朱溢智, 徐 葉, 王雪艷, 劉凌翔

(1. 南京醫(yī)科大學(xué), 江蘇 南京, 210000;2. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210029)

706例食管癌術(shù)后并發(fā)癥誘因及早晚期食管癌關(guān)鍵基因差異性表達(dá)研究

朱溢智1, 徐 葉1, 王雪艷1, 劉凌翔2

(1. 南京醫(yī)科大學(xué), 江蘇 南京, 210000;2. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210029)

目的探討食管癌術(shù)后并發(fā)癥誘因，并對關(guān)鍵基因的mRNA、甲基化以及突變對不同食管癌分期的表達(dá)差異性進(jìn)行分析。方法將2010—2013年以及2015—2016年南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院暨江蘇省人民醫(yī)院食管癌術(shù)后共706例連續(xù)患者進(jìn)行回顧性分析。從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中共得到食管癌患者基因數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果患者年齡與術(shù)后敗血癥發(fā)生相關(guān)(P=0.011), 術(shù)后pTNM分期與吻合口瘺(P=0.010)以及乳糜漏(P=0.030)的發(fā)生相關(guān)，患者的術(shù)后營養(yǎng)方式與吻合口瘺(P=0.041)的發(fā)生也顯著相關(guān)。對不同分期的食管癌患者, EPHA3 mRNA表達(dá)存在顯著差異(P=0.006); NOTCH1 DNA甲基化水平存在顯著差異(P=0.027); 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異的突變基因是ZNF750 (P=0.037)、MALAT1 (P=0.044)。結(jié)論食管癌患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生與患者年齡、腫瘤TNM分期以及術(shù)后營養(yǎng)方式相關(guān)。EPHA3的mRNA表達(dá)、NOTCH1的甲基化在食管癌不同TNM分期下存在明顯差異，并且二者在中晚期患者中表達(dá)水平更高, ZNF750和MALAT1的缺失或插入性突變與食管癌的分期均呈負(fù)相關(guān)。

食管癌; 并發(fā)癥; 誘因; 腫瘤分期; mRNA; 甲基化; 突變基因; 差異

根據(jù)2017年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，食管癌死亡率在美國男性當(dāng)中排第7位且其5年生存率僅為12%～20%[1]。在中國，鱗形細(xì)胞癌是食管癌中最常見的組織學(xué)分型[2-3]。手術(shù)切除對于早期食管癌患者來說仍是最佳選擇[4]。有文獻(xiàn)[5-8]報(bào)道，食管癌術(shù)后存在3大嚴(yán)重的并發(fā)癥，分別為吻合口瘺、肺部感染和喉返神經(jīng)損傷。Bertals等[9]研究結(jié)果顯示，對食管癌患者進(jìn)行術(shù)前評估對預(yù)測手術(shù)相關(guān)死亡率有一定價(jià)值。目前，食管癌患者的平均5年生存率只有25%左右，而術(shù)后的2年生存率有34%[10-11]。本研究對中晚期與非中晚期食管癌患者可能存在的分子生物學(xué)差異進(jìn)行研究，探討其中與食管癌發(fā)展相關(guān)的分子差異，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院暨江蘇省人民醫(yī)院胸心外科2010—2013年以及2015—2016年入院行食管癌根治術(shù)的患者共706例。入組標(biāo)準(zhǔn)為: ① 所有患者均為術(shù)后患者; ② 術(shù)后病理診斷為食管癌; ③ 患者手術(shù)時(shí)間2010—2013年及2015—2016年; ④ 具有齊全的相關(guān)臨床信息，取得患者同意。于TCGA數(shù)據(jù)庫獲得164例食管癌病例，經(jīng)過篩選并去除信息不全的病例后得到107例食管癌患者的117個(gè)關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)、122個(gè)基因甲基化數(shù)據(jù)以及突變基因數(shù)據(jù)。

1.2 研究方法

對納入研究的食管癌術(shù)后患者的相關(guān)數(shù)據(jù)整理后進(jìn)行回顧性分析; 統(tǒng)計(jì)手術(shù)時(shí)的患者年齡、性別，并根據(jù)AJCC 2012版分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行術(shù)后病理TNM分期，按照2000年WHO食管癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)分為鱗形細(xì)胞癌、腺癌、小細(xì)胞癌共3類。記錄患者術(shù)后重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)治療時(shí)間、術(shù)后在院總時(shí)間，記錄患者術(shù)后營養(yǎng)方式，其中包括為單純腸內(nèi)營養(yǎng)和腸內(nèi)加腸外混合營養(yǎng)，根據(jù)手術(shù)入路將術(shù)式歸納為微創(chuàng)(腔鏡)、左后外切口(經(jīng)左胸、經(jīng)膈入腹)、右后外開胸開腹類以及經(jīng)食管裂孔途徑(腹正中切口，擴(kuò)大食管裂孔后入胸)共4類，統(tǒng)計(jì)下呼吸道感染、肺不張、胸腔(心包)積液、心律失常、肺栓塞、敗血癥、吻合口瘺、乳糜漏、幽門梗阻共9項(xiàng)術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況。另外，將TCGA數(shù)據(jù)庫獲得的107例食管癌患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，根據(jù)患者病理TNM分期以Ⅰ、Ⅱ期為A組，Ⅲ、Ⅳ期為B組，再將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PSM匹配，排除了年齡、性別、種族、組織學(xué)分類以及煙酒暴露等因素的混雜影響，從而獲得用于后續(xù)差異性分析的數(shù)據(jù)。將A、B組基因mRNA、甲基化表達(dá)值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，從而得到具有差異的關(guān)鍵基因。另外，通過Spearman相關(guān)性分析得到A、B組間存在顯著差異的突變基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件及RStudio1.0.136進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基因表達(dá)的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)經(jīng)過RStudio進(jìn)行PSM匹配后再由SPSS軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析，術(shù)后并發(fā)癥誘因分析采用多變量分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 入組706例食管癌術(shù)后患者的臨床特征

入組的706例患者中，男524例(占74.2%), 女182例(占25.8%); 手術(shù)時(shí)患者年齡為32～86歲，中位手術(shù)年齡為62歲; 腺癌共32例(占5%), 鱗癌共659例(占93%), 神經(jīng)內(nèi)分泌癌共15例(占2%), 腫瘤TNM分期從0至Ⅳ期分別有39例(占6%)、151例(占21%)、241例(占34%)、270例(占38%)、5例(占1%)。

2.2 食管癌術(shù)后并發(fā)癥誘因分析結(jié)果

在706例患者中，對于納入的9種并發(fā)癥，包括下呼吸道感染、肺不張、胸腔(心包)積液、心律失常、肺栓塞、敗血癥、吻合口瘺、乳糜漏、幽門梗阻，發(fā)生的患者總例數(shù)(發(fā)病率)分別289例(40.9%)、24例(3.4%)、464例(65.7%)、129例(18.3%)、0例(0%)、2例(0.3%)、12例(1.7%)、4例(0.6%)、1例(0.1%)。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量分析后發(fā)現(xiàn)，患者年齡與術(shù)后發(fā)生敗血癥顯著相關(guān)(P=0.011), 發(fā)生敗血癥的患者年齡在70歲以上; 患者的術(shù)后pTNM分期與術(shù)后發(fā)生吻合口瘺、乳糜漏顯著相關(guān)(P=0.010、0.030), 分期較高的患者術(shù)后更易發(fā)生吻合口瘺、乳糜漏; 另外，術(shù)后給予患者的營養(yǎng)支持方式與吻合口瘺的發(fā)生也具有相關(guān)性，術(shù)后以單一腸內(nèi)營養(yǎng)的患者術(shù)后吻合口瘺發(fā)生率為2.53%, 顯著高于術(shù)后給予腸內(nèi)加腸外混合營養(yǎng)的患者0.64%的吻合口瘺發(fā)生率(P=0.041)。見表1。

表1 術(shù)后并發(fā)癥誘因分析結(jié)果

2.3 A、B組食管癌患者關(guān)鍵基因mRNA及甲基化表達(dá)差異和突變分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得并篩選得到具有全面相關(guān)信息的107例食管癌患者的117個(gè)關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)、122個(gè)關(guān)鍵基因甲基化數(shù)據(jù)，見表2。

表2 107例食管癌患者臨床特征[n(%)]

經(jīng)過PSM匹配后，排除其他對分期的混雜因素的影響后，得到了117個(gè)mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)、患者的122個(gè)甲基化數(shù)據(jù)以及不同突變基因數(shù)據(jù)。分析A、B組的數(shù)據(jù)，對mRNA及甲基化表達(dá)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，而對突變基因數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，最終得到在A、B組之間EPHA3的mRNA表達(dá)存在顯著差異(P=0.006), NOTCH1的甲基化水平存在顯著差異(P=0.027), 見表3。

另外，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的缺失或插入性突變基因有ZNF750(相關(guān)性為-0.211,P=0.037)和MALAT1(相關(guān)性為-0.204,P=0.044), 并且這2個(gè)基因在A組的突變率分別為8.16%、12.24%, 均高于B組的突變率0%、2.04%。

3 討 論

手術(shù)是食管癌十分重要的治療手段。有研究[12]表明，有多種因素可以造成吻合口的愈合不良，如營養(yǎng)不良、術(shù)前合并呼吸系統(tǒng)疾病、吻合口血供不足、張力過高、感染、吻合口位置、吻合技術(shù)等。本文對術(shù)后吻合口瘺的發(fā)生與可能相關(guān)的影響因素分析發(fā)現(xiàn)，患者的術(shù)后營養(yǎng)支持方式(單一腸內(nèi)營養(yǎng)對比腸內(nèi)加腸外混合營養(yǎng))以及術(shù)后pTNM分期與術(shù)后吻合口瘺的發(fā)生有顯著相關(guān)性。食管作為消化系統(tǒng)器官，食管癌患者伴隨體質(zhì)量下降和營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)的比率在60%～70%以上，惡液質(zhì)發(fā)生率在60%～80%, 僅次于胃癌，因此食管癌患者很容易伴隨營養(yǎng)不良[13]。除了患者術(shù)后營養(yǎng)方式的影響之外，患者的pTNM分期越高，其腫瘤負(fù)荷以及腫瘤對機(jī)體的營養(yǎng)消耗越大，此類患者較分期較早的患者更容易發(fā)生營養(yǎng)不良，從而影響后續(xù)術(shù)后吻合口的愈合。另外，乳糜漏是食管癌術(shù)后較嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥之一，嚴(yán)重者可能會導(dǎo)致血容量減少、代謝及營養(yǎng)狀況的異常甚至死亡[14-16]。已有研究[17]證實(shí)，具有更多陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌術(shù)后患者更易發(fā)生乳糜漏(P=0.041)。因此，這也解釋了患者的術(shù)后pTNM分期與術(shù)后乳糜漏的發(fā)生有著密切關(guān)系。此外，患者接受手術(shù)時(shí)的年齡與術(shù)后發(fā)生敗血癥的發(fā)生關(guān)系密切，小于70歲的患者群體的敗血癥發(fā)生率為0%, 而≥70歲的患者群體的敗血癥發(fā)生率為1.9%?？梢酝普摚S著患者年齡的增加，手術(shù)恢復(fù)的時(shí)間和難度都增加，患者機(jī)體抵抗感染的能力下降，使得術(shù)后發(fā)生敗血癥的概率也隨之增加[18]。對于接受手術(shù)時(shí)年齡較大的患者，術(shù)后應(yīng)該積極預(yù)防感染以及防止因?yàn)殚L期臥床而導(dǎo)致的褥瘡的發(fā)生，從而降低高齡患者術(shù)后敗血癥的發(fā)生率。

表3 A、B組EPHA3 mRNA表達(dá)水平和NOTCH1甲基化水平獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)果

EPHA3編碼了EPH受體A3, 并且屬于蛋白-酪氨酸激酶家族的ephrin受體亞家族，參與了多種腫瘤相關(guān)的信號通路，并且已經(jīng)有研究[19-20]證實(shí), Ephs和ephrins在食管癌中過表達(dá)，并與預(yù)后差相關(guān)。本研究顯示，中晚期患者和非中晚期患者EPHA3 mRNA的表達(dá)存在顯著差異，且在中晚期患者中更多表達(dá)(P=0.006), 意味著EPHA3在食管癌的發(fā)展中發(fā)揮著一定作用，可能預(yù)示著較差的預(yù)后。另外，在中晚期與非中晚期患者之間具有顯著差異的還有NOTCH1甲基化水平，并且相似得在中晚期患者中其甲基化水平更高(P=0.027)。相比于食管腺癌, NOTCH1突變在食管鱗癌中更加多見，并可能參與調(diào)節(jié)鱗狀細(xì)胞分化[21]。有研究[22]表明, NOTCH1的過表達(dá)是食管鱗癌患者的顯著獨(dú)立預(yù)后因素, NOTCH1過表達(dá)的食管癌患者預(yù)后較差。此外，與食管癌分期呈負(fù)相關(guān)的包括ZNF750(P=0.037)和MALAT1 (P=0.044)突變。MALAT1在多種腫瘤中高表達(dá)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌等[23-27]。還有研究[28]表明在食管鱗癌中MALAT1的過表達(dá)與腫瘤的分期、原發(fā)灶大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。研究[29]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MALAT1的3′端6 918 nt至8 441 nt片段發(fā)生突變時(shí), MALAT1會喪失促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的能力。ZNF750是p63的一個(gè)靶基因，可誘導(dǎo)終末表皮分化[30]。有研究[21, 31]發(fā)現(xiàn), ZNF750的表達(dá)與突變率都在食管鱗癌患者中有著顯著增高，并且認(rèn)為ZNF750可能以類似NOTCH1通過調(diào)節(jié)鱗狀細(xì)胞分化的方式從而成為食管鱗癌新的腫瘤抑制因子。

綜上所述，食管癌術(shù)后并發(fā)癥可以與患者年齡、腫瘤TNM分期以及術(shù)后營養(yǎng)方式相關(guān)。EPHA3的mRNA表達(dá)水平以及NOTCH1的甲基化水平在食管癌不同TNM分期下存在顯著差異，并且二者在中晚期患者中表達(dá)水平更高。另外, ZNF750和MALAT1的缺失或插入性突變與食管癌的分期均呈負(fù)相關(guān)。

[1] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer Statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017, 67: 7-30.

[2] ZENG H. Esophageal cancer statistics in China, 2011: Estimates based on 177 cancer registries [J]. Thorac Cancer, 2016, 7: 232-237.

[3] WANG Q, JIAO J. Health Disparity and Cancer Health Disparity in China[J]. Asia Pac J Oncol Nurs, 2016, 3: 335-343.

[4] AJANI J. Esophageal cancer. Clinical practice guidelines in oncology[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2003, 1: 14-27.

[5] KIM R H, TAKABE K. Methods of esophagogastric anastomoses following esophagectomy for cancer: A systematic review[J]. J Surg Oncol, 2010, 101: 527-533.

[6] TABATABAI A. Incidence and risk factors predisposing anastomotic leak after transhiatal esophagectomy[J]. Ann Thorac Med, 2009, 4: 197-200.

[7] JONES CE, WATSON T J. Anastomotic Leakage Following Esophagectomy[J]. Thorac Surg Clin, 2015, 25: 449-459.

[8] KOYANAGI K, IGAKI H, IWABU J, et al. Recurrent Laryngeal Nerve Paralysis after Esophagectomy: Respiratory Complications and Role of Nerve Reconstruction[J]. Tohoku J Exp Med, 2015, 237: 1-8.

[9] BARTELS H, STEIN H J, SIEWERT J R. Preoperative risk analysis and postoperative mortality of oesophagectomy for resectable oesophageal cancer[J]. Br J Surg, 1998, 85: 840-844.

[10] ALLUM WH, STENNING SP, BANCEWICZ J, et al. Long-term results of a randomized trial of surgery with or without preoperative chemotherapy in esophageal cancer[J]. J Clin Oncol, 2009, 27: 5062-5067.

[11] D′AMICO T A. Outcomes after surgery for esophageal cancer[J]. Gastrointest Cancer Res, 2007, 1: 188-196.

[12] PATIL P K, PATEL S G, MISTRY R C, et al. Cancer of the esophagus: esophagogastric anastomotic leak-a retrospective study of predisposing factors[J]. J Surg Oncol, 1992, 49: 163-167.

[13] MARIETTE C, DE BOTTON M L, PIESSEN G. Surgery in esophageal and gastric cancer patients: what is the role for nutrition support in your daily practice[J]. Ann Surg Oncol, 2012, 19: 2128-2134.

[14] MARCON F. Percutaneous treatment of thoracic duct injuries[J]. Surg Endosc, 2011, 25: 2844-2848.

[15] NAIR S K, PETKO M, HAYWARD M P. Aetiology and management of chylothorax in adults [J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2007, 32: 362-369.

[16] Cerfolio R J. Chylothorax after esophagogastrectomy[J]. Thorac Surg Clin, 2006, 16: 49-52.

[17] LAGARDE S M. Incidence and management of chyle leakage after esophagectomy[J]. Ann Thorac Surg, 2005, 80: 449-454.

[18] KIM D, CHO J, KIM K, et al. Chyle leakage patterns and management after oncologic esophagectomy: A retrospective cohort study[J]. Thorac Cancer, 2014, 5: 391-397.

[19] XI HQ, W U X S, WEI B, et al. Eph receptors and ephrins as targets for cancer therapy[J]. J Cell Mol Med, 2012, 16: 2894-2909.

[20] MIYAZAKI T, KATO H, FUKUCHI M, et al. EphA2 overexpression correlates with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Cancer, 2003, 103: 657-663.

[21] RESEARCH N. Integrated genomic characterization of oesophageal carcinoma[J]. Nature, 2017, 541: 169-175.

[22] OGAWA R. NOTCH1 expression predicts patient prognosis in esophageal squamous cell cancer[J]. Eur Surg Res, 2013, 51: 101-107.

[23] ELLIS MJ. Whole-genome analysis informs breast cancer response to aromatase inhibition[J]. Nature, 2012, 486: 353-360.

[24] ZHENG H T. High expression of lncRNA MALAT1 suggests a biomarker of poor prognosis in colorectal cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7: 3174-3181.

[25] LAI M C. Long non-coding RNA MALAT-1 overexpression predicts tumor recurrence of hepatocellular carcinoma after liver transplantation[J]. Med Oncol, 2012, 29: 1810-1816.

[26] HAN Y, LIU Y, NIE L, et al. Inducing cell proliferation inhibition, apoptosis, and motility reduction by silencing long noncoding ribonucleic acid metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in urothelial carcinoma of the bladder[J]. Urology, 2013, 81: 209 e201-207.

[27] GUO F. Inhibition of metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in CaSki human cervical cancer cells suppresses cell proliferation and invasion[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2010, 42: 224-229.

[28] HU L. Up-regulation of long noncoding RNA MALAT1 contributes to proliferation and metastasis in esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2015, 34: 7.

[29] XU C, YANG M, TIAN J, et al. MALAT-1: a long non-coding RNA and its important 3′end functional motif in colorectal cancer metastasis[J]. Int J Oncol, 2011, 39: 169-175.

[30] SEN G L. ZNF750 is a p63 target gene that induces KLF4 to drive terminal epidermal differentiation[J]. Dev Cell, 2012, 22: 669-677.

[31] LIN D C. Genomic and molecular characterization of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Nat Genet, 2014, 46: 467-473.

Analysisofpredisposingfactorsofpostoperativecomplicationsof706patientsandthedifferentialexpressionofkeygenesinearlyandadvancedstagesofesophagealcancer

ZHUYizhi1,XUYe1,WANGXueyan1,LIULingxiang2

(1.NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210000; 2.DepartmentofOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu, 210029)

ObjectiveTo study the predisposing factors of postoperative complications of esophageal cancer, and analyze the different genetic expression of mRNA, DNA methylation and mutations with different esophageal cancer staging.MethodsA total of 706 patients with esophageal cancer from the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University and Jiangsu People′s Hospital from 2010 to 2013 and 2015 to 2016 were involved in this study. Data of genetic information from 107 patients with esophageal cancer were obtained from the Cancer Genome Atlas (TCGA) database.ResultsThe analysis showed that age was correlated with SEP (P=0.011), and pTNM staging was correlated with the occurrence of AF (P=0.010) and CL (P=0.030). The postoperative nutritional pattern was also significantly associated with the occurrence of AF (P=0.041). There was a significant difference in the expression of EPHA3 mRNA in patients with esophageal cancer in different TNM stage (P=0.006), DNA methylation level of NOTCH1 (P=0.027), and mutations genes such as ZNF750 (P=0.037) and MALAT1 (P=0.044).ConclusionPostoperative complications of esophageal cancer could be associated with patients′age, TNM staging and postoperative nutritional patterns. The expression of EPHA3 mRNA and the DNA methylation of NOTCH1 show significant difference in different TNM stages of esophageal cancer, and both of them have higher expression in advanced patients. Mutation of ZNF750 and MALAT1 are negatively correlated with the staging of esophageal carcinoma.

esophageal cancer; postoperative complications; predisposing factors; tumor staging; mRNA; DNA methylation; gene mutation; difference

R 735.1

A

1672-2353(2017)19-091-04

10.7619/jcmp.201719026

2017-04-16

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81472782); 江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(BK20141491)

劉凌翔