗細菌感染的一條重要途徑。

早在1676年，列文虎克就用自制的顯微鏡觀察到了牙菌斑中大量微生物的存在，這被認為是關(guān)于生物被膜的首次發(fā)現(xiàn)[7]。然而，在隨后的300多年時間里，只有零星的關(guān)于生物被膜的文獻報道[1,8-11]。究其原因，主要是因為兩方面的限制：首先受限于對于生物被膜的認知不夠充分。在微生物學的發(fā)展歷史上，絕大部分研究都集中在對自由運動的浮游細菌的表征上，人們當時還沒有認識到生物被膜才是細菌在自然界中的普遍存在方式；其次是受限于當時的技術(shù)水平，還不能對生物被膜在更細致的微觀水平上(比如生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)、生物被膜中細菌細胞的表征等)進行研究。直到20世紀80年代，科學家們發(fā)現(xiàn)自然界的細菌99%以上都是以生物被膜的方式存在[12]，而且生物被膜對于人類的生活、健康和經(jīng)濟活動有著重要的影響[1,5-6,13]，從此生物被膜的重要性才逐漸被人們所了解。同時，先進的顯微成像技術(shù)、基因操控技術(shù)以及熒光染色技術(shù)等的發(fā)展，也極大地推動了生物被膜在微觀水平上的研究，并吸引了不同學科背景的科研人員加入到該領(lǐng)域中，促使生物被膜逐漸發(fā)展為一個涉及微生物學、免疫學、化學、物理學、數(shù)學等多學科交叉的前沿熱點研究領(lǐng)域，其結(jié)果之一就是跟生物被膜相關(guān)的文獻數(shù)量自20世紀90年代后期開始呈現(xiàn)井噴式增長(圖1)。

Costerton等于1978年提出了生物被膜的最初理論模型，用于解釋細菌粘附的機制[1,8]。經(jīng)過幾十年的研究，人們對于生物被膜的理解已經(jīng)獲得了長足的進步。生物被膜的發(fā)展過程一般可分為5個階段：可逆吸附階段，不可逆吸附階段，微菌落階段，成熟階段和從生物被膜解離階段[14-16]。許多影響生物被膜的因素也逐漸被揭示，比如鞭毛、菌毛等細菌附屬物對細菌的附著有非常大的影響[17-18]；細菌分泌的多種多糖是構(gòu)成生物被膜骨架的主要成分，與生物被膜的力學特性緊密相關(guān)[19-21]；細菌在生物被膜的形成過程中利用小分子信號進行交流，也就是所謂的群體感應(yīng)(Quorum sensing)，來調(diào)控生物被膜的結(jié)構(gòu)發(fā)展[22-23]。這些研究的實現(xiàn)在很大程度上得益于新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。傳統(tǒng)的方法像染色法、試管法等可以對生物被膜進行宏觀觀察，但無法做到單細胞水平上的觀察。電子顯微鏡可以直接觀測細菌細胞的表面形態(tài)，但制樣過程對樣品損傷較大，且無法實時原位觀察活細胞的狀態(tài)和生物被膜的發(fā)展過程。進入20世紀80、90年代后，隨著光學和電子技術(shù)的發(fā)展，新工具和新技術(shù)不斷涌現(xiàn)和完善，比如先進的顯微鏡成像技術(shù)(如共聚焦顯微鏡[24]、超分辨成像技術(shù)[25-27]和細菌顯微追蹤技術(shù)[28-32])、微流控技術(shù)[33-36]、三維成像技術(shù)[37]和高精度的熒光染色技術(shù)等，這使得人們能夠從基因調(diào)控、代謝水平、運動機制等多角度，在單細胞水平上對生物被膜進行原位實時觀察，極大地推動了生物被膜的研究[38-40]。本文著重介紹近幾年發(fā)展的細菌顯微追蹤技術(shù)在生物被膜研究中的應(yīng)用，從細胞的運動方式以及生物被膜的形成過程兩個方面，綜述了利用該技術(shù)進行的生物被膜研究的進展，以期在單細胞水平上闡釋生物被膜的結(jié)構(gòu)特征、形成機制和調(diào)控機理，并探討了該技術(shù)的發(fā)展前景及在相關(guān)微生物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。

圖1 1975–2016年P(guān)ubMed收錄的關(guān)于生物被膜的論文數(shù)量分布(搜索關(guān)鍵詞：biofilm)Fig.1 Number of yearly published papers on biofilms indexed in PubMed from1975 to2016(Searching keyword: biofilm).

1 細菌顯微追蹤技術(shù)

1.1 發(fā)展歷史

細菌顯微追蹤技術(shù)是在顯微鏡和相機等光學系統(tǒng)或電子光學系統(tǒng)設(shè)備的基礎(chǔ)上發(fā)展起來，針對肉眼所不能分辨的微生物進行研究分析的技術(shù)。主要步驟包括：首先對通過顯微鏡延時拍攝采集的圖像數(shù)據(jù)進行微生物圖像識別，提取微生物的幾何及相關(guān)信息，例如微生物的位置、大小、取向以及可能的熒光標識信號等信息；再利用追蹤技術(shù)將不同時間點得到的微生物信息串聯(lián)，構(gòu)建微生物信息數(shù)據(jù)庫，從而得到微生物的時間演變?nèi)^程；最后，在前面得到的數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，經(jīng)過數(shù)據(jù)篩選和減噪等處理，利用現(xiàn)代數(shù)據(jù)分析技術(shù)，可以實現(xiàn)對微生物特定行為的研究(圖2)。

在細菌顯微追蹤技術(shù)發(fā)展之前，粒子顯微追蹤技術(shù)在膠體科學領(lǐng)域的研究已相對成熟。在膠體科學領(lǐng)域，通過光學顯微鏡對膠體顆粒的動力學進行實時觀察分析，是研究膠體動力學的一種簡潔高效的標準方法。早期開發(fā)的膠體顯微追蹤技術(shù)[41-43]都是圍繞球形膠體系統(tǒng)進行的，后來隨著非球形膠體系統(tǒng)的應(yīng)用，新的非球形膠體的顯微追蹤技術(shù)也被開發(fā)出來[44-46]。而細菌顯微追蹤技術(shù)正是在借鑒了膠體粒子顯微追蹤技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。從某一角度講，細菌系統(tǒng)可以看做是膠體系統(tǒng)的一個特例，二者在很多方面具有高度相似性：比如細菌細胞的尺度在微米級，屬于膠體的尺度范圍；細菌細胞和膠體顆粒均會在溶液中做布朗運動(只不過在絕大多數(shù)情況下細菌的主動運動行為占主導(dǎo))；膠體顆粒的形狀可以是球形、桿形和星形等，種類非常豐富；而細菌的形狀也可以是球形、桿形和其他不規(guī)則形狀。基于此，人們在膠體系統(tǒng)中開發(fā)的新技術(shù)和分析方法，完全可以嘗試應(yīng)用在微生物系統(tǒng)的研究上，其中細菌顯微追蹤技術(shù)就是膠體科學技術(shù)在微生物領(lǐng)域應(yīng)用的一個成功案例。這也為生物被膜的微觀研究提供了新的研究思路和研究手段。

國內(nèi)外學者也積極開展了利用細菌顯微追蹤技術(shù)研究細菌群體行為的工作。哈佛大學的Howard C.Berg教授課題組和David Weitz教授課題組，普林斯頓大學的Howard A.Stone教授課題組和Joshua W.Shaevitz教授課題組，加州大學洛杉磯分校的Gerard C.L.Wong教授課題組，天津大學趙坤教授課題組，中國科學技術(shù)大學的金帆教授課題組以及澳大利亞悉尼科技大學的Cynthia Winchurch教授課題組等都發(fā)展了針對不同研究對象的細菌顯微追蹤技術(shù)，并結(jié)合先進的基因操控技術(shù)在單細胞水平上對細菌的群體行為比如生物被膜、細菌群集和子實體的形成等開展了研究，加深了人們對生物被膜和其他群體行為的理解[28,30-32,47-50]。

圖2 利用細菌顯微追蹤技術(shù)研究細菌行為的流程示意圖(改自文獻[47])Fig.2 Schematic diagram showing how to study bacterial behavior by tracking techniques(modified from reference [47]).

1.2 系統(tǒng)配備及要求

利用細菌顯微追蹤技術(shù)進行細菌行為研究的平臺包括硬件和軟件兩部分。

硬件方面主要是光學顯微鏡和相機，具體的硬件性能參數(shù)看需求而定。以研究生物被膜為例，光學顯微鏡需要具備焦點漂移自動補償和全自動功能。因為生物被膜的數(shù)據(jù)采集周期相對較長，可以從幾小時到幾天不等，因而利用全自動功能自動采集、存儲數(shù)據(jù)，并利用焦點漂移自動補償保持長時間的焦平面穩(wěn)定非常必要，而且相機需要有較高的分辨率和拍攝速率。如果使用熒光，相機應(yīng)有較高的量子效率，可以探測弱熒光信號。有條件的實驗室可以考慮配備共聚焦顯微鏡進行高分辨率成像的數(shù)據(jù)采集。而對于以細菌的運動方式特別是游泳運動為對象開展的研究工作，則要求相機具有較高的時間分辨率。一般的60幀/s的分辨率難以滿足要求，有條件的話建議配備高速相機進行數(shù)據(jù)采集?？傊@微鏡和相機的性能越好，拍攝的圖像質(zhì)量越高，采集到的信息就越豐富，后續(xù)的圖像處理相對就更容易。

硬件方面還包括對應(yīng)于不同研究對象而設(shè)計的特定容器。以研究生物被膜為例，常用的一個觀察生物被膜演變的容器為流體室(Flow cell)。其通常設(shè)計為一個長40mm寬4mm深1mm的長方體凹槽，其頂部由尺寸合適的蓋玻片通過硅膠密封，凹槽兩端各有一個通孔通過橡皮管分別與注射器和廢液收集器相連。培養(yǎng)液通過注射泵從流體室一端流入，在另一端流出進入廢液收集器，以保證實驗期間流體室內(nèi)的養(yǎng)分充足。觀察時，將流體室倒置，觀察細菌在玻璃表面上形成生物被膜的過程[51]。另外也可以制備微流控器件，利用微流控來進行細菌的行為研究。

軟件方面主要是可以對采集的圖像數(shù)據(jù)進行圖像識別和統(tǒng)計分析的軟件。其中，圖像處理和統(tǒng)計分析中所用算法的有效性和快速性直接決定著軟件的性能。鑒于細菌的多樣性和研究問題的特異性，目前還沒有一款軟件(不論是商用軟件還是用戶自己開發(fā)的軟件)可以做到通用。大部分商用軟件，比如MetaMorph和其他的顯微鏡圖像處理軟件以及免費軟件Image J等，都具備初級的圖像識別和統(tǒng)計分析的功能，能夠進行簡單的細菌形貌和運動快慢的測量。另外，也有用Matlab或IDL等計算機語言編寫的圖像處理程序包來滿足基本的比如觀測物體形狀和大小的需求。進一步的深入研究則需用戶自己開發(fā)有針對性的程序包。

2 細菌顯微追蹤技術(shù)在生物被膜研究中的應(yīng)用

細菌顯微追蹤技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一項新技術(shù)，現(xiàn)已逐漸應(yīng)用到微生物學、細胞生物學和生理病理學等學科的研究工作中，成為現(xiàn)代生物學微觀研究的重要工具。它可以實時記錄細菌的形態(tài)、運動狀態(tài)、生理反應(yīng)等信息，且對樣品無損傷，獲得的圖像清晰度高，便于得到更為準確的微觀定量信息。傳統(tǒng)的生物被膜觀測方法得到的是對被膜中群體細胞平均后的信息，而細菌顯微追蹤技術(shù)可同時追蹤大量單個細菌細胞的行為演變，從而可以在單細胞水平上研究細菌的運動方式和生物被膜的形成過程，因此受到研究人員的青睞，并使生物被膜的研究有所突破。

2.1 利用顯微追蹤技術(shù)研究單細胞水平上細菌的運動方式

隨著現(xiàn)代熒光標記和顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，研究者們逐漸將顯微追蹤技術(shù)應(yīng)用到探索細菌的代謝、表型和運動等方面，通過了解單細胞的運動行為來研究多細胞組織的異質(zhì)性以及生物被膜的形成[52]。細菌的運動行為與其運動器官如鞭毛、菌毛以及分泌物有直接的關(guān)系，其運動按照介導(dǎo)方式大致可分為由鞭毛介導(dǎo)的游泳運動(Swimming)、由菌毛介導(dǎo)的蹭行(Twitching)以及鞭毛和菌毛共同介導(dǎo)的群集運動(Swarming)等。其中游泳和蹭行主要是細菌的個體行為，而群集是細菌的群體行為，屬于典型的協(xié)同運動。

2.1.1 細菌游泳(Swimming)

細菌游泳指細菌通過鞭毛的旋轉(zhuǎn)在溶液中運動的現(xiàn)象，高速游動的細菌速率可達幾十微米每秒。

多鞭毛細菌由于鞭毛的旋轉(zhuǎn)方式不同，其游泳模式通常有兩種方式，即前進(Run)和翻滾(Tumble)。Howard C.Berg教授課題組發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Escherichia coli的周身鞭毛逆時針旋轉(zhuǎn)可以聚集成束推動細菌快速向前游動(即Run，圖3A)，而順時針旋轉(zhuǎn)則使鞭毛解束，脫離的鞭毛旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生不同方向的推進力，使得菌體在原地翻轉(zhuǎn)(即Tumble)，導(dǎo)致大腸桿菌的趨向運動[53]。之后該研究組利用熒光標記細菌和鞭毛，結(jié)合顯微鏡技術(shù)，實現(xiàn)了對細菌運動狀態(tài)的實時記錄，發(fā)現(xiàn)菌體上的不同鞭毛可在不同時間各自改變方向，其中一根鞭毛的方向改變甚至都可以導(dǎo)致原地翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生[54]。Macnab利用暗視野顯微鏡技術(shù)觀察細菌鞭毛的運動狀況，發(fā)現(xiàn)鞭毛是以前進和翻轉(zhuǎn)交替進行的方式游動[55]。單個大腸桿菌細胞在近玻璃表面是按照圓形軌跡游泳。而在半固體瓊脂基質(zhì)上，細胞分化成細長的，鞭毛過表達的表型，在表面上協(xié)同遷移，稱為群集運動(Swarming)?；诖?，研究人員設(shè)計了一種用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的透明狹窄的微通道，用于觀察單個大腸桿菌細胞在瓊脂基底上的移動，發(fā)現(xiàn)微通道中的細胞優(yōu)先沿著右壁游泳[56]。

與大腸桿菌等多鞭毛細菌不同，銅綠假單胞菌和新月柄桿菌Caulobacter crescentus等單鞭毛細菌的游泳模式通常被描述為向前-反向-輕彈(Forward-reverse-flick)，其運動方式遵循不同的物理機理，采用一種正反甩尾方式在液體中游泳[57]，通過鞭毛按順時針或逆時針交替旋轉(zhuǎn)而向前和向后移動，若無外加因素，后退的菌體會沿前進的相同路徑退回，但布朗運動使單鞭毛細菌的泳動軌跡呈“之”字形[58]。布朗大學的研究人員發(fā)現(xiàn)新月柄桿菌的游動依靠細胞體的螺旋運動，鞭毛只是推力的一部分[59]。他們搭建了一個特定的3D可追蹤型顯微鏡平臺，能夠通過載物臺的移動鎖定目標細菌，確保細菌位于顯微鏡正中，使其得以實時、近距離追蹤細菌細胞的運動，并利用阻力理論(Resistive force theory)模型，證實了細菌軀體的螺旋運動導(dǎo)致其向前比向后的游動速度快。Howard C.Berg教授課題組的最新研究發(fā)現(xiàn)新月柄桿菌在向后泳動時鞭毛馬達產(chǎn)生更大的扭矩，這可能有助于菌體在分裂時游動細胞快速從母體細胞脫離。在存在邊界的情況下，鞭毛細菌會貼近壁游泳，此時前進和后退速度明顯不同，細菌運動軌跡更接近圓形[60]。研究結(jié)果表明，細菌運動明顯受到螺距角(Pitch angle)的影響，細菌向前運動相對于向后運動更穩(wěn)定。向前運動時，細胞平行于邊界移動并將保持此狀態(tài)。然而，向后運動時，其運動狀態(tài)取決于細菌是否正在接近或離開邊界[58]。這一現(xiàn)象在大腸桿菌中也有報道，在固體邊界附近，大腸桿菌做順時針圓周運動[61]，軌跡的曲率半徑隨細菌體的長度增加而增加[62]。

2.1.2 蹭行運動(Twitching)

蹭行運動指細菌利用IV型菌毛(TFP)在固體表面上爬行，在假單胞菌、奈瑟菌屬Neisseria中十分常見。它不需要鞭毛的參與，一般沿著細菌長軸的方向，速率最大不超過0.1μm/s。Bradley于1979年提出蹭行運動是通過細菌表面的菌毛系統(tǒng)完成的，菌毛通過伸長，與表面結(jié)合再收縮的方式牽引細菌運動[63]。

銅綠假單胞菌的運動為典型的蹭行運動，其使用IV型菌毛作為線性致動器，用于表面勘探，以實現(xiàn)定向爬行。Gerard C.L.Wong教授課題組使用細菌顯微追蹤技術(shù)研究銅綠假單胞菌在玻璃表面上的蹭行運動，發(fā)現(xiàn)其缺失鞭毛的突變株ΔfliM(排除鞭毛對于蹭行運動的影響)具有兩種TFP驅(qū)動的表面運動方式，即高定向持久性的“匍匐前進”(Crawling)和快速低定向的“直立行走”(Walking)(圖3B)。匍匐前進有較好的定向性，其運動速率相較于典型的隨機運動，既有快速模式(超擴散，Super-diffusive)，也有慢速模式(次擴散，Sub-diffusive)[29]。而直立行走的方向隨機，其運動速率一般是快速模式。一般認為，直立行走對于細菌搜索近鄰環(huán)境更為有效，而長程的類趨化行為則使用匍匐前進的運動方式更為有效。在蹭行中，細菌需要不斷地釋放和收縮TFP，實驗中發(fā)現(xiàn)釋放動作會導(dǎo)致細菌有快速的“彈弓”(Slingshot)運動，細菌通過過度轉(zhuǎn)向有效地轉(zhuǎn)動細胞體(圖3C)，而且這種“彈弓”運動跟基底的表面特性有關(guān)[30,64]。另外研究還發(fā)現(xiàn)細菌的站立狀態(tài)更有利于細菌的表面脫離，細菌先通過菌毛的收縮從匍匐狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檎玖顟B(tài)，再通過鞭毛的轉(zhuǎn)動實現(xiàn)表面的脫離[29]。這種鞭毛和菌毛在近表面的相互作用對于霍亂弧菌Vibrio cholerae的表面定殖有著重要的影響?；魜y弧菌用它們的鞭毛和甘露糖敏感血凝素(MSHA)IV型菌毛協(xié)同作用以實現(xiàn)運動狀態(tài)的切換和表面粘附過程。研究人員觀察到霍亂弧菌的兩種運動行為：“漫游”(Roaming)，其特點是蜿蜒的軌跡；“轉(zhuǎn)圈”(Orbiting)，其特點是重復(fù)的高曲率軌道，只有后者這種模式才可以使細胞不可逆粘附并形成微菌落，而MSHA四型菌毛在其中起著關(guān)鍵作用[31,65](圖3D)。

圖3 單細胞水平上的細菌運動研究實例.(A)近固體表面大腸桿菌的游泳運動呈圓形軌跡[56]；(B)銅綠假單胞菌的(i)“直立行走”和(ii)“匍匐前進”行為[29]；(C)銅綠假單胞菌匍匐前進中可發(fā)生(i)彈弓似的旋轉(zhuǎn)運動和(ii)平移運動[30]；(D)霍亂弧菌的“漫游”、“轉(zhuǎn)圈”運動和初始粘附[65]；(E)大腸桿菌(i, ii)群集運動邊緣處的非對稱流動和(iii)形成的菌落圖案[85]Fig.3 Examples of research on bacteria motility at the single cell level.(A)Cells swim in circular trajectories near a solid planar surface[56].(B)Twitching motility observed inPseudomonas aeruginosa:(i)walking and(ii)crawling[29].(C)Two modes of motion ofPseudomonas aeruginosa:(i)rotational motion;(ii)translational motion[30].(D)Near-surface motion and initial attachment ofVibrio cholerae[65].(E)Swarming patterns ofEscherichia coli[85].

與銅綠假單胞菌的表面運動不同，粘細菌Myxococcus xanthus的運動系統(tǒng)非常具有特色，由兩個獨立的遺傳系統(tǒng)調(diào)控：一是A運動系統(tǒng)(Adventurous，單獨性運動)，主要負責從群體細胞分離的單個細胞的運動；二是 S運動系統(tǒng)(Social，社會性運動)，主要負責細胞群體的運動[66]。兩種運動系統(tǒng)在不同的固體介質(zhì)表面展現(xiàn)出不同的選擇優(yōu)勢，A運動主要在較干燥和較硬的表面(如1.5%瓊脂)，S運動主要在較濕潤和較軟的表面(如0.3%瓊脂)[67]。S運動需要TFP、胞外多糖和 O-抗原[68]的參與，當一個細胞靠近群體中的其他細胞時，其TFP抓住附近細胞的特定胞外糖類，這種接觸又可以引發(fā)TFP的收縮，從而引發(fā)多個細胞粘連而進行定向移動[69]。當單個細胞的突變株 A-S+在固體介質(zhì)表面時，它表現(xiàn)為不運動，但當附近有其他相同類型的細胞存在時，卻能呈現(xiàn)運動趨勢，表明S運動需要細胞之間的近鄰相互作用，細胞與細胞之間通過緊密聯(lián)系進行集體運動[70]。粘細菌的這種依賴TFP的S運動，通常被稱為滑行運動(Gliding)，類似于致病菌如奈瑟氏菌、假單胞菌等的蹭行運動[71-73]。而A運動是從細胞后部分泌的黏液推動細胞前進，細胞滑行過后留下痕跡。當一個細胞碰撞到另一個細胞的側(cè)邊時，其黏液的推動會引起細胞軀體彎曲，使該細胞與另一細胞平行，聚集成細胞并行排列的團簇，這種聚集是短暫的，二者之間未粘附，很快會互相滑過[74-76]。當細胞缺失 S運動時，單個細胞仍然可以獨立地運動[66]。而被拴系(Tethering)的粘細菌會出現(xiàn)緩慢垂直地抖動(Jiggling)，使其向水平方向轉(zhuǎn)變，為后續(xù)的爬行做準備[77]。

2.1.3 群集運動(Swarming)

群集(Swarming)是指運動細菌以群體方式協(xié)調(diào)性地依靠鞭毛和 TFP在培養(yǎng)基表面運動，屬于典型的協(xié)同運動。

群集與生物被膜[78]、子實體的形成[68,79-80]、病原體的侵入和微生物的擴散及共生等過程有著非常密切的聯(lián)系。如果運動的表面是一個宿主，那么病原菌會通過群集運動形成生物被膜，達到感染的目的。由于受到周圍環(huán)境的影響，群集細菌的生理指標常會發(fā)生一些周期性的變化，主要表現(xiàn)為：一是群集細菌會在形態(tài)、代謝、某些蛋白表達等方面出現(xiàn)顯著分化(如菌體拉長、鞭毛過表達等)；二是群集是集體行為，單個細菌是無法在相應(yīng)培養(yǎng)基上做這種擴散運動的；三是群集需要表面活性劑的參與，因而可以通過控制胞外多糖的合成分泌來影響表面活性劑的產(chǎn)量進而調(diào)控細菌的群集運動[81]。群集運動既不是一個饑餓反應(yīng)，也不是一個嚴格的生長發(fā)育階段，而是細菌對外界環(huán)境的刺激所做出的一種激烈且可逆的較為復(fù)雜的適應(yīng)過程[82]。群集運動一般通過鞭毛的旋轉(zhuǎn)、slime的分泌和收縮TFP向前推進[71]。由鞭毛介導(dǎo)的自驅(qū)動系統(tǒng)，如在枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和大腸桿菌中，是基于化學物質(zhì)梯度或營養(yǎng)物水平導(dǎo)致的遠程細胞間相互作用來運動，即趨化性(Chemotaxis)。但是像粘細菌這種基于TFP運動的細菌沒有這種遠程傳遞系統(tǒng)來引導(dǎo)集體運動，它們依賴于相鄰細胞間的接觸信號和社會性運動的信號來運動(類趨化運動)。

利用顯微追蹤技術(shù)可以獲得群集運動中單個細胞的運動行為信息。如Howard C.Berg教授課題組利用暗場和相差顯微鏡技術(shù)追蹤大腸桿菌的群集運動，將氧化鎂粒子沉積于可形成群集運動的大腸桿菌菌落上，發(fā)現(xiàn)氧化鎂粒子層下的細菌仍自由移動，未受到擾動，氧化鎂粒子向空白瓊脂處的擴散速率比細菌的群集運動速率小很多，而這種差異在細菌群集邊緣處更加明顯[83]。細菌的這種在兩個緊密接觸的界面中快速移動的能力有助于其侵染過程。該課題組隨后又結(jié)合熒光染料，使群集過程中細菌的鞭毛可視化，觀察了群集運動中單個細胞的運動軌跡和運動方式，發(fā)現(xiàn)當細菌處于群集運動的邊緣處靜止時，鞭毛向外伸展；當細菌反轉(zhuǎn)的時候，鞭毛的手性改變；當細菌側(cè)向移動時，會被相鄰細菌擠到一側(cè)；而當細菌向前移動時，與游泳運動一樣，鞭毛綁定成束[84]。做群集運動的大腸桿菌菌落邊緣會呈現(xiàn)手性不對稱的流動，表現(xiàn)為沿菌落邊緣的順時針流動，這種現(xiàn)象是由于鞭毛粘住底部基質(zhì)而逆時針旋轉(zhuǎn)，驅(qū)使細菌周圍的流體順時針轉(zhuǎn)動所致[85](圖3E)。也有研究人員利用活細胞實時成像技術(shù)獲得了不同濃度瓊脂上枯草芽孢桿菌周期性群集運動和生長的定量信息，發(fā)現(xiàn)其中的細菌可在生長狀態(tài)和群集狀態(tài)之間進行周期性的切換[86]。這些發(fā)現(xiàn)拓展了對群集運動動力學的理解，并有望將其應(yīng)用于細菌驅(qū)使的微流體裝置中。

粘細菌的群集運動是通過粘液的分泌和TFP的收縮和伸展實現(xiàn)的，包含依賴粘液的A運動和依賴TFP的S運動，在群集運動過程中會出現(xiàn)特定的細胞排列[68]，以獲得充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。當環(huán)境中缺乏營養(yǎng)物質(zhì)時，細胞聚集形成子實體，部分細胞分化形成粘孢子；當營養(yǎng)物質(zhì)充足時，粘細菌生長活躍形成群集菌落。而粘細菌對抗饑餓環(huán)境形成多細胞子實體結(jié)構(gòu)的能力衍生于群集運動邊緣出現(xiàn)的多層的山丘狀(Mound)結(jié)構(gòu)[87]，這種現(xiàn)象在黃色粘球菌和多種粘細菌中均發(fā)生。粘細菌的群集運動使大量菌體聚集，產(chǎn)生大量抗生素和消化酶，利于其捕食和獲得食物。Wu等通過將實驗數(shù)據(jù)與模擬結(jié)果相結(jié)合，定量分析群集運動過程中S運動和A運動各自的貢獻，構(gòu)建了以細胞為基礎(chǔ)的模型來研究粘細菌群集過程中的社會性相互作用[71]。通過分析延時拍攝的細菌群集運動邊緣的視頻，發(fā)現(xiàn)滑行方向的周期性反轉(zhuǎn)對群集很重要，這種反轉(zhuǎn)可定向排列細胞，形成細胞平行排列的聚集體[87]。

抑制或阻止致病菌的群集運動可以用來影響其生物被膜的形成。比如一氧化氮(NO)可以阻止細菌群集行為，從而誘導(dǎo)生物被膜分散[88]。SbrR(PA2895)是銅綠假單胞菌進行呼吸道感染時所必需的基因，其表達會抑制其同源胞質(zhì)功能因子SbrL(PA2896)的活性。細菌缺乏SbrR因子后在群體運動中表現(xiàn)出嚴重缺陷，導(dǎo)致生物被膜更易形成，Dove等發(fā)現(xiàn)可以表征 sigma因子/抗 sigma因子系統(tǒng)，相互調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌表面的群集行為，來調(diào)節(jié)其群集運動性和生物被膜形成[89]。

2.2 利用顯微追蹤技術(shù)在單細胞水平上研究生物被膜形成過程的調(diào)控

從浮游狀態(tài)到細菌生物被膜，細菌經(jīng)歷了從低密度到高密度、從無組織狀態(tài)到有組織狀態(tài)的過程，在此過程中，細菌會分泌大量的胞外物質(zhì)包括多糖和蛋白質(zhì)來完成生物被膜的搭建。在細菌完成了表面附著后，細菌通過多種信號調(diào)控途徑引導(dǎo)細胞個體之間的協(xié)同運動，包括群體感應(yīng)系統(tǒng)、雙因子調(diào)控系統(tǒng)[90]、sigma因子、環(huán)二核苷酸信號系統(tǒng)、mRNA結(jié)合蛋白-Spna、RNA酶以及毒素-非毒素系統(tǒng)等[91]，其中有幾種基礎(chǔ)的細菌信號調(diào)控途徑分別是群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)、環(huán)二核苷酸信號系統(tǒng)(c-di-GMP)和多糖調(diào)控系統(tǒng)，其在細菌的生物被膜形成中發(fā)揮重要的作用。

2.2.1 群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing)

細菌的群體感應(yīng)是細菌根據(jù)細胞密度變化進行基因表達調(diào)控的一種生理行為，具有群體感應(yīng)的細菌能產(chǎn)生并釋放成為自體誘導(dǎo)物的信號分子，當其積累到一定閾值時可與調(diào)控蛋白結(jié)合從而啟動細菌中特定基因的表達。細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)對生物被膜的形成和生物被膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用[23,92-93]。Davies等在1998年就發(fā)現(xiàn)細胞信號在常見細菌分化過程中是必需的，群體感應(yīng)對生物被膜的完整性有重要影響，抑制群體感應(yīng)信號可以抑制生物被膜的產(chǎn)生[22]。它對革蘭氏陰性菌生物被膜的調(diào)節(jié)主要是通過?；呓z氨酸內(nèi)酯類信號分子(Acyl-homoserine lactone，Acyl-HSL)來實現(xiàn)的。其中銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)調(diào)控過程如圖4A所示，4個自誘導(dǎo)分子合成酶合成相應(yīng)的自誘導(dǎo)分子，即3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C12-HSL)、N-丁?；呓z氨酸內(nèi)酯(C4-HSL)、2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(PQS)和2-(2-羥苯基)噻唑-4-甲醛(IQS)，當這些自誘導(dǎo)分子達到閾值時，轉(zhuǎn)錄激活因子激活合成相應(yīng)受體，二者結(jié)合，直接或間接調(diào)控基因表達[94]。銅綠假單胞菌使用Acyl-HSL等信號通過群體感應(yīng)調(diào)控基因表達，影響多糖、鼠李糖脂和其他毒力因子的產(chǎn)生及表面運動性，進而影響生物被膜的組裝和結(jié)構(gòu)[95]。其中 C4-HSL和N-3-羰基十二?；呓z氨酸內(nèi)酯(3OC12-HSL)是微菌落分化發(fā)育所需的，生物被膜中C4-HSL的表達量要遠多于液體培養(yǎng)狀態(tài)下的量[96]。相比銅綠假單胞菌野生株的高度結(jié)構(gòu)化的生物被膜，不產(chǎn)生Acyl-HSL的群體感應(yīng)系統(tǒng)缺陷株則不能形成生物被膜。

除了生物被膜的結(jié)構(gòu)，群體感應(yīng)也對細菌的運動行為有著重要的影響。以粘細菌為例[97]，其子實體的發(fā)育過程包含以下階段：1)營養(yǎng)生長的細胞對外界環(huán)境信號作出反應(yīng)，進入發(fā)育階段；2)細胞聚集或相互交流，聚集最先出現(xiàn)在菌體密度較大的地方，形成環(huán)形區(qū)域，內(nèi)部菌體平行排列；3)細胞表面產(chǎn)生介導(dǎo)細胞粘連的分子；4)隨著子實體生長，細胞進行有序重排或成串排列；5)形成特定形狀的子實體；6)營養(yǎng)細胞分化成粘孢子。在該過程中，細菌的運動行為不論是從運動速度或者細胞排列方式等都有顯著的變化。而運動行為的變化及其相關(guān)基因表達是受到多種信號分子的高度調(diào)控的[75,98-99]。粘細菌通常通過多種胞外多肽蛋白分子來感知群體密度[100]，目前在粘細菌中發(fā)現(xiàn)的有5類：Asg、Bsg、Csg、Dsg、Esg[101-102]，其中 A 信號和 C信號及其傳導(dǎo)途徑在子實體發(fā)育及產(chǎn)孢過程中起著非常重要的作用，它是誘導(dǎo)細胞的波紋運動、聚集行為、生孢相關(guān)基因表達的信號。不同濃度的C信號對應(yīng)不同的發(fā)育階段[103]，而當體內(nèi)過表達 C信號時，又會誘導(dǎo)發(fā)育的各個階段提前發(fā)生[104]。

群體感應(yīng)信號分子是細菌用來與其他細胞通訊以應(yīng)對環(huán)境條件變化的有效工具，而這也為控制生物被膜提供了一個新方向。通過研究群體感應(yīng)信號分子和周圍環(huán)境條件的關(guān)系，期待可以通過控制環(huán)境因素來干擾或切斷群體感應(yīng)信號分子的傳遞進而有效減緩生物被膜的形成。Kim等利用金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和霍亂弧菌作為研究對象，研究了不同流速不同基質(zhì)表面的生物被膜生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)高流速可抑制 QS，流速的壓力迫使細菌形成生物被膜來傳遞自體誘導(dǎo)物，而且離流速入口距離的遠近不同，QS反應(yīng)也有明顯差異，而細菌活動的介質(zhì)表面的凹陷裂縫處QS可正常運行(圖4B)。該工作揭示了QS在流體系統(tǒng)中時間和空間上的不均一性，為防治腸道疾病、治理管道堵塞等提供了新的思路和策略[105]。

圖4 生物被膜形成過程的調(diào)控研究實例.(A)銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)[94]；(B)金黃色葡萄球菌受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控在特殊地形表面的存在狀態(tài)，紅色表示不存在QS的細胞群，黃色表示正受QS調(diào)控的細胞群[105]；(C)c-di-GMP的結(jié)構(gòu)式及代謝通路[107]；(D)銅綠假單胞菌受多糖調(diào)控的(i)表面到訪頻率分布和(ii)細菌分布[28]；(E)多糖Psl對于生物被膜結(jié)構(gòu)的影響(上為Psl過表達菌株WFPA801，下為野生型PAO1)[121]Fig.4 Examples of biofilm regulation.(A)Quorum sensing circuits inPseudomonas aeruginosa[94].(B)Effect of surface morphology and flow on quorum sensing ofStaphylococcus aureusin microfluidic channels.Red, QS-off cells.Yellow, QS-on cells[105].(C)Structure and metabolism ofc-di-GMP[107].(D)InPseudomonas aeruginosa:(i)polysaccharide-dependent visit frequency map, and(ii)distribution of cells on the surface[28].(E)Effect of Psl on biofilm architecture: top, Psl overproducer WFPA801; bottom, wt PAO1[121].

2.2.2 c-di-GMP調(diào)控系統(tǒng)

雙-(3-5)-環(huán)二聚鳥苷一磷酸(c-di-GMP)是在生物被膜生命周期中起重要作用的動態(tài)細胞內(nèi)信號分子，是細菌中廣泛使用的第二信使，由2個分子GTP經(jīng)二鳥苷酸環(huán)化酶(DGC)催化縮合，形成環(huán)狀二核苷酸。c-di-GMP通過與相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合并激活受體蛋白而發(fā)揮作用，最終由磷酸二酯酶(PDE)降解[106-107](圖4C)。它的作用非常廣泛，參與調(diào)節(jié)細菌的多種生理功能，如生物被膜形成、表面群集運動等。細胞內(nèi)c-di-GMP的濃度對于細菌適應(yīng)環(huán)境變化、調(diào)節(jié)生命活動是非常重要的，因此c-di-GMP濃度的調(diào)節(jié)和控制對細菌具有重要意義。c-di-GMP發(fā)揮高效信號作用需要其對應(yīng)的代謝蛋白、受體、目標物距離較近，此時其合成和降解均會比較少；而當 DGC/PDE遠離效應(yīng)器/目標分子時，DGC會催化合成更多的c-di-GMP；當c-di-GMP與效應(yīng)蛋白距離較遠時，其信號通路可能會被抑制[106]。

常規(guī)測量c-di-GMP通常采用化學提取法，但該方法獲得的只是整個生物被膜中c-di-GMP的平均濃度，無法獲知單細胞水平上生物被膜內(nèi)c-di-GMP的分布以及單個細胞內(nèi)的分布情況。研究人員開發(fā)了一種實時成像的定量方法，以綠色熒光蛋白(GFP)的表達量反應(yīng)c-di-GMP濃度，以青色熒光蛋白(CFP)作為生物量指示劑，精確給出了c-di-GMP在生物被膜中的分布情況。數(shù)據(jù)表明c-di-GMP在生物被膜形成早期的小菌落中分布較均勻，而在成熟生物被膜中多分布于菌落外緣，表明這種第二信使隨時間和菌落變化是動力學可變的，也實時反映了生物被膜異質(zhì)性的程度[108]。Christen等通過顯微鏡和基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的傳感器監(jiān)測了單個細胞中c-di-GMP的濃度，發(fā)現(xiàn)c-di-GMP分布隨細胞分裂的不同階段而不同，且在形成的子代中也呈不對稱分布[109]。c-di-GMP的這種空間和時間上的不對稱分布可以調(diào)控胞外細胞器的生物合成和功能，進而影響細菌的表面粘附和生物被膜形成。c-di-GMP通過影響大量的調(diào)控因子和路徑，從而在生物被膜形成過程中的各個階段發(fā)揮作用[110]。其中對細菌運動性的調(diào)控是一個重要方式。如FleN是銅綠假單胞菌的一種重要的鞭毛調(diào)節(jié)因子，fleN基因突變的菌株會喪失運動性，且可產(chǎn)生多根鞭毛，表現(xiàn)為雜亂的“翻滾”(Tumbling)行為。FleN通過與c-di-GMP結(jié)合，調(diào)控銅綠假單胞菌的單鞭毛合成，進而改變其運動方式[111]。銅綠假單胞菌中的FleQ是最早確定的能與c-di-GMP結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)leQ與c-di-GMP結(jié)合可以活化鞭毛合成蛋白的表達并抑制胞外多糖合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，以此調(diào)控胞外多糖的產(chǎn)生和生物被膜的形成。Matsuyama等通過解析FleQ與c-di-GMP的結(jié)合位點和作用機制，發(fā)現(xiàn)在溶液中c-di-GMP可以驅(qū)使FleQ低聚體的重組，并且這種作用不會影響其對EPS相關(guān)基因表達的抑制和活化功能[112]。

c-di-GMP同時也是介導(dǎo)霍亂弧菌的運動性和生物被膜基質(zhì)形成的關(guān)鍵信號分子，促使細菌從浮游態(tài)向生物被膜的轉(zhuǎn)變。通過調(diào)節(jié)c-di-GMP的表達，可以影響霍亂弧菌生物被膜的形成過程，進而阻止其在人體內(nèi)定殖及感染過程?；魜y弧菌的轉(zhuǎn)錄抑制試驗表明高濃度的c-di-GMP促進msh(MSHA菌毛的操縱子編碼)、vps(Vibriopolysaccharide)基因簇等其他生物被膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，抑制鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄[65,113]。而且，c-di-GMP合成酶和磷酸二酯酶可以調(diào)控c-di-GMP的濃度和vps基因表達，最終影響生物被膜的形成[114]。

2.2.3 多糖調(diào)控系統(tǒng)

多糖是構(gòu)成生物被膜骨架的主要成分，因而多糖調(diào)控系統(tǒng)在細菌生物被膜的形成過程中扮演著舉足輕重的角色。銅綠假單胞菌的胞外多糖主要包括 Psl、Pel和 alginate多糖，而不同的成分在細菌生物被膜形成過程中發(fā)揮不同的作用[19,21,115-117]。其中Psl多糖由一個重復(fù)的五糖單元多聚而成，五糖單元由 D-葡萄糖、D-甘露糖和L-鼠李糖組成，它充當了2個二鳥甘酸環(huán)化酶siaD和sadC的刺激信號，可以增加二者的產(chǎn)量，進而升高細胞內(nèi)c-di-GMP的濃度，影響銅綠假單胞菌生物被膜的形成[118-120]。研究人員通過將多糖在不同階段的分布軌跡可視化，發(fā)現(xiàn)在附著期間，Psl以螺旋模式錨定在細胞表面上，促進細胞-細胞之間的相互作用和基質(zhì)的裝配；而在生物被膜成熟期間，Psl從細菌表面的化學解離破壞了Psl基質(zhì)以及生物被膜結(jié)構(gòu)。Psl積累在呈3-D結(jié)構(gòu)的小菌落外圍，導(dǎo)致在微菌落中心形成無Psl基質(zhì)的“自由腔”(Matrix-free area)；在生物被膜解離階段，解離的浮游細胞出現(xiàn)在該基質(zhì)自由腔中，死細胞和胞外 DNA(eDNA)也集中在無Psl基質(zhì)區(qū)域，而細胞死亡和自溶的控制基因引起基質(zhì)腔和小菌落破散[21]。

Psl多糖通常作為一種“粘合劑”，主要用于增強細胞在表面的粘附。Zhao等利用細菌顯微追蹤技術(shù)，研究了在生物被膜形成的初期階段銅綠假單胞菌在玻璃表面的運動模式，發(fā)現(xiàn)了Psl多糖的一種新功能，即可以作為細菌集聚信號引導(dǎo)細菌的表面運動。研究發(fā)現(xiàn)，當細菌在表面蹭行時，其分泌的Psl多糖會在表面留下痕跡。由于細菌菌毛與多糖的相互作用，這些痕跡會影響后來細菌的運動行為，使得這些 Psl濃度高的區(qū)域吸引其他細菌的到訪，而其他細菌的到訪又會使該區(qū)域累積更多的Psl進而吸引更多的細菌到訪，由此形成一個正反饋，即Psl聚集導(dǎo)致更多的細胞聚集，一旦聚集了足夠多的細菌(約50個左右)，這些細菌的行為就會發(fā)生改變，不再單個行動，而是形成微菌落結(jié)構(gòu)(Microcolonies)，從而成為觸發(fā)生物被膜形成的原始基礎(chǔ)菌落(圖4D)[28]。中國科學院微生物研究所馬旅雁團隊也發(fā)現(xiàn)TFP介導(dǎo)的細菌遷移可以導(dǎo)致Psl纖維狀基質(zhì)的形成，該Psl纖維狀基質(zhì)在生物被膜的中間位置(營養(yǎng)匱乏區(qū))呈現(xiàn)輻射狀，暗示有促進細菌向營養(yǎng)物質(zhì)遷移的作用(圖4E)[121]。Psl作為維持生物被膜結(jié)構(gòu)的骨架成分之一，在細菌粘附過程中起關(guān)鍵作用，若過表達則會影響生物被膜的整體結(jié)構(gòu)，使之呈蘑菇狀，表面粗糙度高，而野生型菌株形成的生物被膜相對平坦，覆蓋面積大[19,121]。

這些研究結(jié)果表明如果能阻止或干擾 Psl多糖在表面的分布，也許就能在某種程度上抑制生物被膜的形成。有意思的是，在2015年，中國科學院微生物研究所馬旅雁課題組和山東大學的谷立川課題組解析了 Psl合成途徑中重要的糖苷水解酶PslG的晶體結(jié)構(gòu)，通過結(jié)構(gòu)分析及同源蛋白比對發(fā)現(xiàn)PslG具有糖苷內(nèi)切酶的特征，PslG可以通過水解 Psl抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，甚至可以水解已經(jīng)成熟的生物被膜。研究發(fā)現(xiàn)，納摩爾濃度的PslG可在半小時內(nèi)將生物被膜的物質(zhì)量降低90%以上，顯示了其瓦解生物被膜的高效性。經(jīng)PslG處理過的生物被膜對抗生素的抗性下降了4–8倍，并且對巨噬細胞更為敏感[122]。除 PslG外，還有其他可以抑制生物被膜的物質(zhì)，比如在辛酸存在的條件下，低濃度的鼠李糖脂有望用于抑制或者破壞生物被膜[123]。

2.2.4 其他機制調(diào)控細菌生物被膜形成

生物被膜的形成過程是一個細菌跟外界環(huán)境相互作用并通過自身的生理調(diào)控來適應(yīng)外界環(huán)境的過程。除了上面提到的QS系統(tǒng)、c-di-GMP系統(tǒng)和多糖系統(tǒng)外，生物被膜的形成也受許多其他因素(如環(huán)境因素中空間脅迫或抗生素脅迫)的直接影響。

Howard A.Stone教授課題組利用微流控技術(shù)，研究了在特定空間內(nèi)霍亂弧菌生物被膜的生長模式和結(jié)構(gòu)[48,124]，發(fā)現(xiàn)表面粘附導(dǎo)致的壓迫，使霍亂弧菌的生物被膜從2D分枝狀結(jié)構(gòu)向致密且排列有序的3D聚集體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，該過程由基因rbmA控制。Cynthia Winchurch教授課題組利用高分辨率、相差顯微鏡延時拍攝和計算機視覺算法，研究了銅綠假單胞菌在半固體表面的運動行為，發(fā)現(xiàn)在生物被膜形成前期，會有結(jié)合緊密的細胞群(處于同一高度的細菌)在半固體表面遷移，產(chǎn)生溝壑，形成復(fù)雜的運動軌跡網(wǎng)絡(luò)，以方便后面的細胞遷移。其中，eDNA有利于整個溝壟中細胞保持連貫排列，避免細胞碰撞，確保群體的高效遷移[32]。

在有抗生素的環(huán)境下，細菌的群體行為也會發(fā)生適應(yīng)性的改變。研究顯示在羧芐青霉素存在的情況下，銅綠假單胞菌通過TFP-TFP相互作用可以促進細胞-細胞相互作用，限制單個細胞運動，減慢群體擴展，進而幫助群體規(guī)避有毒物質(zhì)[125]。SOS應(yīng)答系統(tǒng)(SOS response system)是細菌DNA損傷誘導(dǎo)反應(yīng)系統(tǒng)，普遍存在于大腸桿菌、霍亂弧菌等重要病原菌中，具有遺傳毒性的環(huán)丙沙星可以誘導(dǎo)大腸桿菌的SOS反應(yīng)，將桿狀大腸桿菌變?yōu)楹嗳旧w的細絲狀物，誘導(dǎo)染色體間等位基因重組，然后繁殖有抗性的無絲狀后代，母體長絲死亡，從而增強大腸桿菌對環(huán)丙沙星的抗性[126]。而抗生素在滲透進生物被膜的過程中，由于生物被膜自身的特性，抗生素的濃度隨進入生物被膜的深度而減弱。因而研究抗生素濃度梯度對細菌的影響，對理解生物被膜的抗藥性十分重要。Robert Austin教授課題組利用微流控技術(shù)創(chuàng)建了具有不同抗生素濃度的異質(zhì)空間環(huán)境，觀察了大腸桿菌在不同毒性梯度中的結(jié)構(gòu)變化，并通過全基因組測序，揭示了抗藥性是細菌對抗生素脅迫產(chǎn)生的生物反應(yīng)的進化[127]。

3 前景展望

細菌顯微追蹤技術(shù)是以成像技術(shù)為基礎(chǔ)的新型微生物研究手段。近幾年成像技術(shù)在快速性、靈敏性以及三維成像方面都取得了很好的進展，為顯微追蹤技術(shù)的發(fā)展提供了很好的支持。2010年 Saar等開發(fā)了以受激拉曼散射(SRS)為基礎(chǔ)，以核磁共振成像(MRI)為輔助的新型顯微成像技術(shù)，此成像技術(shù)快速靈敏，能夠捕獲血細胞擠進毛細血管時的“視頻”圖像，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于捕獲器官、腫瘤以及其他大型結(jié)構(gòu)的靜態(tài)圖像[128]。Erturk等開發(fā)出一種研究神經(jīng)組織再生結(jié)構(gòu)的新方法，不僅能檢查完整組織中的單個神經(jīng)細胞，還能描繪出它的三維圖像，并利用熒光染料追蹤其在脊髓中的路徑[129]。Su等利用紅光和藍光偏移波束建立了全息信息，配合先進的軟件，實現(xiàn)了顯微鏡下對快速移動物體的追蹤，獲得了其精確的三維運動軌跡[37]。未來，整合這些先進的成像技術(shù)，發(fā)展新型的微生物顯微追蹤技術(shù)，將會在微生物學領(lǐng)域，尤其是在由多種微生物組成的復(fù)雜微生物群落的研究領(lǐng)域，發(fā)揮重要的作用。

自然界中的微生物群落是由不同種微生物共同組成的。不同種微生物之間的相互作用對于微生物群落的演變以及個體微生物的進化都具有重要意義，因而對不同種微生物之間相互作用的研究是理解微生物群落的關(guān)鍵。例如在口腔環(huán)境中，口腔生物被膜先由核梭菌Fusobacterium mucleatum產(chǎn)生，為隨后定殖其中的牙齦卟啉單胞菌Porphymonas gingivalis提供了空間上的支持，而后者可以激活口腔中的蛋白酶，前者依靠這些蛋白酶吸收營養(yǎng)物質(zhì)，彼此獲益[130]。Benomar等研究了普通脫硫弧菌Desulfovibrio vulgarisHildenborough和丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum共生體系中二者之間緊密的相互作用，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的脅迫會導(dǎo)致共生細菌之間的相互作用，包括蛋白質(zhì)等細胞分子的交換，特定基因表達量的差異等[131]。目前作為研究熱點的腸道微生物群組更是包含了數(shù)量眾多的微生物種類。它們在人體能量代謝、營養(yǎng)物質(zhì)吸收、胃腸道功能及免疫等方面發(fā)揮重要作用，一旦腸胃微生物的內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破，就會誘發(fā)多種人類疾病[132-136]。研究者在腸道菌群中建立了共生基因組模型，認為宿主基因組和微生物組是一個整體，接受自然選擇，宿主與其腸道微生物的組成和功能是一個長期的協(xié)同進化過程，拓展了共生體如何塑造宿主進化的觀念[132]。共生微生物間通常會形成胞間納米管來互相傳遞營養(yǎng)物質(zhì)和信號等，而對于病原微生物，其遺傳性或非遺傳性的抗藥性也都可以通過納米管的傳遞從相鄰細胞獲得[133-134]。微生物之間也會相互競爭，而當細菌之間的競爭損害了菌群的合作網(wǎng)絡(luò)時，菌群穩(wěn)定性會提升且宿主能夠從細菌之間的競爭中受益[134]。因此研究這些不同種微生物之間的關(guān)系以及微生物和宿主細胞的關(guān)系對于理解腸道微生物群組的生態(tài)是至關(guān)重要的。近年來以高通量測序為基礎(chǔ)的腸道宏基因組學、功能基因組學、代謝組學和蛋白質(zhì)組學的不斷發(fā)展，極大地促進了腸道微生物研究的發(fā)展。但當前在單細胞水平上進行腸道微生物之間以及微生物和宿主細胞之間相互作用的研究相對較少，尤其是信號傳導(dǎo)方式、不同種微生物如何影響寄主基因表達、如何協(xié)同維持體內(nèi)微生物和寄主的內(nèi)穩(wěn)態(tài)等問題背后的機制并不清楚。而細菌顯微追蹤技術(shù)可以充分發(fā)揮其在單細胞水平上進行微生物行為研究的技術(shù)優(yōu)勢，同時結(jié)合基因組學、代謝組學以及其他生物學研究工具，可以深入了解腸道微生物種群之間以及種群和寄主之間的關(guān)系，這也是未來十年腸道微生物菌群分析方法研究的重要方向[137]。

4 總結(jié)

細菌顯微追蹤技術(shù)是在成像技術(shù)上結(jié)合圖像識別和統(tǒng)計分析的算法而發(fā)展起來的一項新技術(shù)。具有高時空分辨率，操作方便，可以對細菌的形貌、運動狀態(tài)、動態(tài)生理反應(yīng)等信息進行實時的原位觀測等優(yōu)勢，尤其可以在單細胞水平上對細菌的運動進行精確高保真的統(tǒng)計分析，為研究細菌的群體行為比如生物被膜提供了良好的技術(shù)平臺。但是，目前的細菌顯微追蹤技術(shù)還主要局限于對二維圖像數(shù)據(jù)的采集和分析，獲得的也只是表觀上的信息，對成分、三維結(jié)構(gòu)等信息鑒別能力有限，而且受設(shè)備硬件的限制，無法探索在活體生物環(huán)境下(in vivo)的微生物群體行為。因此，細菌顯微追蹤技術(shù)的未來方向應(yīng)該是向三維空間的追蹤和圖像分析技術(shù)發(fā)展，并開發(fā)可以進行活體生物環(huán)境下的觀測手段。通過與基因組學、代謝組學以及其他生物學研究工具的緊密結(jié)合，細菌顯微追蹤技術(shù)不僅在生物被膜領(lǐng)域也將在微生物行為研究的其他領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

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(本文責編 陳宏宇)

Application of bacterial tracking techniques in biofilms

Wenchao Zhang1,2*, Jingchao Zhang1,2*, and Kun Zhao1,2,3
1Key Laboratory of Systems Bioengineering,Ministry of Education,Tianjin300350,China
2School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin300350,China
3Collaborative Innovation Centre of Chemical Science and Engineering,Tianjin University,Tianjin300350,China

Biofilms are surface-attached complex aggregates consisting of bacteria cells and extracellular polymeric substances.Cells in biofilms show strong resistance to antibiotics and immune-escape capabilities.Their motility and metabolic activities are quite different from those when they are in planktonic style.In recent years, applications of newimage-capturing techniques together with new image-processing methods, have greatly advanced the development of bacterial studies.This review focuses on bacterial tracking techniques.We first present an overview of recent progress in applications of those techniques in biofilm research, especially in the areas of bacterial motility and biofilm regulation,including swimming, twitching, swarming and typical regulatory signaling pathways for biofilms.Then we give a prospect for future applications of bacterial tracking in other related microbial fields.

bacterial tracking, biofilm, motility, single cell level, collective motion

April2,2017;Accepted:May31,2017

Kun Zhao.E-mail:kunzhao@tju.edu.cn

張文超, 張靜超, 趙坤.細菌顯微追蹤技術(shù)在生物被膜中的應(yīng)用.生物工程學報,2017,33(9):1411–1432.

Zhang WC, Zhang JC, Zhao K.Application of bacterial tracking techniques in biofilms.Chin J Biotech,2017,33(9):1411–1432.

Supported by:Recruitment Program of Global Experts, Tianjin Municipal Natural Science Foundation(No.15JCZDJC41100).

*These authors contributed equally to this study.

千人計劃(青年項目)，天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(No.15JCZDJC41100)資助。

時間：2017-06-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170619.1547.003.html

趙坤 天津大學化工學院教授。本科和碩士畢業(yè)于北京大學技術(shù)物理系。博士畢業(yè)于美國普林斯頓大學物理系。先后在美國加州大學洛杉磯分?；瘜W與生物化學系和生物工程系工作。2014年回國在天津大學化工學院工作至今。并于2014年入選國家“青年千人計劃”。目前主要研究方向包括細菌成像和識別，微生物系統(tǒng)的群體行為及應(yīng)用，生物材料和高分子材料的引導(dǎo)組裝。