卡洛斯·伊巴涅斯

2017年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了杰弗里·霍爾、邁克爾·羅斯巴什和邁克爾·楊，以獎(jiǎng)勵(lì)他們發(fā)現(xiàn)的控制晝夜節(jié)律的分子機(jī)制。晝夜節(jié)律由內(nèi)部生物鐘驅(qū)動(dòng)，這個(gè)微生物鐘能預(yù)期晝夜循環(huán)以優(yōu)化生物體的生理和行為。

生物體能夠在生理和行為上適應(yīng)晝夜節(jié)律的時(shí)間，這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)很久了，但內(nèi)生晝夜節(jié)律鐘的存在一直到20世紀(jì)之后才最終確定下來。1971年，西摩·本澤爾和羅納德·科諾普卡辨認(rèn)出果蠅突變體表現(xiàn)出24小時(shí)正常周期的蛹孵化和自主活動(dòng)的變化。實(shí)驗(yàn)表明，突變涉及相同的基因，后來被命名為周期（per）。

10年之后，在布蘭迪斯大學(xué)展開合作的霍爾和羅斯巴什以及洛克菲勒大學(xué)的楊分離出該周期基因并對(duì)其進(jìn)行了分子表征，但其結(jié)構(gòu)和序列并沒有立即表明晝夜節(jié)律鐘的分子機(jī)制?；魻?、羅斯巴什和楊的一系列突破，最終得出了轉(zhuǎn)錄翻譯反饋回路（TTFL）的概念。在這種機(jī)制中，per 及其伴侶基因永恒（tim）的轉(zhuǎn)錄被其自身的基因產(chǎn)物——周期（PER）和永恒（TIM）——蛋白質(zhì)壓制，產(chǎn)生自主振蕩。當(dāng)時(shí)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制并不明顯，自發(fā)維持的晝夜TTFL的發(fā)現(xiàn)是一個(gè)新的范式。

之后，三位科學(xué)家進(jìn)一步的研究揭示了一系列互鎖的TTFL，以及復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。這些研究成果涉及蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)和TTFL 組分降解、蛋白復(fù)合物裝配、核易位以及其他翻譯后修飾，會(huì)產(chǎn)生約24小時(shí)一個(gè)周期的振蕩。單個(gè)細(xì)胞中的晝夜節(jié)律振蕩器對(duì)攜帶信號(hào)的反應(yīng)不同，并控制各種生理輸出，例如睡眠模式、體溫、激素釋放、血壓和代謝?；魻?、羅斯巴什和楊的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)揭示了解釋晝夜節(jié)律適應(yīng)的重要生理機(jī)制，對(duì)人類健康和疾病的研究具有重要意義。

是什么讓我們產(chǎn)生時(shí)間概念？

地球上生命的一個(gè)重要特征就是適應(yīng)環(huán)境的能力。不同的地理位置具有不同的環(huán)境，生物體會(huì)逐漸適應(yīng)不同的環(huán)境條件以增強(qiáng)其生存力。然而，在任何一個(gè)位置，由于地球在其軸上的旋轉(zhuǎn)，每天都會(huì)發(fā)生光和溫度的重大變化。為了適應(yīng)這種變化，大多數(shù)生物體已經(jīng)發(fā)展出一種內(nèi)部的生物鐘，可以預(yù)測(cè)晝夜的周期，并幫助它們優(yōu)化其生理和行為。這種內(nèi)在的日常節(jié)奏被稱為“晝夜節(jié)律”。晝夜節(jié)律在生命的整個(gè)進(jìn)化過程中是一直存在的。我們知道，無論是單細(xì)胞的藍(lán)藻細(xì)

菌和原生動(dòng)物生命形式，還是所有多細(xì)胞生物體，包括真菌、植物、昆蟲、嚙齒動(dòng)物和人類，這些生命形式中都存在晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律系統(tǒng)的構(gòu)建塊由自維持24小時(shí)節(jié)律發(fā)生器或振蕩器組成，確定內(nèi)部振蕩器與外部刺激（被稱為授時(shí)因子，即計(jì)時(shí)器）的連接或夾帶一定機(jī)制（如光線）使其連接，并輸出允許及時(shí)調(diào)度生理過程的機(jī)制。

從節(jié)奏到時(shí)鐘

有關(guān)生物調(diào)整其生理和行為，以適應(yīng)晝夜節(jié)律的時(shí)間這方面的觀察記錄已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史了，而且最早觀察的是植物中的葉和花的運(yùn)動(dòng)。例如，含羞草的葉子晚上合攏白天展開。1729年， 法國天文學(xué)家讓·雅克·多爾都·德·麥朗將含羞草置于黑暗中，觀察到葉片在一天的適當(dāng)時(shí)間有節(jié)奏地展開、合攏，表明其晝夜節(jié)律的內(nèi)源性來源。大約200年后，德國植物生理學(xué)家和晝夜節(jié)律研究先驅(qū)歐文·邦寧將一種豆類植物的葉子精心連接到一臺(tái)波動(dòng)曲線記錄儀上，分別記錄了

正常晝夜周期和恒定的光照條件下葉子的運(yùn)動(dòng)。他觀察到葉子的運(yùn)動(dòng)節(jié)律持續(xù)存在。在這之前，有關(guān)植物和動(dòng)物的晝夜節(jié)律行為是由內(nèi)生時(shí)鐘控制還是僅僅是對(duì)晝夜節(jié)律外部刺激的反應(yīng)的問題，在科學(xué)界一直都有激烈的爭(zhēng)論。最終，內(nèi)生晝夜節(jié)律鐘的存在終于在20世紀(jì)后建立起來。

晝夜節(jié)律和時(shí)鐘基因的遺傳性

隨著時(shí)間的推移，除了周期性葉片運(yùn)動(dòng)之外，許多相關(guān)的生理特性都被發(fā)現(xiàn)受生物鐘控制，晝夜節(jié)律的遺傳開始被認(rèn)為是自然選擇的產(chǎn)物。20世紀(jì)30年代，歐文·邦寧的經(jīng)典研究表明，盡管親本植物暴露于非晝夜節(jié)律光照期，但是植物的晝夜節(jié)律仍然可以遺傳，并且在不同時(shí)期的雜種之間雜交，從而產(chǎn)生具有中等周期的植物。到20世紀(jì)60年代中期，研究生物鐘的生物學(xué)研究團(tuán)體已經(jīng)得到穩(wěn)定確立，并且開始考慮時(shí)鐘基因的概念。

正是在這個(gè)時(shí)候，在加州理工學(xué)院工作的西摩·本澤爾和他的學(xué)生羅納德·科諾普卡開始研究改變了晝夜節(jié)律表型的突變果蠅。本澤爾與當(dāng)時(shí)的幾位遺傳學(xué)家和行為科學(xué)家不同，他堅(jiān)信具體行為可能受到單一基因作用的影響，并且有可能通過分離攜帶突變個(gè)體基因的生物進(jìn)行證明。本澤爾和科諾普卡使用經(jīng)典的化學(xué)誘變策略，分離出三種不同的突變體株，顯示蛹羽化及自主活動(dòng)正常24小時(shí)循環(huán)的變化。其中一個(gè)突變體無規(guī)則，另一個(gè)突變體具有較短的19小時(shí)周期，第三個(gè)時(shí)間更長(zhǎng)，為28小時(shí)。映射實(shí)驗(yàn)使用當(dāng)時(shí)已知的遺傳標(biāo)記，將所有三個(gè)突變體大致定位于果蠅X染色體的相同區(qū)域。重要的是，互補(bǔ)性測(cè)試表明，這三個(gè)突變涉及相同的基因，后來被命名為周期。在此基礎(chǔ)上，本澤爾和科諾普卡推斷，不規(guī)則的突變體將攜帶無效突變，使基因失活，并且具有較長(zhǎng)和較短周期的突變體將攜帶錯(cuò)義突變，莫名其妙地以相反的方式改變基因產(chǎn)物的功能。后來的研究顯示，這兩個(gè)推斷都是正確的。然而，盡管本澤爾繼續(xù)致力這一課題，科諾普卡繼

續(xù)研究該周期位點(diǎn)，更精確地繪制其染色體位置，但直到20世紀(jì)80年代中期，在布蘭迪斯大學(xué)合作的杰弗里·霍爾和邁克爾·羅斯巴什以及洛克菲勒大學(xué)的邁克爾·楊才將該周期基因進(jìn)行了分子克隆并測(cè)序。至此，第一個(gè)生物鐘基因被分離，其結(jié)構(gòu)被分子表征，但時(shí)間的原始遺傳識(shí)別和其cDNA的克隆和測(cè)序都沒有指出晝夜節(jié)律鐘的分子機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄翻譯反饋回路

在per被克隆后的幾年里，杰弗里·霍爾和邁克爾·羅斯巴什開始研究其蛋白質(zhì)產(chǎn)物（PER）如何發(fā)揮晝夜節(jié)律的作用，提出了一個(gè)“膜梯度”模型，其中PER被設(shè)想為像泵一樣在膜上形成梯度，達(dá)到閾值后，通過光敏通道消散。另一個(gè)模型提出PER蛋白是將細(xì)胞聚集在一起的蛋白多糖，從而促進(jìn)通過間隙連接形成細(xì)胞間連接。有了可靠的PER抗體，這一方面的研究終于實(shí)現(xiàn)了一系列突破。首先，霍爾和羅斯巴什的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)果蠅大腦神經(jīng)元中豐富的PER 蛋白呈現(xiàn)24小時(shí)循環(huán)，夜間出現(xiàn)峰值。由per基因編碼的mRNA顯示出果蠅腦中豐度的晝夜循環(huán)，表明PER蛋白的循環(huán)由周期mRNA的循環(huán)產(chǎn)生，周期mRNA水平的峰值在PER蛋白豐度峰值前幾小時(shí)發(fā)生。重要的是，一個(gè)無意義的突變體不能產(chǎn)生周期mRNA的振蕩水平，但野生型PER蛋白可以挽救環(huán)狀mRNA的表達(dá)?；谶@些觀察，霍爾和羅斯巴什提出負(fù)自動(dòng)調(diào)節(jié)反饋模型的觀點(diǎn)，認(rèn)為PER 蛋白的積累導(dǎo)致周期mRNA表達(dá)的減弱。因此，PER蛋白被發(fā)現(xiàn)是核蛋白，并以時(shí)間調(diào)節(jié)的方式在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，為PER蛋白是某種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的觀點(diǎn)提供了支持。

與此同時(shí)，楊通過一個(gè)新的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)了永恒（tim）這個(gè)影響晝夜節(jié)律鐘的另一基因。楊的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，永恒mRNA的水平也在24小時(shí)內(nèi)循環(huán)，TIM可以直接結(jié)合PER，通過阻斷PER降解來影響其核定位和豐度。重要的是，per表達(dá)的循環(huán)在tim的突變體蠅中被消除，相反，永久性表達(dá)的晝夜循環(huán)在周期突變體蠅中喪失。這些進(jìn)展鞏固了TTFL的基本概念框架，成為促進(jìn)時(shí)鐘基因自動(dòng)調(diào)節(jié)中晝夜循環(huán)的機(jī)制。

如上所述，當(dāng)時(shí)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制并不明顯，科學(xué)界正在考慮不同的替代方案。因此，發(fā)現(xiàn)自我維持的晝夜TTFL代表了一種新的范式。

PER和TIM的轉(zhuǎn)錄的激活機(jī)制仍然未知。這個(gè)問題是通過發(fā)現(xiàn)時(shí)鐘（Clk）和per基因來解決的。Clk基因是約瑟夫·高橋首先在小鼠身上鑒定到的?；虍a(chǎn)物、時(shí)鐘（CLK）和循環(huán)（CYCLE）相互作用，含有基本的螺旋—環(huán)—螺旋（bHLH）基序，并結(jié)合PER 中的特定元素和TIM，從而積極調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。后來的研究顯示，TIM和PER可作為CLK活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子。由此，晝夜反饋循環(huán)被關(guān)閉。

晝夜分子時(shí)鐘裝置的工作模式非常復(fù)雜，包括許多附加的組成部分，它們共同促進(jìn)其晝夜周期。重要的是，由于轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)通常是快速的，所以必須對(duì)核心TTFL機(jī)制施加顯著的延遲以產(chǎn)生24小時(shí)振蕩。這是通過涉及調(diào)節(jié)蛋白磷酸化和TTFL組分降解，蛋白質(zhì)復(fù)合組裝，核易位和其他翻譯后修飾的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的。一項(xiàng)重要的觀察表明，這種延遲的基本機(jī)制來自楊發(fā)現(xiàn)的雙倍基因（DBT）。額外的蛋白質(zhì)整合了可以夾帶時(shí)鐘的環(huán)境輸入，例如隱花色素基因（cry）的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，并促進(jìn)其與TIM的結(jié)合，導(dǎo)致其在蛋白酶體中的降解。當(dāng)早晨到達(dá)時(shí)，TIM被降解，使得PER更容易受到DBT的磷酸化和隨后的降解。

其他生物體的晝夜節(jié)律鐘

TTFL機(jī)制也是包括人在內(nèi)的其他多細(xì)胞生物體晝夜節(jié)律鐘的基本原理。果蠅中核心時(shí)鐘蛋白的幾個(gè)同源物，包括CLK和PER，在哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律計(jì)時(shí)中起著相似的作用。雖然植物主要使用與果蠅晝夜節(jié)律鐘不同的轉(zhuǎn)錄因子，但TTFL是統(tǒng)一的主要原則。然而，在藍(lán)細(xì)菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)依賴于順序蛋白磷酸化事件的不同類型的轉(zhuǎn)錄非依賴性晝夜節(jié)律振蕩子。值得注意的是，使用純化的藍(lán)細(xì)菌CLK蛋白和ATP可以在體外重建晝夜節(jié)律。由過氧化物氧化蛋白的高氧化反應(yīng)引起的與

轉(zhuǎn)錄無關(guān)的振蕩也在真核生物中得到描述，包括人類紅細(xì)胞。這種TTFL獨(dú)立振蕩的生理相關(guān)性是未知的。然而，這些結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也可能存在用于產(chǎn)生晝夜節(jié)律振蕩的其他機(jī)制。

生物鐘的夾帶和同步

晝夜節(jié)律程序在中央和外圍水平都受到管制。在哺乳動(dòng)物中，中心起搏點(diǎn)位于下丘腦的視交叉上核（SCN），并且是晝夜主節(jié)律鐘。視網(wǎng)膜接收光輸入并將該信息中繼到SCN，并同步其自身的神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)鐘。中央時(shí)鐘通過體液因子和外周自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)整個(gè)體內(nèi)的晝夜節(jié)律。當(dāng)然，晝夜節(jié)律基因表達(dá)的能力在整個(gè)生物體內(nèi)是普遍的，并且大多數(shù)外周器官和組織都可以分離地表達(dá)晝夜節(jié)律振蕩。因此，動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)類似時(shí)鐘店而非單個(gè)時(shí)鐘。這就提出了如何有效地同步這么多時(shí)鐘的問題。

外部時(shí)鐘可以通過SCN和環(huán)境線索同步，包括取食、身體活動(dòng)和溫度。不同組織的外部時(shí)鐘控制相關(guān)生理輸出，如葡萄糖生產(chǎn)、脂肪儲(chǔ)存和激素釋放；這些反過來又作為整個(gè)身體組織中時(shí)鐘的保持線索，最終反饋給SCN。因此，生物體的晝夜節(jié)律系統(tǒng)是互連振蕩器和反饋回路網(wǎng)絡(luò)。中央和周邊時(shí)鐘之間的關(guān)系，以及本地和外部線索影響它們的多種方式，是通向新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。

晝夜節(jié)律生物學(xué)與人類健康

時(shí)間生物學(xué)對(duì)我們生理學(xué)的許多方面都產(chǎn)生著影響。例如，晝夜節(jié)律鐘有助于調(diào)節(jié)睡眠模式、取食行為、激素釋放、血壓和體溫，分子鐘也在許多組織中起局部關(guān)鍵作用。在動(dòng)物模型中，消除Clk 基因可導(dǎo)致激素的心律失常產(chǎn)生，如皮質(zhì)酮和胰島素。Clk基因也通過控制糖異生、胰島素敏感性和血糖全身振蕩對(duì)代謝產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。睡眠對(duì)正常的腦功能至關(guān)重要，晝夜節(jié)律障礙與睡眠障礙以及抑郁、雙相情感障礙、認(rèn)知功能、記憶形成和一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。在罕見的情況下，睡眠障礙是由于晝夜節(jié)律基因的突變導(dǎo)致的。研究表明，我們的生活方式與我們內(nèi)生的晝夜節(jié)律規(guī)定的節(jié)奏之間的慢性不對(duì)準(zhǔn)可能與各種疾病（包括癌癥、神經(jīng)變性疾病、代謝紊亂和炎癥）的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。目前，科學(xué)界正在努力研究計(jì)時(shí)生物學(xué)和藥理學(xué)方法來修改晝夜時(shí)鐘的周期、相位或幅度，以改善人體健康。

綜上所述，自我維持的轉(zhuǎn)錄/ 翻譯反饋回路的發(fā)現(xiàn)是晝夜節(jié)律基因控制細(xì)胞和組織中晝夜節(jié)律振蕩的分子機(jī)制的核心組成部分。這一發(fā)現(xiàn)提供了一種新范式，使我們能夠理解生物體如何預(yù)期和適應(yīng)日常環(huán)境的提示，例如光。這三位獲獎(jiǎng)?wù)叩闹匾l(fā)現(xiàn)闡明了基本的生理機(jī)制，使得晝夜節(jié)律生物學(xué)已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)廣泛而高度動(dòng)態(tài)的研究領(lǐng)域，對(duì)我們的健康和幸福有著重要的影響。