文麗君++尤曉光

摘 要：以固相合成法合成VEGF125-136小肽及隨機小肽，并用ELISA實驗檢測其活性；同時用CY5.5標記VEGF125-136小肽，并進行細胞熒光實驗，從而為進一步的靶向對比劑的合成及影像診斷提供物質基礎。

關鍵詞：VEGF125-136小肽 CY5.5 固相合成 靶向

中圖分類號：R73 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）09（b）-0199-04

VEGF是最主要的血管生成促進因子，在人類的多種腫瘤中均有過度表達[1]，其中VEGF165促進腫瘤細胞生長及瘤區(qū)血管生成作用最大[2]。細胞膜上的VEGF受體2（vascular endothelial growth factor receptor-2，簡稱VEGFR 2）高表達于腫瘤新生的血管內皮細胞及多種惡性腫瘤細胞表面膜上（如鼻咽癌、喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌、膀胱癌、腎上腺皮質腺癌、神經(jīng)膠質瘤、淋巴瘤、白血病等），而在其它細胞中表達極低或不表達。因此，VEGFR2（KDR/flk-1）成為腫瘤靶向成像研究的重要靶點之一。

VEGF外顯子6編碼的12肽QKRKRKKSRYKS，經(jīng)研究證實，與KDR結合的能力最強，由于此小肽體內無生物學活性，具有良好的組織滲透性、代謝穩(wěn)定性及可耐受多種修飾等特點[4]，可與VEGF165競爭腫瘤新生血管內皮細胞及多種腫瘤細胞膜上VEGFR-2受體結合位點，故小肽QKRKRKKSRYKS有可能取代VEGF分子用于腫瘤的靶向顯像研究。本文以固相合成法合成實驗組VEGF125-136小肽QS及對照組隨機小肽QK，并用ELISA實驗檢測其活性，同時用CY5.5標記VEGF125-136小肽，并進行細胞外靶向實驗，從而為進一步的靶向對比劑的合成及影像診斷提供物質基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Wang樹脂（吉爾生化上海有限公司）；Fmoc保護氨基酸單體（吉爾生化上海有限公司）；1-羥基苯并三氮唑（HO Bt）、2-（1H一苯并三氮唑1，1，3，3一四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、N，N一二異丙基乙胺（DIPEA）、三氟乙酸（TFA）、三異丙基硅烷（TIS）、N，N一二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）（阿拉燈試劑）哌啶、無水乙醚、甲醇（西亞試劑）；VEGFR一抗（abcam）；辣根過氧化物酶標記的VEGFR二抗（abcam）；顯色液（Novobio）；96孔酶標板（spl）DMEM高糖培養(yǎng)基（Sigma）；胎牛血清（Sigma）；BEL-7402細胞（ATCC）；細胞培養(yǎng)瓶（Sigma）；細胞爬片（北京凱樂思科技有限公司）；相合成器（杭州歐爾柏維科技有限公司）；離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）；Agilent1100-Bruker Esquire HCT型液相色譜儀（美國布魯克公司）；X Series（X7）型電感耦合等離子體質譜儀（美國賽默飛世爾公司）；酶標儀（美國biotek酶標儀）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；inVia Reflex型共聚焦熒光顯微鏡（Renishaw公司）。

1.2 VEGF125-136小肽及隨機小肽合成

VEGF125-136小肽（QS：Gln-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Tyr-Lys-Ser）的合成：選取Fmoc-ser（tbu）-wang resin的樹脂1.0g，放入固相合成器內，加入10mL DFM，通氮氣攪拌2h，抽濾；加入20%哌啶5mL，通氮氣攪拌5min，去除樹脂上的FMOC保護基團，抽濾后分別加入DCM與DFM 5mL清洗，Kaiser試劑檢測氨基托保護情況，所用樹脂變藍或黑色表明托保護充分；接第二個氨基酸：稱取C端第二個氨基酸FMOC-lys（boc）-OH，檢測氨基托保護，抽濾后加入縮合劑HBTU 0.660g

（1.74mmol，379.24g/mol）和HOBt 0.235g（1.74 mmol，135.13g/mol），溶于10mL DMF中，再在該溶液中加入DIEA 0.449g（3.48mmol，129g/mol），通氮氣攪拌2h，抽干Kaiser試劑檢測，所有樹脂變?yōu)榘咨虻S色表明反應完全，如還有樹脂為黑色或藍色，表面反應不充分，重復接第二個氨基酸，直至所有樹脂變?yōu)榘咨虻S色為止；接后續(xù)氨基酸：Fmoc-Tyr-OH，F(xiàn)moc-Arg-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Arg-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Arg-OH，F(xiàn)moc-Lys-OH，F(xiàn)moc-Gln-OH，抽干Kaiser試劑檢測，所有樹脂變?yōu)榘咨虻S色表明反應完全；DFM清洗三次，加入甲醇5min2次，抽干備用；取0.2g樹脂TFA96.5%+triisobutylsilane1.0%+water2.5%2mL反應5h，取燒瓶加入乙醚真空抽濾沉淀，HPLC純化，離心后質譜檢測。

同樣方法合成隨機小肽（QK：Gln-Lys-Tyr-Ser-Lys-Gln-Lys-Ser-Ser-Gln-Lys-Lys）。

1.3 VEGF125-136小肽QS及隨機小肽QK活性檢測

取微球小肽QS：Gln-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Lys-Ser-Arg-Tyr-Lys-Ser及QK：Gln-Lys-Tyr-Ser-Lys-Gln-Lys-Ser-Ser-Gln-Lys-Lys各100mg入多肽合成管內。用1%BSA 2mL封閉，室溫2h；抽濾后，加入VEGFR一抗20ug/200mL，37℃，孵育2h；加入PBS 5mL，多次抽濾后，加辣根過氧化物酶標記的VEGFR2二抗20ug/200mL，37℃水育1h；多次抽濾后，加入PBS 5mL，實驗組與對照組移液器各取100uL入96孔酶標板內；每孔加底物A與B液各50uL，37℃水育15min（避光）；50ul終止液終止反應；于450nm處測定OD值，判斷陰陽性結果。endprint

1.4 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-隨機小肽合成

將103mgVEGF小肽（QKRKRKKSRYKS）與125mg隨機小肽（QKYSKQKKSSQKQK）放入固相合成器中標記A與B，錫紙包好，piperidine氨基脫保護3次；于每管內加CY5.5-NHS25mg，DIPEA500uL，室溫反應3h（400轉/分）；真空抽濾，DCM與DMF清洗3次；TFA96.5%+triisobutylsilane1.0%+water2.5%5mL反應5h；取燒瓶A與B加入乙醚真空抽濾沉淀VEGF小肽與隨機小肽。；HPLC洗脫純化：0～10min，20～40%乙腈，10～25min，40%～98%乙腈；LS/MS的洗脫條件80%乙腈，0～1min，干燥。

1.5 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-隨機小肽體外靶向實驗

1.5.1免疫熒光實驗檢測BEL-7402肝癌細胞VEGFR2受體表達情況

取對數(shù)生長的BEL-7402肝癌細胞，0.25%胰酶消化后制備單層細胞爬片；PBS沖洗爬片2次，4%多聚甲醛室溫固定10～15min，吹干；PBS沖洗4次后加入0.1mmol/mL30uLFITC-VEGFR-2抗體，37℃避光溫育2h；PBS漂洗4次，DAPI（1∶2000）復染細胞核5～10min；PBS漂洗4次，在玻片上滴加一滴防熒光猝滅劑，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡觀察VEGFR-2受體表達情況。

1.5.2 細胞熒光實驗檢測CY5.5-VEGF125-136體外靶向性能

制備BEL-7402細胞爬片同上，一組實驗組、一組對照組；實驗組加CY5.5-QS0.1mmol/mL30uL，對照組加CY5.5-QK30uL，避光37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h；所有爬片PBS漂洗4次，DAPI（1∶2000）復染細胞核5～10min；所有爬片PBS漂洗4次；在玻片上滴加一滴防熒光猝滅劑，蓋玻片封片；激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞熒光成像異同。

2 結果與討論

2.1 VEGF125-136 QS小肽QS及隨機小肽QK小肽質譜分析

固相合成的VEGF125-136 QS小肽為白色粉末，測質譜得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量為605.80，與VEGF125-136小肽理論分子量1815.87相符；固相合成的隨機小肽QK為白色粉末，測質譜得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量為564.10，與隨機小肽QK小肽理論分子量1689.95相符，這說明合成產(chǎn)物為目標物。

2.2 VEGF125-136小肽及隨機小肽的活性檢測

本次采用的驗證其活性的ELISA實驗，與傳統(tǒng)的 ELISA實驗不同，這也是本研究的創(chuàng)新之處。由于小肽在微球上，是樹脂小肽，無法進行抗體的傳統(tǒng)96孔酶標板包被，但以多肽合成管為反應容器，每步反應后濾液恰好可用抽濾從多肽合成管中吸出，而樹脂小肽被濾膜隔離留存在多肽合成管內，進行下一步反應。本次ELISA實驗，兩樣本獨立t檢驗發(fā)現(xiàn)實驗組對照組吸光值差異有顯著性意義，實驗組吸光值較對照組明顯增高，說明合成的VEGF125-136小肽具備結合VEGFR2受體活性，這是用于后續(xù)靶向對比劑合成的前提與基礎（如表1）。

2.3 cy5.5-VEGF125-136小肽及cy5.5-隨機小肽質譜分析

Cy5.5-QS經(jīng)HPLC分離純化、分析見其主峰單一明顯，雜質少，保留時間15.35min。測質譜得其主峰（m/z： [M+3H]+）分子量為720，與QS-Cy5.5小肽理論分子量2157.16相符；Cy5.5-QK經(jīng)HPLC分離純化、主峰保留時間10.025min。根據(jù)HPLC面積計算產(chǎn)物純度為70.25%，測質譜得其主峰（m/z：[M+3H]+）分子量為690，與QK-Cy5.5小肽理論分子量2067.94相符。

2.4 BEL-7402 細胞體外靶向實驗

細胞免疫熒光實驗顯示BEL-7402細胞膜表面有大量綠色熒光，VEGFR2受體陽性（如圖1）。體外細胞熒光靶向實驗顯示BEL-7402實驗組細胞膜有大量靶向紅色熒光物質CY5.5-QS（如圖2），BEL-7402對照組未見明顯紅色熒光CY5.5-QK（如圖3）。細胞熒光實驗表明CY5.5-VEGF125-136小肽體外可靶向BEL-7402細胞膜VEGFR2受體熒光顯像，CY5.5-QK隨機小肽無體外靶向成像作用。

3 結語

本文通過固相合成法成功合成VEGF125-136小肽及CY5.5-VEGF125-136小肽，并創(chuàng)新性的利用ELISA實驗來檢驗VEGF125-136小肽的活性，結果表明該小肽具備結合VEGFR2受體的活性，這是用于后續(xù)靶向對比劑合成的前提與基礎。同時細胞熒光實驗表明CY5.5-VEGF125-136小肽能靶向BEL-7402細胞膜VEGFR2受體熒光顯像，這為進一步的靶向對比劑的合成及影像診斷提供物質基礎。

參考文獻

[1] Wang L，Liu X，Wang H，Wang S.Correlation of the expression of vascular endothelial growth factor and its receptors with microvessel density in ovarian cancer[J]. Oncol Lett，2013，6（1）：175-180.

[2] Perroud HA，Rico MJ，Alasino CM，et al. Association between baseline VEGF/sVEGFR-2 and VEGF/TSP-1 ratios and response to metronomic chemotherapy using cyclophosphamide and celecoxib in patients with advanced breast cancer[J]. Indian J Cancer，2013，50（2）：115-121.endprint