謝錦添+俞超+譚志文+吳月燕+馬立孟

摘 要：該實(shí)驗(yàn)從引物濃度和退火溫度2個(gè)方面對(duì)熒光定量PCR方法檢測(cè)獼猴桃潰瘍病病原菌方法進(jìn)行了優(yōu)化，并應(yīng)用于染病樣品的檢測(cè)。結(jié)果顯示，10μM引物濃度、58℃退火溫度為最適條件；優(yōu)化后的方法能檢測(cè)出獼猴桃潰瘍病染病枝條，特異性較高，穩(wěn)定性較好。優(yōu)化后的熒光定量PCR方法可用于獼猴桃栽培中潰瘍病菌的快速準(zhǔn)確檢驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；潰瘍病病原菌；熒光定量PCR；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S436.634.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）19-0018-3

Condition Optimization of Real-time PCR Detection Method of Kiwifruit Canker Pathogens

Xie Jintian et al

（College of Biological & Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

Abstract：In this experiment，real-time PCR detection method of kiwifruit canker pathogens was optimized from primer concentrations and annealing temperature，and applied to detect the infected samples. The result showed that primer concentration 10μM and annealing temperature 58℃ was most suitable. Symptomatic samples could be positively detected by optimized real-time PCR methods. Both specificity and stability of this method were high. The optimized real-time PCR method could be applied to detect canker pathogens rapidly and accurately in the kiwifruit cultivation.

Key words：Kiwifruit；Canker pathogen；Real-time PCR；Optimization

獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是獼猴桃栽培過程中最具毀滅性的病害之一，制約了我國(guó)獼猴桃種植規(guī)模的擴(kuò)大。該病的病原菌已被證實(shí)為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種Pseudomonas. Syringae pv. Actinidae（PSA）[1-4]，病原菌的快速、準(zhǔn)確鑒定是有效防治潰瘍病的主要措施，也是目前世界獼猴桃病害研究的熱點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于該病原菌的鑒定已建立了熒光定量PCR[5]、KN-PCR[6]、RG-PCR[7]、duplex-PCR[8]等分子檢測(cè)方法，其中熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，Q-PCR）方法的靈敏度和特異性均顯著高于其他方法，可以用于該病原菌早期樣品的檢測(cè)，但國(guó)內(nèi)尚未有大量應(yīng)用實(shí)例。為此，本研究將熒光定量PCR檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并應(yīng)用于染病樣品的檢測(cè)，為開展浙江省獼猴桃潰瘍病病原菌的準(zhǔn)確鑒定、早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 獼猴桃潰瘍病菌PSA及相似菌丁香潰瘍病菌（P. syringae pv. syringe，PSS）為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。從浙江寧波、溫州、紹興、臺(tái)州、杭州等地采集了染病枝條若干，并采集健康枝條作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA和獼猴桃組織DNA的提取 細(xì)菌基因組DNA采用天根生化科技（北京）有限公司試劑盒提取，染病和健康獼猴桃枝條基因組DNA均采用天根公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒提取，所提DNA樣品用微量核酸分析儀檢測(cè)純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小。檢測(cè)后的DNA樣品保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)條件優(yōu)化 參考文獻(xiàn)[5]合成引物P3F/P5R（5'-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG

-3'，5'-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3'）用于熒光定量PCR檢測(cè)，引物合成由北京六和華大基因科技有限公司完成。將10ng PSA基因組DNA以10倍梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。使用Bio-radi Cycler Q5 PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系：引物各0.5μL，SYBR Premix Ex TaqTM 10μL，PSA基因組DNA 0.5μL，ddH2O 8.5μL，共20μL。設(shè)置3個(gè)引物濃度梯度5μM、10μM、100μM。每個(gè)濃度重復(fù)3次，取平均值。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3min；變性94℃ 10s，退火20s，延伸72°C每循環(huán)延伸后檢測(cè)熒光，共40個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)。55～95℃內(nèi)，每升高0.5℃檢測(cè)熒光信號(hào)。設(shè)置3個(gè)退火溫度56°C、58°C、60°C。每個(gè)溫度重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 獼猴桃枝條及病原菌的檢測(cè) 浙江寧波、溫州、紹興、臺(tái)州、杭州等地采集5份典型病癥的獼猴桃枝條，1份健康獼猴桃枝條提取基因組DNA后，用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，為分析本方法的特異性，獼猴桃潰瘍病菌PSA和相似菌丁香潰瘍病菌PSS的基因組DNA也加以檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析endprint

2.1 細(xì)菌基因組DNA和獼猴桃組織DNA的提取 由圖1和圖2可知，獼猴桃枝條基因組DNA大小約15000bp，細(xì)菌基因組DNA條帶大于2000bp，與預(yù)期相符；條帶清晰無明顯拖尾，可用于下一步熒光PCR的模板。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)條件優(yōu)化 表1顯示，不同引物濃度會(huì)影響擴(kuò)增效率，10μM的引物濃度下，擴(kuò)增效率最高，達(dá)到102.6%，回歸系數(shù)值為0.998，總體效果最佳。不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增效率影響較明顯（表2），退火溫度為58℃時(shí)的擴(kuò)增效率最高，達(dá)到105.9%，回歸系數(shù)0.997，總體效果最佳。

2.3 獼猴桃枝條及病原菌的檢測(cè) 圖3顯示，采用優(yōu)化后的熒光定量PCR檢測(cè)所采集的5份典型病癥的獼猴桃枝條基因組DNA和潰瘍病菌PSA基因組DNA，均有明顯的溶解曲線單峰，且癥狀越明顯峰頂越高；而作為陽性對(duì)照的獼猴桃健康枝條基因組DNA及相似菌丁香潰瘍病菌PSS均未檢出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了優(yōu)化后的熒光定量PCR方法特異性高，較可靠，而且重復(fù)之間的Ct值變化不大，符合檢測(cè)要求，表明該方法穩(wěn)定性也較好。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)從引物濃度和退火溫度2個(gè)方面，對(duì)熒光定量PCR方法檢測(cè)獼猴桃潰瘍病菌PSA的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用優(yōu)化后的方法檢驗(yàn)所采集的獼猴桃枝條樣品和病原菌樣品。結(jié)果表明，優(yōu)化后的方法能檢測(cè)出獼猴桃潰瘍病染病枝條和PSA病原菌，能夠區(qū)別于健康枝條及PSS相似菌，特異性較高，穩(wěn)定性較好。因此，優(yōu)化的熒光定量PCR方法可用于獼猴桃栽培中潰瘍病菌的快速準(zhǔn)確檢驗(yàn)，也為其他病原菌的檢測(cè)提供了參考。

熒光定量PCR方法因其高靈敏度和特異性，越來越廣泛地應(yīng)用于植物病害的檢測(cè)[9]，這項(xiàng)技術(shù)已成為一個(gè)近幾年用于快速檢測(cè)病原菌的研究熱點(diǎn)。但是，這種技術(shù)也有其局限性，如試劑耗材費(fèi)用較高，導(dǎo)致檢驗(yàn)成本高；PCR反應(yīng)體系對(duì)擴(kuò)增效率的影響；靈敏度和重復(fù)性有待提高等。因此，其他基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法仍在研究中，如最新發(fā)表的利用巢式PCR方法快速檢測(cè)貯藏期獼猴桃果實(shí)表面潰瘍病病原菌[10]等。獼猴桃潰瘍病不僅應(yīng)在宏觀上加強(qiáng)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的研究，而且應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)該病害的防治，貫徹“預(yù)防為主，綜合防治”的植保方針[11]，利用農(nóng)業(yè)、化學(xué)、生物等方法進(jìn)行綜合防治，以達(dá)到更好地控制效果。

參考文獻(xiàn)

[1]Abelleiraa A，López M M，Pe?alver J，et al. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv.actinidiae in Spain[J].Plant Disease，2011，95：1583-1583.

[2]Everett K R，Taylor R K，Romberg M K，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing kiwifruit bacterial canker in New Zealand[J].Australasian Plant Disease Notes，2011，6（1）：67-71.

[3]Vanneste J L，Pollakoff F，Audusseau C，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae，the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in France[J].Plant Disease，2011，95：1311.

[4]趙利娜，胡家勇，葉振風(fēng)，等.獼猴桃潰瘍病病原菌的分子鑒定和致病力測(cè)定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31（5）：604-608.

[5]Gallelli A，Talocci S，Pilotti M，et al. Real-time and qualitative PCR for detecting Pseudomonas syringae pv. actinidiae isolates causing recent outbreaks of kiwifruit bacterial canker[J].Plant Pathology，2013，63（2）：264-276.

[6]Koh Y J，Nou I S. DNA marks for identification of Pseudomonas.Syringae pv. Actinidae[J].Molecules & Cells，2002，13（2）：309-314.

[7]Rees-George J，Vanneste J L，Cornish D A，et al. Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae using polymerase chain reaction （PCR） primers based on the 16S-23S rDNA intertranscribed spacer region[J]. Plant Pathology，2010，59（3）：453-464.

[8]Gallelli A，L' Aurora A，Loreti S. Gene sequence analysis for the molecular detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae：developing diagnostic protocols[J].Journal of Plant Pathology，2011，93（2）：425-435.

[9]衡靜，梁芳芳，于曉瑩，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用[J].河南農(nóng)業(yè)，2013（16）：55-56.

[10]朱丹，曹凡，高貴田，等.貯藏期獼猴桃果實(shí)表面潰瘍病病原菌的快速檢測(cè)方法研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2017，31（3）：0493-0499.

[11]王麗，周增強(qiáng)，侯琿，等.我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病研究分析及防控[J]. 中國(guó)南方果樹，2017，46（2）：178-182.

（責(zé)編：張宏民）endprint