陳博陽，周果，師丹陽，周曉巍，余云舟

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071

B型肉毒毒素重組Hc亞單位疫苗的免疫原性研究

陳博陽，周果，師丹陽，周曉巍，余云舟

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071

目的：用大腸桿菌表達重組B型肉毒毒素受體結合區(qū)Hc抗原（BHc）作為亞單位疫苗，并研究其免疫原性。方法：構建pTIG-Trx-BHc原核表達載體，用大腸桿菌表達并純化重組BHc抗原；免疫BALB/c小鼠以研究它的免疫原性。結果：大腸桿菌表達并純化獲得了重組BHc抗原，免疫小鼠后能刺激機體產生高效價的抗BHc抗體和保護性免疫反應。該重組BHc亞單位疫苗1μg劑量2次免疫小鼠即可產生對104LD50劑量B型肉毒毒素攻毒的完全保護，血清中和效價可達1.33 IU/mL。結論：大腸桿菌表達的重組BHc抗原具有良好的免疫原性，能夠有效地保護小鼠抵抗B型肉毒毒素的攻擊，該BHc抗原能夠作為亞單位候選疫苗預防B型肉毒毒素中毒。

B型肉毒毒素；重鏈受體結合區(qū)C端片段（Hc）；重組亞單位疫苗；免疫原性

肉毒毒素（botulinum neurotoxins，BoNT），又被稱為肉毒神經毒素，是由厭氧的革蘭陽性菌肉毒梭菌（Clostridium botulinum）產生的毒素蛋白，是已知毒性最強的蛋白質，按血清型分為A～G共7個亞型，其中A、B、E和F型可以導致人類肉毒中毒[1-3]。各亞型肉毒毒素都是具有類似結構的蛋白質，如具有內肽酶活性，相對分子質量（Mr）約150 000，由一條重鏈（HC，Mr約 100 000）和一條輕鏈（LC，Mr約50 000）通過二硫鍵相連[4-5]。對肉毒毒素晶體結構的分析表明，重鏈包含一個細胞受體結合域（HC，負責結合細胞表面的受體）和一個跨膜轉運結構域（HN，負責將毒素轉運到神經細胞內）；輕鏈能夠靶向到可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethyl?maleimide sensitive factorattachmentprotein re?ceptor，SNARE），LC將SNARE切割會抑制神經遞質小泡傳遞，從而抑制神經遞質進行信號傳導，導致肌肉松弛性麻痹[6-8]。

疫苗是預防肉毒毒素中毒最好的方法，早期的肉毒毒素疫苗研究主要集中在類毒素疫苗，然而后期的研究與應用發(fā)現(xiàn)類毒素疫苗在免疫原性、安全性、免疫后副作用等方面存在較大的問題，導致類毒素疫苗一直未能得到廣泛使用。破傷風毒素（tetanus neurotoxin，TeNT）和肉毒毒素具有很多相似的結構，因此，研究人員借助于破傷風毒素Hc（重鏈受體結合區(qū)C端片段，C-termi?nal fragment of heavy-chain receptor）片段亞單位疫苗研究成功的策略來研制肉毒毒素亞單位疫苗[7]。肉毒毒素的Hc片段能介導毒素特異性結合到神經肌肉接點處的神經末梢，此外，Hc片段不存在鋅肽鏈內切酶活性，沒有毒性，免疫動物后能刺激產生保護性免疫反應[9-11]?；谶@一重要發(fā)現(xiàn)，人們開始研究更為安全的Hc片段作為新一代的肉毒毒素疫苗[12]。

肉毒毒素Hc片段能夠刺激機體產生很強的保護性免疫反應，其作為新型亞單位疫苗非常具有研究價值及應用前景。Holley等[13]用大腸桿菌表達的F型肉毒毒素Hc片段免疫小鼠，證明能夠產生保護性免疫反應，并且能維持長期保護作用，疫苗接種10個月后對104LD50的BoNT/F仍具有保護作用。Liu等[14]利用酵母表達純化制備了B型肉毒毒素受體結合區(qū)Hc，免疫動物證明其具有良好的免疫原性，能夠刺激機體產生有效的保護性免疫反應。此外，本實驗室也利用大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達了A、E和F型肉毒毒素受體結合區(qū)Hc，并且得到純度很高的蛋白，免疫小鼠后能夠產生十分強大的保護性免疫反應[15-16]。以上研究結果表明大腸桿菌表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)各型肉毒毒素受體結合區(qū)Hc片段的高效表達，使得以大腸桿菌表達的重組Hc片段作為新型肉毒毒素亞單位疫苗成為可能。在本研究中，我們利用大腸桿菌BL21（DE3）菌株實現(xiàn)了B型肉毒毒素受體結合區(qū)Hc片段的可溶性表達，并且得到了純度較高的重組BHc片段蛋白，通過免疫小鼠，初步評價了該原核表達的BHc的免疫原性和保護效果，為進一步研究肉毒毒素亞單位疫苗和研制多價肉毒毒素疫苗奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c和KM小鼠（SPF級）購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心；pABE293-BHc載體（含B型肉毒毒素受體結合區(qū)Hc片段基因）和pTIG-Trx原核表達載體由本實驗室保存；大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞和DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶購自NEB公司；DNA聚合酶Prime STAR和T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒購自OMEGA公司；羊抗鼠IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術有限公司；羊抗鼠IgG1/IgG2a/IgG2b/IgG3/IgM-HRP購自Santa Cruz公司；IPTG購自Promega公司；Western印跡顯色試劑盒購自Thermo公司；96孔酶聯(lián)板購自Coring公司；引物合成、基因測序由上海生工生物工程股份有限公司完成；其他試劑均為國產分析純產品。

1.2 原核表達載體的構建

以pABE293-BHc載體為模板，PCR擴增得到BHc基因片段，擴增時在片段兩端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，瓊脂糖凝膠電泳后純化回收目的DNA片段。將BHc基因片段和pTIG-Trx載體雙酶切，瓊脂糖電泳后用DNA純化回收試劑盒純化回收，回收產物經T4DNA連接酶于4℃連接過夜，然后轉化大腸桿菌Top10，次日挑取單克隆菌落培養(yǎng)并抽提質粒酶切鑒定，選取陽性克隆測序驗證。

1.3 重組BHc片段的表達和純化

首先將測序驗證序列正確的質粒轉化（42℃，45s）大腸桿菌表達菌株 BL21（DE3），挑取單克隆于 5mL 2×YT培養(yǎng)基（含 100μg/mL氨芐西林）中，37℃搖床（220r/min）培養(yǎng)至菌液D600nm為0.6～1.0，按 1％的比例轉接至 400mL 2×YT培養(yǎng)基（含100μg/mL氨芐西林）中，37℃搖床（220r/min）培養(yǎng)至菌液 D600nm為 0.6～1.0，加入0.2mmol/L IPTG誘導表達（30℃表達4～5h），8000r/min離心30min收集菌體沉淀，用20mmol/L的PB緩沖液（pH8.0）重懸菌體，用超聲細胞粉碎儀對菌懸液在冰水浴條件下進行超聲波破碎，超聲完全后10000r/min離心20min，收集上清用0.45μm的濾膜過濾，過濾后的上清和HisTrap HP蛋白純化柱（GE公司）結合，之后用A液（20mmol/L PB緩沖液，pH8.0）平衡，然后用不同濃度的B液（20mmol/L PB緩沖液，500mmol/L咪唑，pH8.0）洗脫并收集蛋白，SDS-PAGE檢測純化結果。

1.4 Western印跡檢測目的蛋白

純化后的目的蛋白經SDS-PAGE初步鑒定后，用Western印跡進一步鑒定。目的蛋白電泳結束后，按照下層濾紙、PVDF膜、膠、上層濾紙的順序依次置于轉膜儀上，將目的蛋白轉移至PVDF膜（600 mA，25min），用5％脫脂牛奶室溫封閉2h，一抗（抗BHc血清抗體）1∶1000稀釋室溫孵育 2h，TBS-T（8.0g/L NaCl，0.2g/L KCl，3.0g/L Tris，0.1％Tween-20，pH7.4）洗膜，二抗（羊抗鼠IgG-HRP）1∶5000稀釋室溫孵育30min，TBS-T洗膜，用Western印跡顯色液在成像儀中曝光顯影。

1.5 重組亞單位疫苗免疫動物

6～8周齡的SPF級雌性BALB/c小鼠隨機分成3組，即 10μg組、1μg組和陰性對照組，每組 10只。將重組BHc亞單位疫苗用無菌PBS分別稀釋至100和10μg/mL，并在配制疫苗時加入1/10體積的鋁佐劑（10 mg/mL），采用肌內注射方式，注射體積100μL。免疫2周后剪尾采血，分離血清用于抗體免疫反應檢測，之后進行加強免疫，免疫方案不變。

1.6 重組亞單位疫苗免疫后抗體水平、滴度和亞型測定

用原核表達的BHc抗原包被96孔酶聯(lián)板，碳酸鹽包被緩沖液稀釋抗原使其濃度為2μg/mL，每孔加入100μL，4℃過夜；用 0.01mmol/L 的PBS-T（8.0g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L 無水Na2HPO4，0.24 g/L KH2PO4，0.05％ Tween-20，pH7.4）洗板6次；每孔加入200μL 2％的BSA封閉液在37℃恒溫箱中孵育2h；每孔加入100μL 1∶100稀釋的小鼠血清（測定抗體滴度和亞型的血清先1∶100稀釋，然后1/4梯度稀釋），37℃恒溫箱中孵育2h；用PBS-T洗板6次，加入1∶2000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP（或羊抗鼠IgG1/IgG2a/IgG2b/IgG3/IgM-HRP），37℃恒溫箱中孵育30min；用PBS-T洗板6次，加入新配制的ELISA顯色液（240mmol/L檸檬酸，50mmol/L Na2HPO4，0.4 mg/mL OPD，0.1％的 H2O2）50μL/孔，避光顯色 10min左右；加入終止液（2 mol/L H2SO4）50μL/孔終止顯色，用酶標儀讀取D492nm/D630nm值。終末稀釋ELISA法計算小鼠血清中能特異性和BHc結合的抗體滴度，以D492nm≥0.3為陽性結果，免疫組小鼠血清抗體水平以單個血清樣品的平均值來表示。

1.7 免疫后小鼠血清中和活性和中和效價測定

將毒素稀釋至100 LD50/mL，每管加入1mL（每組5管），然后再依次加入不同劑量的2次免疫后的小鼠血清，最后用稀釋液補齊至終體積為2.5mL，將毒素和抗體混合均勻，于37℃溫箱中孵育15min，使毒素和抗體充分反應，然后對KM小鼠進行腹腔注射，每組4只小鼠，每只注射500μL，注射12h后觀察小鼠存活情況，每隔24h觀察一次，共觀察1周。

1.8 B型肉毒毒素保護性試驗

對2次免疫2周后的小鼠分別用103和104LD50的B型肉毒毒素攻擊。將毒素稀釋到2×103LD50/mL或2×104LD50/mL濃度，然后每只小鼠注射500μL，攻毒12h后觀察小鼠存活情況，每隔24h觀察一次，共觀察1周，計算最終的小鼠存活率。

1.9 統(tǒng)計學分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件處理實驗數(shù)據(jù)，實驗結果以x±s表示，以單因素方差進行統(tǒng)計分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異，對于配對實驗采用Stu?dent-t檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 pTIG-Trx-BHc表達載體的構建

利用PCR從pABE293-BHc載體上擴增全長的BHc基因（1317bp），并在兩端加入多克隆位點BamHⅠ和XhoⅠ。構建完成后提取質粒進行酶切鑒定（圖1），對鑒定正確的載體測序驗證，結果證實構建的抗原序列與預期一致。

2.2 重組BHc片段在大腸桿菌的表達與純化

將pTIG-Trx-BHc表達載體轉化原核表達菌株BL21（DE3），經IPTG誘導表達后用超聲波細胞粉碎儀對菌體沉淀進行破碎，然后離心取上清進行SDS-PAGE檢測蛋白表達，結果如圖2，表達的目的蛋白BHc主要以可溶性方式存在于破菌上清中，Mr約為50 000，而空載體的破菌上清在同樣位置未出現(xiàn)表達條帶，說明誘導表達的產物為特異性表達。用HisTrap HP蛋白純化柱對重組BHc蛋白進行純化，經SDS-PAGE檢測（圖2），純化到的目的蛋白大小正確，純度達電泳級。West?ern印跡檢測（圖2）證實該重組BHc能特異性和抗BHc血清抗體結合，具有特異的結合活性。

圖2 目的蛋白表達后的SDS-PAGE和Western印跡鑒定圖

2.3 重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應的測定

通過ELISA測定小鼠免疫后的體液免疫反應，結果如圖3。雖然2組小鼠在初次免疫后產生的抗體水平都相對不高，且無明顯差異（P＞0.05），但加強免疫后抗體水平迅速增強，10μg組和1μg組的抗體水平相對于初次免疫有很明顯的提高，抗體水平差異明顯（P＜0.001）；此外，10μg組加強免疫后的抗體水平相對于1μg組也具有較大的差異（P＜0.05）。抗體滴度測定結果表明（圖4），初次免疫后10μg組和1μg組的血清抗體滴度均較低，加強免疫后抗體滴度明顯增強，平均抗體滴度分別為1∶110 000和1∶80 000，最高抗體滴度可達1∶150 000左右，相對于初次免疫明顯增強（P＜0.001），而且免疫10μg組的抗體滴度相對于免疫1μg組也有較大的增強（P＜0.05）。這些結果初步表明該原核表達的抗原BHc具有良好的免疫原性，作為亞單位疫苗免疫能刺激小鼠免疫系統(tǒng)產生特異性的免疫反應，并且在加強免疫后抗體滴度達到很高的水平，而這種特異性抗體的產生在對B型肉毒毒素的保護過程中起著至關重要的作用。

圖3 重組亞單位疫苗免疫小鼠后產生特異性抗體水平

圖4 重組亞單位疫苗免疫小鼠后的抗體滴度

對免疫后小鼠產生的抗體亞類的測定結果表明（圖5），小鼠產生的特異性抗體主要為IgG1，同時也有較多的IgG2b，IgG2a的數(shù)量極少，IgG1/IgG2a的比值可達20，證明疫苗免疫后產生的抗體主要來源于Th2型免疫應答途徑。

2.4 小鼠血清的中和抗體活性和中和效價檢測

小鼠血清中和抗體測定結果表明10μg組和1μg組血清均可對小鼠產生保護作用，而陰性對照組小鼠無一幸存，證明該重組亞單位疫苗免疫小鼠后產生的抗體具有較強的中和活性，能夠中和B型肉毒毒素的毒性。通過對中和實驗的結果估算，10μg組和1μg組小鼠血清的中和效價分別為3.33和1.33 IU/mL（表1）。

2.5 重組亞單位疫苗免疫小鼠后對BoNT/B的保護作用

用B型肉毒毒素對2次免疫后的小鼠進行103LD50劑量攻擊，結果表明（表1）10μg和1μg劑量免疫后均能夠完全保護，提高攻毒劑量至104LD50后仍能夠完全保護。這些結果表明該原核表達純化的重組BHc亞單位疫苗具有良好的免疫原性和保護效果，可以作為候選疫苗進行更深層次的研究，尤其是為多價肉毒毒素疫苗的研制奠定了基礎。

3 討論

肉毒毒素受體結合區(qū)Hc片段能特異性結合到神經肌肉接點處的神經末梢細胞膜上，然后在HN片段的作用下將毒素轉運到胞內發(fā)揮作用。此外，Hc片段不存在鋅肽鏈內切酶活性，沒有毒性，免疫動物后能刺激產生保護性免疫反應[9-11]?；谶@些研究背景，以肉毒毒素受體結合區(qū)Hc為靶標研制新型肉毒毒素亞單位疫苗，成為肉毒毒素疫苗研制的新方向。因此，科研人員開始研究用大腸桿菌或酵母表達肉毒毒素受體結合區(qū)Hc片段。雖然利用酵母表達系統(tǒng)提高了可溶性蛋白的表達量，并且分泌性表達可降低純化難度，但原核表達系統(tǒng)相對于酵母表達系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢，如表達工藝簡單、成本低廉。最重要的還有免疫原性的差異，酵母屬于真核生物，能夠對翻譯后的抗原進行糖基化修飾，糖基化抗原的免疫原性會降低；而大腸桿菌表達產物則不存在糖基化修飾，且其表達產物和肉毒梭菌一致，同為原核表達產物，可能更接近天然的表達產物的構象[14,17-18]。因此，為了獲得更為有效的B型肉毒毒素亞單位疫苗，我們更傾向于對大腸桿菌表達的重組BHc片段進行研究，提高可溶性蛋白的表達量及免疫原性。

表1 重組亞單位疫苗免疫小鼠2次后保護性試驗和中和效價測定

圖5 重組亞單位疫苗免疫小鼠后抗體亞型測定

在本研究中，利用基因工程技術構建了能表達B型肉毒毒素受體結合區(qū)Hc片段的原核表達載體pTIG-Trx-BHc，并且實現(xiàn)了BHc在大腸桿菌中的可溶性表達，通過HisTrap HP蛋白純化柱純化到了純度較高、穩(wěn)定性良好的重組BHc抗原。通過Western印跡對純化的蛋白進行鑒定，結果表明抗BHc血清抗體能特異性地結合該重組BHc片段蛋白，提示該蛋白可能具有天然的B型肉毒毒素受體結合區(qū)構象。通過免疫小鼠實驗進一步研究該原核表達的BHc的免疫原性，結果表明該重組BHc亞單位疫苗免疫小鼠后能刺激機體產生良好的抗體反應，最高滴度達1∶150 000，且其血清中的抗體具有良好的中和活性，中和效價可達3.33 IU/mL。攻毒試驗也證明該重組BHc亞單位疫苗具有十分強大的保護效果，1μg劑量免疫2次就能對104LD50的B型肉毒毒素產生完全保護作用?？贵w亞型測定結果表明，該重組BHc亞單位疫苗刺激機體產生的抗體主要以IgG1和IgG2b為主，IgG2a含量極少，證明疫苗免疫后產生的抗體主要來源于Th2型免疫應答途徑，Th2型免疫應答主要刺激機體的B細胞產生抗體，這種以Th2型免疫應答為主的特點能夠產生較多的有效抗體，在抵抗毒素的攻擊過程中具有極其重要的意義。后續(xù)，還要對該重組BHc亞單位疫苗進行深入研究，以獲取更為詳盡的數(shù)據(jù)，為B型肉毒毒素亞單位疫苗的研制提供可靠依據(jù)。同時，本研究也為肉毒毒素多價疫苗的研制奠定了基礎。

[1] Smith L A,Rusnak J M.Botulinum neurotoxin vac?cines:past,present,and future[J].Crit Rev Immunol,2007,27（4）:303-318.

[2] Dembek Z F,Smith L A,Rusnak J M.Botulism:cause,effects,diagnosis,clinical and laboratory identi?fication,and treatment modalities[J].Disaster Med Pub?lic Health Prep,2007,1（2）:122-134.

[3] Schiavo G,Matteoli M,Montecucco C.Neurotoxins af?fecting neuroexocytosis[J].Physiol Rev,2000,80（2）:717.

[4] Smith L A,Barrett A D T,Lu S,et al.Botulism and vaccines forits prevention[J].Vaccine,2009,27（47）:D33-D39.

[5] Turton K,Chaddock J A,Acharya K R.Botulinum and tetanus neurotoxins:structure,function and thera?peutic utility[J].Trends Biochem Sci,2002,27（11）:552-558.

[6] Shukla H D,Sharma S K.Clostridium botulinum:a bug with beauty and weapon[J].Crit Rev Microbiol,2005,31（1）:11.

[7] Matak I,Lackovic'Z.Botulinum toxin A,brain and pain[J].Prog Neurobiol,2014,119-120（5）:39-59.

[8] Rummel A,Bade S,Alves J,et al.Two carbohydrate binding sites in the H（CC）-domain of tetanus neurotox?in are required for toxicity[J].J Mol Biol,2003,326（3）:835-847.

[9] Lapenotiere H F,Clayton M A,Middlebrook J L.Ex?pression of alarge,nontoxicfragment of botulinum neurotoxin serotype A and its use as an immunogen[J].Toxicon,1995,33（10）:1383.

[10]Atassi M Z.Basic immunological aspects of botulinum toxin therapy[J].Mov Disord,2004,19（S8）:S68.

[11]Villaflores O B,Hsei C M,Teng C Y,et al.Easy ex?pression of the C-terminal heavy chain domain of bot?ulinum neurotoxin serotype A as a vaccine candidate using a bi-cistronic baculovirus system[J].J Virol Methods,2013,189（1）:58.

[12]Keller J E.Characterization of new formalin-detoxified botulinum neurotoxin toxoids[J].Clin Vaccine Immu?nol,2008,15（15）:1374-1379.

[13]Holley J L,Elmore M,Mauchline M,et al.Cloning,expression and evaluation of a recombinant sub-unit vaccine againstClostridium botulinum,type F toxin[J].Vaccine,2000,19（2-3）:288-297.

[14]Liu B,Shi D Y,Chang S H,et al.Characterization and immunological activity of different forms of recom?binant secreted Hc of botulinum neurotoxin serotype B products expressed in yeast[J].Sci Rep,2015,5（13）:7678.

[15]Yu Y Z,Li N,Zhu H Q,et al.The recombinant Hc subunit of Clostridium botulinum,neurotoxin serotype A is an effective botulism vaccine candidate[J].Vac?cine,2009,27（21）:2816-2822.

[16]Yu Y Z,Zhang S M,Ma Y,et al.Development and evaluation of candidate vaccine and antitoxin against botulinum neurotoxin serotype F[J]. Clin Immunol,2010,137（2）:271-280.

[17]Moreira G M,Cunha C E,Salvarani F M,et al.Pro?duction of recombinant botulism antigens:a review of expression systems[J].Anaerobe,2014,28:130-136.

[18]Gurkan C,Ellar D J.Recombinant production of bacte?rial toxins and their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Microb Cell Fact,2005,4（1）:33.

Study on the Immunogenicity of Recombinant Hc Subunit Vaccine of Botulinum Neurotoxin Serotype B

CHEN Bo-Yang,ZHOU Guo,SHI Dan-Yang,ZHOU Xiao-Wei*,YU Yun-Zhou*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China
*Co-corresponding authors,YU Yun-Zhou,E-mail:yunzhouyu@163.com;ZHOU Xiao-Wei,E-mail:amms832@126.com

Objective:The recombinant Hc domain antigen of botulinum neurotoxin serotype B（BoNT/B） was ex?pressed in Escherichia coli as a subunit vaccine,and its immunogenicity was studied.Methods:The prokaryotic expression vector pTIG-Trx-BHc was constructed,recombinant antigen BHc was expressed in E.coli and purified.BALB/c mice were immunized to study its immunogenicity.Results:The recombinant BHc antigen protein was suc?cessfully expressed and purified from E.coli and could stimulate the body to produce high titers of anti-BHc anti?bodies,and induce protective immune responses in immunized mice.The recombinant BHc subunit vaccine provid?ed complete protection against challenge with 104LD50of BoNT/B only after 1μg of two doses immunization,and serum neutralization titers reached 1.33 IU/mL.Conclusion:These findings suggest that the recombinant BHc anti?gen expressed in E.coli is efficacious in protecting mice against challenge with BoNT/B and that the recombinant BHc subunit vaccine may be a subunit candidate vaccine for prophylaxis against BoNT/B.

botulinum neurotoxin serotype B;C-terminal fragment of heavy-chain receptor（Hc）;recombinant subunit vaccine;immunogenicity

R392.1;Q78

A

1009-0002（2017）04-0435-06

2017-03-09

陳博陽（1991- ），男，碩士研究生，（E-mail）chenboyang1991@163.com

余云舟，（E-mail）yunzhouyu@163.com；周曉巍，（E-mail）amms832@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.006