張澤杰 蘇 喜1, 徐 溢 陳 李

(重慶大學 新型微納器件與系統(tǒng)技術重點學科實驗室1，化學化工學院2，光電工程學院微系統(tǒng)研究中心3，微納系統(tǒng)及新材料技術國際研發(fā)中心4，重慶 400044)

多功能芯片對合成樣本中肝癌細胞HepG2的測試研究

張澤杰2,4蘇 喜1,2,4徐 溢*1,2,3,4陳 李*1,3,4

(重慶大學 新型微納器件與系統(tǒng)技術重點學科實驗室1，化學化工學院2，光電工程學院微系統(tǒng)研究中心3，微納系統(tǒng)及新材料技術國際研發(fā)中心4，重慶 400044)

設計并制作了一種集多孔流分離(Multi-orifice flow fractionation, MOFF)技術與磁捕獲技術于一體的用于特異性分離和捕獲合成樣本中肝癌細胞HepG2的多功能微流控細胞芯片。此芯片由玻璃基片和PDMS微通道蓋片組成，PDMS蓋片上含有3條進樣通道、MOFF分離區(qū)和六邊形腔體的細胞富集檢測區(qū)。其中，MOFF分離區(qū)總長20 mm， 由80組長度為0.18 mm、深度為50 μm、收縮區(qū)域寬度為0.06 mm、擴張區(qū)域寬度為0.20 mm的半菱形收縮/擴張重復單元組成，每組收縮/擴張重復單元間的夾角為103.0°。實驗以肝癌細胞HepG2 -血細胞混懸液為樣本；根據(jù)磁珠表面修飾c-Met抗體能與肝癌細胞HepG2特異性結合的原理，通過表面羧基化的磁珠、EDC(1 mg/mL)、NHS(1 mg/mL)和c-Met抗體制備了濃度為50 μg/mL的免疫磁珠(Anti-MNCs)懸浮液。在樣本流速為50 μL/min條件下，利用外加磁場實現(xiàn)了血細胞合成樣本中微量肝癌細胞HepG2的有效捕獲；采用微波加熱法以檸檬酸、硫脲為原料制備了用于熒光標記HepG2的碳量子點，在芯片上實現(xiàn)了血液中肝癌細胞HepG2的原位熒光可視化觀測。對芯片檢測區(qū)捕獲到的HepG2進行了顯微計數(shù)分析，對500 μL血細胞(107cell/mL)中含10個HepG2細胞的合成樣本，捕獲效率達到88.5%±6.7% (n=20)。結果表明，所設計的多模式多功能的微流控芯片具有良好的腫瘤細胞分離和檢測功能。

微流控芯片； 多孔流分離； 磁捕獲； 熒光可視化； 肝癌細胞HepG2

2017-07-13收稿；2017-09-06接受

本文系國家自然科學基金項目(No.21375156)、 國家高技術研究發(fā)展計劃(863)項目(No.2015AA021104)、重慶市前沿研究重點項目(No. cstc2015jcyjBX0010)和重慶市科學技術委員會社會民生科技創(chuàng)新項目 (No. cstc2015shms zx00014)資助

* E-mail: xuyibbd@sina.com; CL2009@cqu.edu.cn

1 引 言

循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumour cells, CTCs)的分離檢測在癌癥早期診斷，腫瘤轉移判斷，腫瘤患者臨床針對性治療以及治療效果評估等方面具有重要意義[1,2]。微流控芯片因其高通量、高內涵、樣本需求少等優(yōu)點，在CTCs分離、富集方面已得到廣泛研究與關注[3]。

基于微流控芯片的物理分離具有操作簡便，分離過程快速等優(yōu)勢，包括基于細胞尺寸的離心分離、多孔流分離和磁分離等[4,5]。Lee等[6]基于細胞間尺寸差異采用離心法在芯片上對2～4 mL乳腺癌細胞-血細胞合成樣本進行分離，30 s實現(xiàn)了腫瘤細胞的分離，分離效率達61%?；陔x心技術的微流控芯片具有分離快速的優(yōu)勢，但離心過程易產(chǎn)生腫瘤細胞丟失，導致分離效率較低。Hyun等[7]依據(jù)不同粒徑的微粒在收縮/擴張的多孔通道中水動力慣性力作用不同的原理，采用多孔流分離(Multi-orifice flow fractionation, MOFF)技術對24組7.5 mL的合成樣本進行細胞分離，30 min內分離出的腫瘤細胞數(shù)量在0～21個之間。Shen等[8]采用的MOFF芯片在每分鐘分離2.24 ×107個細胞的情況下，分離出合成樣本中的腫瘤細胞。單一MOFF分離模式的芯片分離過程快速，但分離出的細胞通常只能在芯片外檢測，無法實現(xiàn)芯片上原位檢測。Tang等[9]在平行排列的金屬鎳陣列通道上通過外加磁場對磁珠-細胞復合物進行吸附，而實現(xiàn)600～800 μL血液中MCF-7分離，分離效果為43.0% ± 1.2% (n=3)。Kang等[10]采用相同的方法成功對樣本中大鼠M6C乳腺癌細胞進行了分離。磁分離法通過外加磁場可以將分離出的細胞吸附在芯片上具有原位檢測的優(yōu)勢，但血液樣本中大量血細胞的自然沉降和非特異吸附會影響分離效果。目前，各種單一細胞分離模式的研究相對較多，但將多種分離模式有效結合實現(xiàn)高效分離測試的卻很少，如何集成多模式分離依然是研究熱點。

目前，熒光檢測以其檢測靈敏度高和易于集成的特點，成為微流控芯片上應用最多的檢測技術[11,12]，Chen 等[13]通過典型的蔗糖-油酸加熱法制備的碳量子點和Li等[14]通過硫脲-檸檬酸微波消解制備的碳量子點都成功用于腫瘤細胞的熒光標記。碳量子點具有熒光性能穩(wěn)定、細胞毒性低、生物相容性好、易于大量合成及功能化修飾、制備成本低廉等優(yōu)點，其在細胞成像和檢測方面?zhèn)涫荜P注[15～17]。

本研究將多孔流分離與磁分選兩種分離模式相結合，針對肝癌細胞HepG2-血細胞混懸液樣本，利用多孔流模式初步分離大部分血細胞，進而在外加磁場作用下進行目標腫瘤細胞的第二次磁分離和捕獲。同時，采用碳量子點和免疫磁珠對HepG2細胞進行熒光標記及免疫磁標記，在優(yōu)化的流速條件下，利用外加磁場在微流控芯片的檢測區(qū)對血細胞中微量HepG2細胞進行有效分離和捕獲，最后通過顯微觀測對芯片檢測區(qū)捕獲到的HepG2細胞進行原位計數(shù)分析。

2 實驗部分

2.1儀器與試劑

70-4505微流控注射泵(美國Harvard Apparatus公司)，OLYMPUS IX71倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)，UV-2450紫外可見分光光度計(日本 島津公司)。

NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O和KH2PO4(分析純，重慶川東化工有限公司)；檸檬酸(分析純，重慶博藝化學試劑有限公司)；硫脲(分析純，重慶化學試劑廠)；羧基修飾Fe3O4納米粒子(150 nm，天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心)；c-Met(E999)pAb(美國Bioworld Technology公司)；N-甲基羥琥珀酰亞胺(NHS，分析純，成都市科龍化工試劑廠)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC，98.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、肝癌細胞HepG2懸液(104cell/mL)、血細胞懸液(107cell/mL)。

2.2實驗方法

2.2.1微流控芯片制作制作的微流控芯片包含有微通道的PDMS蓋片及玻璃基片(圖1)。PDMS的微通道包含3條進樣通道、MOFF分離區(qū)和六邊形腔體的細胞富集檢測區(qū)。其中，MOFF分離區(qū)總長20 mm，由80組長度為0.18 mm、深度為50 μm、收縮區(qū)域寬度為0.06 mm、擴張區(qū)域寬度為0.20 mm的半菱形收縮/擴張重復單元組成，每組收縮/擴張重復單元間的夾角為103.0°(圖1A)。所涉及的微流控蓋片采用模塑法制備(圖1B)。

圖1 (A)MOFF結構及尺寸示意圖；(B)芯片實物圖Fig.1 (A) Scheme of structure and size of multi-orifice flow fractionation (MOFF)；(B) figure of polydimethylsiloxane (PDMS) cover plate

2.2.2碳量子點制備[14]稱取檸檬酸和硫脲各0.5 g，加入20 mL去離子水溶解，將其置于微波爐加熱反應7 min，取出冷卻至室溫。于10000 r/min 離心5 min后，0.22 μm過濾膜過濾，4℃避光保存，得碳量子點(Carbon quantum dots, CQDs)。對所得碳量子點進行熒光光譜檢測。

2.2.3免疫磁珠制備向500 μg表面羧基化的磁珠中，加入新配制的1 mL EDC (1 mg/mL)和1 mL NHS(1 mg/mL)，室溫振搖30 min，活化磁珠表面的羧基，加入8 μLc-Met抗體(1 μg/μL)，繼續(xù)孵育5 h，PBS清洗3次。在室溫下與500 μL BSA(1 mg/mL)封閉液孵育3 h。重懸于PBS中使其終濃度為50 μg/mL免疫磁珠(Anti-MNCs)懸浮液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4碳量子點和免疫磁珠標記血液樣本中的HepG2細胞將HepG2細胞(104個/mL)與血細胞懸液(107cell/mL)按體積比1∶1混合得混合細胞懸液，向100 μL混合細胞懸液中加入500 μL CQDs，PBS緩沖液定容至1 mL。37℃恒溫搖床中150 r/min孵育30 min，離心，PBS清洗3次，加入1 mL Anti-MNCs免疫磁珠(100 μg/mL)， 37℃振搖避光孵育30 min，制得碳量子點和免疫磁珠標記的HepG2細胞。

2.2.5微流控芯片上血液樣本中CTCs可視化檢測向500 μL血細胞懸液中加入按比例濃度稀釋獲得的10個HepG2細胞，按照2.2.4節(jié)的操作方法加入500 μL CQDs和Anti-MNCs免疫磁珠，制備得到后續(xù)CTCs檢測樣本。將微流控芯片d、e、f接口與微流控注射泵相連(圖2)，用無水乙醇、PBS緩沖液清洗通道， a接口通入2.2.4節(jié)的碳量子點和免疫磁珠標記的混合細胞混懸液，b和c接口通入實驗用PBS緩沖液，分別設置流速為30、40、50和 60 μL/min，在芯片通道中對流體流速進行優(yōu)化。

取500 μL CTCs樣本，在已優(yōu)化的流速條件下，按照上述實驗步驟，通過外加磁場在微流控芯片上進行分選富集，芯片富集區(qū)通過倒置熒光顯微鏡觀察捕獲的HepG2細胞個數(shù)，重復操作20次。

圖2 血細胞中HepG2細胞的MOFF分離-磁富集-熒光觀測芯片分析流程Fig.2 Analytical process of HepG2 in red blood cells on microfluidic chip with MOFF separation-magnetic enrichment-fluorescent detection

3 結果與討論

3.1微流控芯片上CTCs檢測策略

本實驗的芯片分析流程如圖2所示。首先，利用多孔流分離通道實現(xiàn)血液樣本中HepG2第一步分離，即在一系列的收縮/擴張微通道中，利用流體中微粒的慣性升力和動力變化誘導產(chǎn)生慣性力，并將其用于大小不一的球形微粒的連續(xù)分離，通過重復的收縮/擴張單元實現(xiàn)大量的血紅細胞分離。該過程可以避免細胞的損傷，還可避免不必要的非特異性沉積，實現(xiàn)快速分離。然后，對HepG2細胞進行碳量子點和免疫磁珠標記后，在芯片檢測區(qū)對進入的免疫磁珠標記的HepG2細胞進行第二步磁富集。芯片上檢測區(qū)與通道相比面積較大，能實現(xiàn)更多細胞的磁富集，當流體由較窄的多孔流分離通道到芯片富集區(qū)后，流體流速減慢，更有利于HepG2細胞在此區(qū)域被捕獲，并便于熒光顯微鏡觀測。

3.2碳量子點和免疫磁珠標記HepG2

碳量子點作為熒光納米顆粒對細胞進行標記，在實現(xiàn)細胞的檢測及成像方面具有很大的優(yōu)勢。碳量子點加入細胞溶液中，其會粘附在細胞表面，通過細胞對納米顆粒的胞吞作用，納米顆粒能夠進入細胞，從而實現(xiàn)細胞的熒光標記。實驗采用檸檬酸和硫脲為原料制備了粒徑在2～4 nm[14]范圍的碳量子點，對制備的碳量子點進行熒光測試(圖3A)，碳量子點在波長420～530 nm變化范圍內均有激發(fā)和發(fā)射現(xiàn)象，在430 nm波長處有最大激發(fā)，發(fā)射波長在520 nm，為綠色熒光。碳量子點標記細胞經(jīng)顯微鏡觀測，可見所制備的碳量子點具有良好的熒光效能，可滿足后續(xù)微流控芯片上熒光標記觀測HepG2細胞的要求(圖3B)。

實驗中HepG2細胞與免疫磁珠孵育30 min，免疫磁珠成功標記HepG2細胞，并可實現(xiàn)芯片上的磁捕獲(圖3C)。實驗中將碳量子點與免疫磁珠成功標記的HepG2細胞通過外磁場作用，在芯片檢測區(qū)進行捕獲，顯微鏡觀測，可見HepG2細胞明顯的富集現(xiàn)象(圖3D)。

圖3 (A) 不同激發(fā)波長下碳量子點的熒光發(fā)射光譜；(B) 碳量子點標記HepG2熒光顯微圖；(C) c-met免疫磁珠與肝癌HepG2細胞結合30 min顯微圖；(D) 碳量子點和免疫磁珠標記 HepG2細胞顯微圖Fig.3 (A) Fluorescence emission spectrum of carbon quantum dots (CQDs) at different excitation wavelength; (B) Fluorescence micrograph of CQDs labeled HepG2; (C) Image of HepG2 connected immunomagnetic beads at 30 min; (D) Micrograph of CQDs and c-met immunomagnetic beads labeled HepG2

3.3流速對分離效果的影響

實驗中設置進樣流速30 ～40 μL/min，此時合成樣本中的癌細胞和血紅細胞未被分離開，部分癌細胞在分離區(qū)末端進入e和f，被排出芯片外，造成腫瘤細胞的流失(圖2)，且在此流速下細胞易沉降；進樣流速為50 μL/min時，絕大多數(shù)血細胞從出口e和f被排出芯片外，HepG2細胞和少量血細胞進入富集區(qū)，因外加磁場作用HepG2細胞在此區(qū)域富集，而少量血細胞從出口d流出片外；流速為60 μL/min時，由于流速較大，磁捕獲區(qū)的HepG2細胞部分被沖走。因此，選擇最佳進樣流速為50 μL/min。圖4A為最佳進樣流速下血細胞及熒光標記的HepG2細胞的流向，大量血細胞在MOFF結構單元g區(qū)域被分離到e和f出口流出芯片外，而尺寸較大的HepG2細胞從h區(qū)域進入磁捕獲富集區(qū)。以上結果表明，設計的多功能芯片在進樣流速50 μL/min時能成功實現(xiàn)大量血細胞的分離。

圖4 (A) 混合細胞樣本進樣流速50 μL/min時g和 h區(qū)顯微成像圖;(B) 微流控芯片捕獲區(qū)HepG2細胞顯微圖Fig.4 (A) Micrographs of g, h areas when mixture sample introduction rate is 50 μL/min; (B) Micrograph of HepG2 on microfluidic chip capture area

3.4血液合成樣本中HepG2細胞的可視化分析

對血液合成樣本中HepG2細胞進行碳量子點和磁珠標記，在進樣流速50 μL/min條件下，對500 μL HepG2細胞-血細胞混合樣本(含10個碳量子點和磁珠標記的HepG2細胞)進行芯片上的分離和熒光顯微觀測。通過對芯片富集捕獲區(qū)HepG2細胞進行計數(shù)，從標記到可視化觀測僅需70 min。根據(jù)公式(1)計算出捕獲效率(CR)，細胞捕獲結果見表1。

CR(%)=N1/N×100

其中，N1為捕獲HepG2細胞個數(shù)；N為樣本中HepG2細胞個數(shù)。

采用碳量子點和免疫磁珠對HepG2細胞的標記，在進樣流速50 μL/min和外加磁場條件下，通過倒置熒光顯微鏡在芯片富集區(qū)可觀測到呈綠色熒光的HepG2細胞(圖4B)，對少量細胞進行數(shù)量統(tǒng)計，計算出樣本的捕獲效率為88.5%±6.7%(n=20)。此結果表明，所設計的MOFF分離-磁捕獲-原位熒光觀測微流控芯片可用于血液中微量腫瘤細胞的分離、富集及可視化觀測。

表1 微流控芯片上血細胞-HepG2合成樣本中HepG2捕獲結果

Table 1 Capture results of HepG2 from artificial sample of RBC-HepG2 on microfluidic chip

SamplevolumeBloodcellsHepG2cellsRecoveryFrequencyCapturerate(%)102Sample500μL5×1061091488．5±6．78371

4 結 論

設計了集細胞分離、磁捕獲及原位熒光觀測于一體的多功能微流控芯片，包含MOFF分離區(qū)和磁富集熒光檢測區(qū)。針對血細胞-HepG2混懸液樣本，通過流體流速優(yōu)化，在進樣流速為50 μL/min時，可以在芯片MOFF分離區(qū)分離除去大量血細胞，減少了其對HepG2細胞富集過程的干擾；在檢測區(qū)，利用外磁場對免疫磁珠標記的HepG2細胞進行二次富集。采用制備簡單、生物相容性好的碳量子點對HepG2細胞進行標記，實現(xiàn)了可視化觀測。通過倒置熒光顯微鏡，采用人工計數(shù)的方法對捕獲到的微量HepG2細胞進行了定量分析，樣本的捕獲效率達到88.5%±6.7% (n=20)。本方法集成了細胞的分離富集及熒光觀測，通過微流控芯片能對腫瘤細胞-血細胞樣本進行分析檢測，為CTCs臨床快速檢測提供基礎。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21375156), the National High Technology Research and Development Program of China (863 program) (No. 2015AA021104), the Frontier Research Key Projects of Chongqing Science and Technology Committee, China (No. cstc2015jcyjBX0010), and the Scientific and Technical Innovation Projects for People's Livelihood of Chongqing Science and Technology Committee, China (No. cstc2015shmszx00014).

DetectionofHepG2CellsinArtificialSamplesbyMultifunctionalMicrofluidicChip

ZHANG Ze-Jie2,4, SU Xi1,2,4, XU Yi*1,2,3,4, CHEN Li*1,3,4
(KeyDisciplinesLabofNovelMicro-nanoDevicesandSystemTechnology1,SchoolofChemistryandChemicalEngineering2,SchoolofOptoelectronicEngineering,ResearchCenterofMicrosystem3,InternationalR&DcenterofMicro-nanoSystemsandNewMaterialsTechnology4,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China)

A multi-functional microfluidic chip with multi-orifice flow fractionation (MOFF) and magnetic capture technique was developed to specifically separate and capture the HepG2 cells in artificial samples. The chip contained a glass substrate and a polydimethylsiloxane (PDMS) microchannel cover plate. The PDMS cover plate consisted of 3 injection channels of 10-mm-long, a MOFF separation zone and a hexagonal cavity cell enrichment-detection zone. Among which, the MOFF separation zone had a total length of 20 mm and was consisted of 80 semi-rhombic shrinkage/expansion units with a length of 0.18 mm, a depth of 50 μm, a shrinkage area width of 0.06 mm, and an expansion area of 0.20 mm. The angle between each group of shrinkage/expansion units was 103.0°. In this experiment, HepG2-blood cell suspension was used as the sample. Based on the principle that the magnetic bead surface-modifiedc-Met antibody could specifically bind to HepG2 cells, an immunomagnetic bead (Anti-MNCs) suspension at a concentration of 50 μg/mL was prepared by surface carboxylated beads, EDC (1 mg/mL), NHS (1 mg/mL) andc-Met antibody. Under the optimized flow rate (50 μL/min), a few HepG2 in suspension samples were efficiently captured at the detection zone of chip via a magnetic field; the carbon quantum dots were prepared by microwave heating with citric acid and thiourea to label HepG2 cells which achieved in-situ fluorescence visualization of captured HepG2. Cells captured in the chip detection area were counted by microscope. The capture rate of HepG2 cells was 88.5%±6.7% (106blood cells and 10 HepG2 cells per 500 μL). The results demonstrated that the developed multifunctional microfluidic chip may serve as a promising tool for separation and capture of tumour cells.

Microfluidic chip; Multi-orifice flow fractionation; Magnetic capture; Fluorescence visualization; HepG2

13 July 2017; accepted 6 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.171092