葉華虎,陳建宇,2,周小軍,王進(jìn),代艷艷,韓宇,劉珩,袁菊芳
1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,北京 100071;2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021
偽狂犬病病毒單克隆抗體制備及特征分析
葉華虎1,陳建宇1,2,周小軍1,王進(jìn)1,代艷艷1,韓宇1,劉珩1,袁菊芳1
1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,北京 100071;2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021
目的:制備偽狂犬病病毒(PRV)單克隆抗體,為PVR防控奠定基礎(chǔ)。方法:用PRV疫苗毒株Bartha-k61免疫小鼠,取免疫小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞并制備腹水,用病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體(腹水)對(duì)PRV的中和作用。結(jié)果:通過細(xì)胞融合,共得到11株針對(duì)PRV的雜交瘤細(xì)胞。中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無(wú)論是對(duì)于PRV弱毒株Bartha-k61還是強(qiáng)毒株AV25,2株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腹水都表現(xiàn)為明顯的中和效應(yīng);但2株單抗的中和能力不同,其中1株雜交瘤細(xì)胞腹水的中和效價(jià)為1∶16~1∶32,另1株的效價(jià)為1∶4。交叉反應(yīng)顯示,11株單克隆抗體中,2株與單純性皰疹病毒存在明顯的免疫反應(yīng),1株與猴B病毒的gD蛋白存在明顯交叉反應(yīng)。結(jié)論:制備了PRV的單克隆抗體,并獲得了對(duì)PRV具有中和作用的單克隆抗體,以及能與其他皰疹病毒交叉反應(yīng)的單克隆抗體。
偽狂犬病病毒;單克隆抗體;中和抗體;交叉反應(yīng)
偽狂犬?。╬seudorabies,PR),又稱 Aujeszky病,是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種豬的急性、傳染性疾病,主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙、發(fā)熱,以及仔豬急性死亡等癥狀。其中,仔豬的病死率極高,最高可達(dá)100%。除豬外,PRV也同樣能感染牛、羊等多種家畜以及家禽和野生動(dòng)物等,發(fā)病動(dòng)物表現(xiàn)為急性傳染性疾病特征[1-3]。
偽狂犬病的臨床診斷并不復(fù)雜,通過典型臨床癥狀及流行病學(xué)特征即可確認(rèn)。雖然近年來隨著疾病的持續(xù)發(fā)生,臨床表現(xiàn)向非典型轉(zhuǎn)化,但ELISA診斷試劑、膠體金試紙條、間接免疫熒光及分子診斷(主要是PCR)等方法的先后建立[4-6],極大地提高了疾病診斷的準(zhǔn)確性。
但是,PRV的治療目前仍是世界性難題。在世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家,通過疫苗免疫接種、母豬野毒感染監(jiān)測(cè)和凈化,使該病得到了有效控制。而我國(guó),盡管免疫接種受到高度重視并廣泛實(shí)施,但由于免疫接種時(shí)機(jī)、持續(xù)監(jiān)測(cè)手段、設(shè)施布局及飼養(yǎng)管理水平等原因,PRV時(shí)有發(fā)生甚至暴發(fā),特別是自2011年以來,PRV在全國(guó)規(guī)?;i場(chǎng)再次大面積暴發(fā),由此引起的仔豬高死亡率給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]??梢姡行У腜RV治療手段仍是我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)。
業(yè)已證實(shí),中和抗體是PRV感染動(dòng)物治療的特效藥物。國(guó)外已有中和抗體的制備及研究報(bào)道[8],國(guó)內(nèi)學(xué)者針對(duì)PRV及其不同分子的抗體研究也開展了大量工作,如相繼得到針對(duì)PRV的gB、gE、gD等分子的單克隆抗體,被證實(shí)可能用于病毒檢測(cè)[9];孟日增等利用超濃縮PRV通過免疫家兔制備的高效價(jià)多抗,被證實(shí)對(duì)病毒具有中和作用,且中和效價(jià)約為1∶16[10]。
但影響抗血清制備的因素很多,因而難以保證批次間的中和效果。我們以當(dāng)前應(yīng)用最廣的疫苗用PRV弱毒株Bartha-k61免疫小鼠,制備單克隆抗體,期望獲得廣譜的PRV中和抗體,為PRV防控提供新途徑。
BALB/c小鼠為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn);SP2/0細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、單純性皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)HSV-1和HSV-2為本室保存;PRV Bartha-k61株由北京市農(nóng)林科學(xué)院李永清教授惠贈(zèng);PRV強(qiáng)毒株AV25購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)測(cè)所;HAT培養(yǎng)基、HT、PEG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等購(gòu)于Sigma公司;RPMI-1640、DMEM/F12(1∶1,簡(jiǎn)稱 DF)培養(yǎng)基,胎牛血清,青霉素,鏈霉素等購(gòu)于Gibco公司;高結(jié)合能力酶標(biāo)板購(gòu)于Nunc公司;羊抗鼠IgG標(biāo)記抗體購(gòu)于康為生物試劑公司;TMB單組分顯色液購(gòu)于湖州英創(chuàng)生物技術(shù)公司。
將Bartha-k61接種于BHK-21細(xì)胞,待細(xì)胞完全病變后,將其凍融3次,高速離心(12 000r/min)收集細(xì)胞上清,然后超高速離心(11 000×g)濃縮病毒,最后通過蔗糖密度梯度離心進(jìn)一步純化病毒。
將弗氏完全佐劑與Bartha-k61充分混合均勻并形成油乳劑,分點(diǎn)皮下注射于3只3~4周齡BALB/c小鼠(100μL/只);2周后,用相同劑量的病毒與弗氏不完全佐劑混勻進(jìn)行加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫共2次;最后一次加強(qiáng)免疫7d后,采鼠尾血檢測(cè)血清抗體效價(jià);選擇效價(jià)≥1∶12 000(ELISA)的小鼠直接腹腔注射同等劑量的病毒,3d后無(wú)菌取小鼠脾臟,用于細(xì)胞融合。
無(wú)菌條件下取小鼠脾臟并去脂,用無(wú)菌生理鹽水和RPMI-1640分別洗滌;將脾臟放入滅菌的200目濾網(wǎng),用注射器芯擠壓釋放其中的脾淋巴細(xì)胞;加入5mL RPMI-1640洗滌濾網(wǎng),過濾后的脾細(xì)胞用巴斯吸管輕輕吹打,加入30mL RPMI-1640,1200r/min離心;收集培養(yǎng)好的SP2/0細(xì)胞,用RPMI-1640培養(yǎng)基1200r/min離心洗滌1次;將2種細(xì)胞(比例為1∶3~1∶6)混合,加入RPMI-1640到30mL,1200r/min離心6min洗滌2次,棄上清;在臺(tái)面上輕輕敲打細(xì)胞沉淀使其混勻;采用滴加方式緩慢加入1mL PEG(邊加邊混勻),最后在約5min內(nèi)輕緩加入預(yù)熱的RPMI-1640培養(yǎng)基29mL;800r/min離心6min,棄上清;加入含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基約50mL,用巴斯吸管輕輕吹打混勻,制備鋪板。
鋪板前2d無(wú)菌收集小鼠腹腔細(xì)胞,制備滋養(yǎng)層細(xì)胞;將融合處理的細(xì)胞加入滋養(yǎng)層細(xì)胞中,每孔 100μL;第 2d加 5×HAT 培養(yǎng)基 50μL(用含20%FBS的RPMI-1640配制),繼續(xù)培養(yǎng)2~3d;采用半換量加入HT/HAT(1∶1)培養(yǎng)基(用含20%FBS的 RPMI-1640配制,0.5×HAT和 0.5×HT);2~3周后,用含 20%FBS和 1×HT的 RPMI-1640培養(yǎng)基換液,直到雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)出;待雜交瘤細(xì)胞鋪滿孔的一半及以上時(shí),取上清用于ELI?SA檢測(cè)。
超濃縮的Bartha-k61用碳酸鹽緩沖液(CBS,pH9.6)稀釋至 1/100并包被,每孔 100μL,4℃過夜;酶標(biāo)板用含0.5%BSA、0.2%水解酪蛋白的PBS封閉1h;加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清100μL,37℃孵育40min,PBST洗滌3次,5min/次;加入1∶5000稀釋的HRP山羊抗小鼠IgG(以含0.5%BSA 的 PBST稀釋)每孔 100μL,37℃孵育 35min,PBST 洗滌 3次,5min/次;加入單組分 TMB液100μL,37℃避光15min;最后加入終止液(2 mol/L H2SO4)50μL,在測(cè)量波長(zhǎng)為 450nm、參比波長(zhǎng)為620nm下測(cè)定D值,D值大于3倍陰性對(duì)照平均值為閾值,篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。
根據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果,取D值最高的24個(gè)孔中的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿一半以上時(shí)繼續(xù)進(jìn)行ELSIA檢測(cè)。對(duì)D值高的細(xì)胞進(jìn)行無(wú)限稀釋,接種于96孔板,待單克隆長(zhǎng)出后檢測(cè)。對(duì)來源于最初孔的細(xì)胞,每個(gè)挑選1個(gè)單克隆且D值高的細(xì)胞通過24孔板、6孔板和25mL培養(yǎng)瓶逐級(jí)放大培養(yǎng),用于生產(chǎn)腹水。
給6~8周齡以上的BALB/c雌性小鼠腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL/只,12~15d后腹腔接種雜交瘤細(xì)胞 1×106~2×106/只,收集腹水。
對(duì)腹水進(jìn)行總蛋白測(cè)定,用PBS調(diào)整蛋白濃度為2.5 mg/mL;用含3%FBS及PRV為100倍TCID50的DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行系列稀釋,37℃孵育1h;將處理好的病毒-抗體液加入BHK-21細(xì)胞鋪板的96孔板,每個(gè)稀釋度4個(gè)復(fù)孔,每24h觀察記錄細(xì)胞病變。以抗犬細(xì)小病毒(canine parvoviurs,CPV)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體(腹水)為對(duì)照。
用前述病毒制備方法獲得的HSV-1和HSV-2濃縮液,以及實(shí)驗(yàn)室前期純化的猴B病毒(B vi?rus,BV)gD重組蛋白包板,對(duì)8株單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)(方法同前),了解PRV單克隆抗體與同源病毒(或分子)的交叉反應(yīng)性。
將PRV免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后,接種于5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,經(jīng)篩選培養(yǎng),共有136個(gè)孔長(zhǎng)出了雜交瘤細(xì)胞;ELISA結(jié)果顯示,87個(gè)孔中的細(xì)胞上清都與PRV有明顯的抗原-抗體反應(yīng),但各孔的D值存在明顯差異,說明其中的抗體量不同。
根據(jù)細(xì)胞密度及ELISA所測(cè)D值,實(shí)驗(yàn)選取了24個(gè)高抗體分泌量的細(xì)胞進(jìn)行單克隆化。即先將其轉(zhuǎn)入24孔板培養(yǎng),同時(shí)對(duì)上清進(jìn)行檢測(cè),其后將穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞通過有限稀釋法接種于96孔板,進(jìn)行單克隆化。最后,從最初來源的各個(gè)孔中,每種細(xì)胞挑選1個(gè)單克隆化且穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)、生長(zhǎng)速度、ELISA檢測(cè)D值的穩(wěn)定性,最終獲得了11株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
將挑選的11株雜交瘤細(xì)胞由24孔板、6孔板和25mL培養(yǎng)瓶逐級(jí)放大培養(yǎng),收集細(xì)胞,用RP?MI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×106~8×106/mL,腹腔接種于注射石蠟油的BALB/c雌性小鼠,每只0.2mL,收集腹水(在細(xì)胞注射后12~18d產(chǎn)生),測(cè)定腹水體積,用NanoDrop2000測(cè)定總蛋白濃度,ELISA測(cè)定效價(jià),結(jié)果見表1,不同雜交瘤細(xì)胞的腹水平均產(chǎn)量、蛋白濃度及ELISA效價(jià)不同。
將11株雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的腹水分別用含3%牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋,并加入終濃度為100倍TCID50的Bartha-k61弱毒或AV25強(qiáng)毒,于37℃作用1h,接種于BHK-21細(xì)胞,每個(gè)稀釋度接種4孔,同時(shí)以CPV單克隆抗體(腹水)為對(duì)照。結(jié)果,2種病毒株在CPV抗體組和不加抗體的陽(yáng)性對(duì)照組于接種后24h即可見零星的細(xì)胞病變;48h,所有孔的細(xì)胞都出現(xiàn)病變,但CPV組的1/2稀釋孔細(xì)胞病變較輕;72或96h,即使CPV組的1/2稀釋孔細(xì)胞50%以上都出現(xiàn)病變,其他稀釋組和陽(yáng)性對(duì)照所有孔中80%以上細(xì)胞發(fā)生病變(圖2A、C)。而PRV單克隆抗體組的細(xì)胞病變與單克隆株及稀釋率有關(guān),其中單克隆抗體株5C9接毒后96h,在1/2、1/4、1/8稀釋度無(wú)細(xì)胞病變,1/16稀釋度有1孔出現(xiàn)病變,1/32稀釋度有2孔出現(xiàn)細(xì)胞病變,但細(xì)胞病變程度較輕,僅見小病變?cè)?,周圍?xì)胞正常(圖2D、E);1/64稀釋度的4個(gè)孔全部出現(xiàn)病變。3C9株的1/2、1/4稀釋度無(wú)細(xì)胞病變,1/8稀釋度及以上全部孔病變。其余單克隆株接毒96h,僅在1/2稀釋度有部分孔未出現(xiàn)病變,Bartha-k61弱毒株和AV25強(qiáng)毒株的病變情況基本一致。該結(jié)果表明,單克隆抗體株5C9對(duì)PRV有較好的中和作用,其中和效價(jià)為1∶16~1∶32,而3C9株的中和作用較弱,效價(jià)為1∶4。
表1 PRV單克隆抗體(腹水)的特征
圖1 獲得的單克隆化雜交瘤細(xì)胞株
圖2 PRV單克隆抗體對(duì)病毒的中和作用
分別用HSV-1、HSV-2和BV gD重組蛋白包被板,對(duì)11株單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果,單克隆抗體1A5株與gD存在明顯的免疫反應(yīng),其D值為0.836,而單克隆抗體2D8和4B8能同時(shí)與HSV-1和HSV-2反應(yīng)。
圖3 PRV單克隆抗體(腹水)與其他同源病毒及分子的交叉反應(yīng)
PRV是皰疹病毒科α皰疹病毒屬成員,與該科其他病毒一樣,PRV具有嗜神經(jīng)性,動(dòng)物一旦感染,病毒可在神經(jīng)節(jié)中長(zhǎng)期潛伏,感染動(dòng)物因此終生可能成為潛在的疫源。可見,動(dòng)物種群凈化是疾病防控的根本[7,11]。
在西方養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家,由于該病發(fā)現(xiàn)早、相關(guān)研究較為深入、檢測(cè)和監(jiān)測(cè)及凈化措施到位、免疫接種合理,PRV的防控較為有效,豬群流行或暴發(fā)PRV較少發(fā)生。但是,在諸如我國(guó)等養(yǎng)殖業(yè)不發(fā)達(dá)國(guó)家,由于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)手段不力、種群凈化工作滯后,PRV在豬場(chǎng)時(shí)有發(fā)生甚至暴發(fā),并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRV因此在我國(guó)與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、口蹄疫病毒等并稱為養(yǎng)豬業(yè)的重要病原。
鑒于PRV的嚴(yán)重危害,近年來國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)PRV的研究非常重視,并在疫苗研發(fā)及診斷方法等研究上取得了良好進(jìn)展[2,4,12]。但由于毒株變異及種群凈化緩慢等原因,對(duì)發(fā)病豬的控制,特別是發(fā)病仔豬的死亡仍然束手無(wú)策[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以當(dāng)前廣泛使用的PRV疫苗毒株Bartha-k61為免疫原,通過細(xì)胞融合和多次ELISA篩選,獲得了11株穩(wěn)定生產(chǎn)抗體的單克隆細(xì)胞株。對(duì)11株單抗的基本特征分析發(fā)現(xiàn),不同細(xì)胞株的腹水產(chǎn)量及腹水的蛋白含量存在較大差異,如3C9株的產(chǎn)量平均為4.2mL/只,而1C6株僅為0.9mL/只;就蛋白濃度而言,5H6為37.9 mg/mL,而2D8僅為19.9 mg/mL。表明雜交瘤細(xì)胞的差異性不僅影響抗體性質(zhì),而且對(duì)抗體生產(chǎn)同樣起著決定作用。
最有意義的是,對(duì)11株單抗的中和作用評(píng)價(jià)顯示,2株單抗對(duì)PRV都有中和作用,且對(duì)PRV弱毒株(Bartha-k61)和強(qiáng)毒株(AV25)中和效價(jià)一致。表明該抗體作用部位既是參與病毒感染的重要功能區(qū),也是相對(duì)保守的區(qū)域。其中,5C9的中和效價(jià)接近1∶32,而3C9的中和效價(jià)只有1∶4。就作者所掌握的文獻(xiàn)資料而言,Wathen早在1985年即報(bào)道了PRV的中和性單抗制備[8],但不清楚單抗的中和效價(jià)。國(guó)內(nèi)學(xué)者雖然有較多關(guān)于PRV及其分子的單抗制備研究,但未見中和性單抗成功制備的報(bào)道。孟日增等以超濃縮(超高速離心)PRV閩A株免疫家兔,制備了高ELISA效價(jià)(1∶32 000)的抗血清,且對(duì)病毒具有中和作用,其中和效價(jià)為1∶16[10],略低于本實(shí)驗(yàn)所得到的5C9單抗細(xì)胞株。而其他作者報(bào)道,利用分離得到的PRV野毒或病毒的重組蛋白免疫動(dòng)物,抗血清的中和效價(jià)最高接近1∶1000[15-16]。明顯高于本實(shí)驗(yàn)的單克隆抗體及孟日增的結(jié)果。我們推測(cè),中和效價(jià)的巨大差異可能不僅與抗血清本身有關(guān),還可能與評(píng)價(jià)過程中使用的細(xì)胞系及病毒有關(guān)。但高效價(jià)抗血清制備過程繁瑣,且容易受免疫程序中多個(gè)環(huán)節(jié)的影響。而本實(shí)驗(yàn)篩選得到的中和單抗細(xì)胞株,在中和抗體制備上具有明顯的比較優(yōu)勢(shì)。
業(yè)已證實(shí),α皰疹病毒屬成員在病毒結(jié)構(gòu)、感染機(jī)制、病毒受體等方面高度相似[17-19]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將獲得的11株P(guān)RV單抗分別與HSV-1、HSV-2和重組猴B病毒gD蛋白進(jìn)行ELISA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)2株單抗(2D8和4B8)同時(shí)與HSV-1和HSV-2存在交叉反應(yīng),而1株單抗(1A5)與gD存在明顯交叉反應(yīng)。理論上,這些單抗所針對(duì)的表位在不同病毒中高度保守,而進(jìn)化論認(rèn)為,在物種進(jìn)化過程中,保守部位通常是重要的功能區(qū)。但這些具有交叉作用的抗體對(duì)PRV都未表現(xiàn)中和活性。上述特征是否是病毒逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制之一[20-21],尚不清楚。
總之,我們成功制備了PRV的多株單克隆抗體,并篩選到對(duì)病毒具有較高中和作用的單抗,為PRV的防控奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
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Preparation and CharacterizationofMonoclonalAntibody Against Pseudorabies Virus
YE Hua-Hu1,CHEN Jian-Yu1,2,ZHOU Xiao-Jun1,WANG Jin1,DAI Yan-Yan1,HAN Yu1,LIU Heng1,YUAN Ju-Fang1*
1.Laboratory Animal Center,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071;2.College of Life Sciences,Inner Mongolia University,Hohhot 010021;China
*Corresponding author,E-mail:yjf1014@tom.com
Objective:In order to control the harm of pseudorabies virus(PRV),monoclonal antibodies against PRV were produced and analyzed.Methods:Mice were immunized with PRV Bartha-k61 strain and then its spleen B lymphocytes were separated and fused with SP2/0 cells.The positive hybridoma cells were screened out by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and used to produce ascites.The neutralizing effect of monoclonal antibodies on PRV were detected by virus neutralization experiment.Results:A total of 11 hybridoma cells lines were obtained after the treatment of cell fusion and screening.The results of virus neutralization test showed that the ascites produced by two hybridoma cell lines blocked BHK-21 cells infection by PRV attenuated strain Bar?tha-k61 and virulent strain AV25.However,the ability of neutralization effect was different between the two mono?clonal antibodies.For monoclonal antibodies 5C9,the neutralization titer was 1∶16~1∶32 and only 1∶4 was in monoclonal antibodies 3C9.In addition,among the 11 monoclonal antibodies,2 showed obvious immunoreactionwith herpes simplex virus type 1 and type 2,and 1 showed a significant cross-reactivity with recombinant gD pro?tein of monkey B virus.Conclusion:Monoclonal antibodies against PRV were successfully prepared and the mono?clonal antibodies with neutralization effect was screened out.In addition,we found that some monoclonal antibod?ies could cross-react with other herpes viruses.
pseudorabies virus;monoclonal antibodies;neutralization effect;cross-reactivity
Q78;R392.1
A
1009-0002(2017)04-0441-06
2017-01-03
國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAI08B03);國(guó)家自然科學(xué)基金(31272514,31501908)
葉華虎(1970- ),男,博士,(E-mail)huahuy512@126.com
袁菊芳,(E-mail)yjf1014@tom.com
10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.007