彭延剛, 毛海峰

(1. 湖南省邵陽市中心醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 湖南 邵陽, 422000;2. 江西省宜春市宜春學(xué)院體育學(xué)院 體育醫(yī)學(xué)系, 江西 宜春, 336000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血白細(xì)胞介素-32的表達(dá)及臨床意義

彭延剛1, 毛海峰2

(1. 湖南省邵陽市中心醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 湖南 邵陽, 422000;2. 江西省宜春市宜春學(xué)院體育學(xué)院 體育醫(yī)學(xué)系, 江西 宜春, 336000)

目的分析類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血白細(xì)胞介素-32(IL-32)的表達(dá)及臨床意義。方法選取122例RA患者，根據(jù)活動(dòng)度積分(DAS28)將其分為高活動(dòng)組45例(DAS28>5.1)、中低活動(dòng)組42例(DAS28≥2.6～≤5.1)和緩解期組35例(DAS28<2.6)。選取同期50例非RA結(jié)締組織病患者作為非RA組，選取同期50名健康志愿者作為對(duì)照組。對(duì)5組研究對(duì)象血清IL-32、TNF-α水平及外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的IL-32、TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)和比較。結(jié)果高活動(dòng)組患者PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-32、TNF-α水平最高，其次為中低活動(dòng)組患者，非RA組患者的血清TNF-α水平顯著高于緩解期組和對(duì)照組(P<0.05)。緩解期、非RA組和對(duì)照組PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-32水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 緩解期組和對(duì)照組研究對(duì)象的血清TNF-α水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平與RA患者的病情指標(biāo)均具有相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論RA患者表現(xiàn)為外周血IL-32水平的顯著升高，其水平與其疾病嚴(yán)重程度和活動(dòng)性程度指標(biāo)具有相關(guān)性，提示了IL-32可能在RA的活動(dòng)性增強(qiáng)過程中具有重要的作用，可作為評(píng)價(jià)RA病情的輔助指標(biāo)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎; 外周血; 外周血單核細(xì)胞; 白細(xì)胞介素-32

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種多見于中年女性的自身免疫性疾病，患者的臨床表現(xiàn)為慢性、進(jìn)行性、對(duì)稱性、多發(fā)性的關(guān)節(jié)炎，其病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生、血管翳形成，通過浸潤(rùn)型炎癥、免疫細(xì)胞及成纖維樣滑膜細(xì)胞之間的相互作用造成病理損害，對(duì)關(guān)節(jié)的侵蝕和損害呈持續(xù)性進(jìn)展，最終形成關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。RA的確切發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，但學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為免疫系統(tǒng)功能障礙在RA的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用[2]。白細(xì)胞介素-32(IL-32)是一種重要的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，本研究探討RA患者外周血IL-32的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月—2016年12月在醫(yī)院風(fēng)濕科住院或門診就診的122例RA患者，納入患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年制訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者的活動(dòng)度積分(DAS28)將其分為高活動(dòng)組45例(DAS28>5.1)、中低活動(dòng)組42例(DAS28≥2.6～≤5.1)和緩解期組35例(DAS28<2.6)。選取同期50例非RA結(jié)締組織病患者為非RA組，其中包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡22例，強(qiáng)直性脊柱炎11例，皮肌炎7例，干燥綜合征4例，系統(tǒng)性硬化癥3例，成人Still病3例。選取同期50名門診體檢的健康志愿者作為對(duì)照組，納入研究對(duì)象均經(jīng)臨床檢查排除結(jié)締組織病。以上各組研究對(duì)象均排除合并心腦卒中、肝腎功能不全、糖尿病、惡性腫瘤、慢性阻塞性肺部疾病、炎癥性腸病及入組時(shí)1個(gè)月內(nèi)有明顯急性感染性疾病癥狀者，排除妊娠期或哺乳期婦女。5組研究對(duì)象在年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)量等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

1.2 觀察指標(biāo)與方法

采集各組研究對(duì)象的空腹外周靜脈血標(biāo)本，取3 mL血樣于室溫下靜置2 h后以3 000 r/min的速度離心5 min后分離血清，置于-80℃冰箱中保存待測(cè)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)對(duì)血清中的IL-32和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平進(jìn)行檢測(cè)，ELISA試驗(yàn)盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。取4 mL 血樣經(jīng)EDTA抗凝處理后，加入PBS和淋巴細(xì)胞分離液后以1 500 r/min的速度離心15 min分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)層，加入PBS再以1 200 r/min的速度離心10 min后洗滌細(xì)胞2次，去上清加入總RNA提取劑充分溶解后置于-80℃冰箱中保存待測(cè)。

表1 5組研究對(duì)象臨床資料的比較

應(yīng)用總RNA提取劑提取總RNA后應(yīng)用ReverTra Ace qPCR RT Kit合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為RT Buffer 2 μL, RT Enzyme Mix 0.5 μL, Primer Mix 0.5 μL, 變性的RNA 1 μL, Nuclease-free Water 6 μL, 總計(jì)10 μL。反應(yīng)條件為37 ℃反應(yīng)15 min, 98 ℃反應(yīng)5 min, 反應(yīng)產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR)對(duì)PBMC中的IL-32、TNF-α基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。目標(biāo)RNA的引物序列: 目標(biāo)RNA為IL-32的Forward引物序列為5′-TGAGGAGCAGCACCCAGAGC-3′, Reverse引物序列為5'-CCGTAGGACTGGAAAGAGGA-3′; 目標(biāo)RNA為TNF-α的Forward引物序列為5′-TCAGCCTCTTCTCCTTCCTG-3′, Reverse引物序列為5′-TGAAGAGGACCTGGGAGTAG-3′。RT-PCR反應(yīng)體系為SYBR GreenER qPCR SuperMix 5 μL, cDNA 0.6 μL, Forward primer 0.2 μL, Reverse primer 0.2 μL, RNase free water 4.0 μL，總計(jì)10 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1 min, 94 ℃變性15 s, 56 ℃復(fù)性15 s, 72 ℃延伸45 s, 共反應(yīng)40個(gè)循環(huán), 72 ℃延伸7 min, 將反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃下保存, IL-32、TNF-α基因的相對(duì)表達(dá)水平應(yīng)2-ΔΔCt法表示。應(yīng)用全自動(dòng)物化儀(美國(guó)貝克曼庫爾特公司生產(chǎn))對(duì)RA患者的紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、類風(fēng)濕因子(RF)等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 5組研究對(duì)象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

5組研究對(duì)象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.126、16.336,P<0.05), 其中高活動(dòng)組患者PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他4組，中低活動(dòng)組患者PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于緩解期、非RA組和對(duì)照組(P<0.05), 而緩解期、非RA組和對(duì)照組研究對(duì)象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 5組研究對(duì)象PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

與高活動(dòng)組比較, *P<0.05;

與中低活動(dòng)組比較, #P<0.05。

2.2 5組研究對(duì)象血清IL-32、TNF-α水平比較

5組研究對(duì)象血清IL-32、TNF-α水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.038、78.156,P<0.05), 其中高活動(dòng)組患者PBMC中血清IL-32、TNF-α水平顯著高于其他4組，中低活動(dòng)組患者血清IL-32、TNF-α水平高于緩解期、非RA組和對(duì)照組，非RA組患者的血清TNF-α水平顯著高于緩解期組和對(duì)照組(P<0.05), 而緩解期、非RA組和對(duì)照組研究對(duì)象血清IL-32水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 緩解期組和對(duì)照組研究對(duì)象的血清TNF-α水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組研究對(duì)象血清IL-32、TNF-α水平的比較 pg/mL

與高活動(dòng)組比較 ,*P<0.05; 與中低活動(dòng)組比較, #P<0.05;

與非RA組比較, △P<0.05。

2.3 RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平與病情指標(biāo)的相關(guān)性分析

直線相關(guān)分析結(jié)果顯示, RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平與DAS28評(píng)分、ESR、CRP、RF等病情指標(biāo)均具有相關(guān)性(P<0.05)。見表4。

3 討 論

RA的發(fā)生和發(fā)展涉及免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫活性物質(zhì)及神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)等多種信號(hào)系統(tǒng)，其過程十分復(fù)雜。研究[3-6]證實(shí), RA患者體內(nèi)存在著明顯的Th1/Th2細(xì)胞功能、Th17/Treg細(xì)胞功能的失衡和B細(xì)胞功能亢進(jìn)，而這些免疫功能障礙又導(dǎo)致了TNF-α、干擾素和白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子的異常表達(dá)，最終成為滑膜損害、血管翳增生、破骨細(xì)胞生成、滑膜新生血管生成、骨及軟骨侵蝕等RA病理改變的重要機(jī)制。

白細(xì)胞介素是最為重要的細(xì)胞因子之一，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色，研究證實(shí)[7-10]IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-17、IL-23、IL-35、IL-37等多種白細(xì)胞介素均在RA的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示, RA患者的血清和PBMC中的IL-32水平均顯著升高，而且活動(dòng)性較高RA患者的上述變化更加顯著，其外周血IL-32水平與其疾病嚴(yán)重程度指標(biāo)具有相關(guān)性，這反映了IL-32在RA的進(jìn)展和活動(dòng)性增強(qiáng)過程中具有重要的作用。

IL-32是近年來發(fā)現(xiàn)的一種前炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，其主要功能是誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6、核因子、促分裂原活化蛋白激酶和趨化因子的產(chǎn)生和釋放，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不可取代的作用[11]。IL-32主要存在于NK細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞及PBMC中，可誘導(dǎo)形成炎癥級(jí)聯(lián)式反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞分化，對(duì)固有性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[12]。相關(guān)研究結(jié)果[13]顯示, IL-32的異常表達(dá)與病原體感染、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核、肝炎、炎癥性腸病、惡性腫瘤等疾病具有密切的相關(guān)性，而且瘢痕組織成纖維細(xì)胞中在存在著明顯的IL-32基因缺失，故IL-32還與成纖維細(xì)胞過度增生、膠原減少、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積等病理過程有關(guān)。高利常等[14]和桂明等[15]均證實(shí)，在RA患者中可觀察到血清和PBMC中IL-32表達(dá)水平的升高，而且其水平與RA的病情嚴(yán)重和骨質(zhì)破壞程度等均具有相關(guān)性，提示了IL-32可作為反映RA活動(dòng)度的輔助指標(biāo)。

表4 RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平與病情指標(biāo)的相關(guān)性分析

綜上所述，RA患者表現(xiàn)為外周血IL-32水平的顯著升高，其水平與其疾病嚴(yán)重程度和活動(dòng)性程度指標(biāo)具有相關(guān)性，提示了IL-32可能在RA的活動(dòng)性增強(qiáng)過程中具有重要的作用，可作為評(píng)價(jià)RA病情的輔助指標(biāo)。

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Expressionofinterleukin-32inperipheralbloodofpatientswithrheumatoidarthritisanditsclinicalsignificance

PENGYangang1,MAOHaifeng2

(DepartmentofRheumatology,ShaoyangCentralHospital,Shaoyang,Hu′nan, 422000; 2.DepartmentofPhysicalMedicine,PhysicalEducationCollegeofYichunUniversity,Yichun,Jiangxi, 336000)

ObjectiveTo analyze the expression of interleukin-32 (IL-32) in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis (RA) and its clinical significance.MethodsA total of 122 patients with RA were selected and divided into high activity group (DAS28>5.1, 45 cases), moderate and low activity group(DAS28≥2.6～≤5.1, 42 cases) and remission group (DAS28<2.6, 35 cases) according to the activity score (DAS28). A total of 50 patients with connective tissue diseases excluding RA were selected as the non RA group, and another 50 healthy volunteers were selected as the control group. The serum IL-32, TNF-α levels and the relative expressions of IL-32, TNF-α genes in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of the study subjects in the 5 groups were detected and compared.ResultsIn the 5 groups, the expression of serum IL-32, TNF-α levels and the relative expressions of IL-32, TNF-α mRNA of the patients in the high activity group were the highest, followed by the moderate and low activity group. The serum TNF-α level of the patients in the non RA group was higher than that in the remission group and the control group, and the differences were statistically significant (P<0.05). There were no statistically significant differences in the serum IL-32 level and the relative expressions of IL-32, TNF-α mRNA of among the patients in the remission group, the non RA group and the control group (P>0.05). There were no statistically significant difference in serum TNF-α level between the subjects in the remission group and the control group (P>0.05). The serum and PBMC IL-32, TNF-α levels of the patients with RA were correlated with the indicators of severity (P<0.05).ConclusionThe patients with RA showsignificantly increases of IL-32 levels in the peripheral blood. The level has a correlation with the indicators of disease severity and activity, which suggests that IL-32 may play an important role in the enhancement process of RA activity and can be used as the auxiliary indicator to evaluate the progression of RA.

rheumatoid arthritis; peripheral blood; peripheral blood mononuclear cells; interleukin -32

R 593.22

A

1672-2353(2017)19-052-04

10.7619/jcmp.201719015

2017-04-07

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ14705)