郭金喜，孫蕾，遠(yuǎn)輝

（1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆烏魯木齊830011；2.國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，新疆烏魯木齊830011）

HPLC-HG-AFS法分析額爾齊斯河水域魚類中無(wú)機(jī)砷的形態(tài)

郭金喜1，2，孫蕾1，2，遠(yuǎn)輝1，2

（1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆烏魯木齊830011；2.國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，新疆烏魯木齊830011）

以超聲時(shí)間（60 min）、超聲溫度（60℃）、鹽酸濃度（5 mol/L）對(duì)新疆額爾齊斯河水域魚中無(wú)機(jī)砷超聲波提取，采用高效液相色譜-氫化物原子熒光光譜法（HPLC-HG-AFS）測(cè)定樣品中無(wú)機(jī)砷[As（Ⅲ），As（V）]。與國(guó)標(biāo)方法相比，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用該方法分析了新疆額爾齊斯河水域中10種魚中無(wú)機(jī)砷含量，結(jié)果表明魚中無(wú)機(jī)砷含量較低，符合GB 2762-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)污染物限量》規(guī)定0.5 mg/kg的限量要求。為新疆額爾齊斯河水域中魚類及其制品深加工提供安全性的技術(shù)保證，為相關(guān)部門進(jìn)一步監(jiān)管工作提供依據(jù)。

超聲波；高效液相色譜（HPLC）；氫化物原子熒光光譜（HG-AFS）；無(wú)機(jī)砷

砷的無(wú)機(jī)化合物一般具有毒性[1-3]。砷元素的毒性與其形態(tài)有著密切的關(guān)系，其毒性大小依次為，（As（Ⅲ））＞（As（V））＞（MMA）＞（DMA）＞（AsC）＞（AsB），可以看出其中無(wú)機(jī)砷的毒性最大，俗稱砒霜[4-6]。水產(chǎn)品是人類食物鏈的重要組成部分，也是主要的蛋白質(zhì)來(lái)源，而無(wú)機(jī)砷在水產(chǎn)品中能富集[7]。新疆額爾齊斯河水域盛產(chǎn)冷水魚，是新疆魚類資源的主要來(lái)源，因此對(duì)額爾齊斯河水域魚類中富集無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)及形態(tài)分型就顯得尤其重要[8-10]。目前對(duì)無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)研究有很多，但未見對(duì)新疆額爾齊斯河水域魚類中無(wú)機(jī)砷測(cè)定的報(bào)道[11-12]。砷形態(tài)測(cè)定目前主要的方法是色譜與檢測(cè)系統(tǒng)的聯(lián)用，其中以高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）和高效液相色譜-氫化物原子熒光光譜（HPLC-HG-AFS）的應(yīng)用最為廣泛。ICPMS儀器原理復(fù)雜，使用成本和操作難度高，而原子熒光光譜儀是我國(guó)少數(shù)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中高端分析儀器之一，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分析成本低、靈敏度高、選擇性好和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[13-15]。本文主要研究了超聲波提取-HPLC-HG-AFS法分析額爾齊斯河水域10種常見魚中無(wú)機(jī)砷（As（Ⅲ）、As（V））的形態(tài)，與傳統(tǒng)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法加入鹽酸溶液后需要在室溫下放置過(guò)夜相比，該方法具有提取時(shí)間短、穩(wěn)定、快速、節(jié)能、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)?？奢^為準(zhǔn)確測(cè)得新疆額爾齊斯河水域魚類中無(wú)機(jī)砷的含量，為新疆額爾齊斯河水域魚類及其制品深加工行業(yè)提供安全性的技術(shù)保證。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

額爾齊斯河水域野生魚：市售；無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[10 μg/mL As （V）（GBW0866）、10 μg/mL As （Ⅲ）（GBW08667）]：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；1.5%KBH4-0.5%KOH 混合溶液：用時(shí)現(xiàn)配；5 mmol/L（NH4）2HPO4溶液（用氨水調(diào)節(jié) pH=8.45）：用時(shí)現(xiàn)配；7%HCl：用時(shí)現(xiàn)配；硝酸（優(yōu)級(jí)純）、正己烷（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)用水為電導(dǎo)率不高于0.08 μS/cm的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC-AFS9800高效液相色譜-雙道原子熒光分光光度計(jì)（配有砷-汞空心陰極燈）：北京吉天儀器公司；T25組織勻漿器：德國(guó)IKA；SIGAMA3-30K臺(tái)式高速型冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGAMA公司；MA235F型pH計(jì)：北京中西集團(tuán)；比郎超聲波清洗儀：上海比朗儀器制造有限公司；Milli-Q Element純水器：美國(guó)Millipore公司；梅特勒-托利多AL204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；Hamilton PRPX陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）：瑞士漢密爾頓；試驗(yàn)用所有玻璃和聚四氟乙烯器皿均以20%（體積分?jǐn)?shù)）的硝酸浸泡24 h，用去離子水沖洗干凈。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取樣品可食部分打碎，勻漿，稱取1.0g濕樣于50mL離心管，加入5 moL/L的鹽酸20 mL。60℃水浴下超聲提取40 min，期間振搖數(shù)次。4℃下以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min。取上層清液，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，過(guò)濾后用于無(wú)機(jī)砷的測(cè)定[16-17]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

無(wú)機(jī)砷混標(biāo)工作液的配制：吸取 As（Ⅲ）、As（V）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用去離子水將儲(chǔ)備溶液稀釋為20、40、60、80、100 μg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液體。

1.3.3 儀器參數(shù)條件

HPLC-HG-AFS法測(cè)定額爾齊斯河水域魚中無(wú)機(jī)砷形態(tài)工作參數(shù)詳見表1。

表1 無(wú)機(jī)砷形態(tài)測(cè)定HPLC-HG-AFS工作參數(shù)Table 1 Experimental conditions for determination of inorganic arsenic with HPLC-HG-AFS

1.3.4 檢出限及精密度測(cè)定

先用空白溶液進(jìn)行連續(xù)11次測(cè)定，求出測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。As（Ⅲ）、As（V）標(biāo)準(zhǔn)系列各重復(fù)測(cè)定2次，取算術(shù)平均值后，按線性回歸法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)和斜率。以3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，得到檢出限。連續(xù)11次重復(fù)測(cè)定濃度為40 μg/L As（Ⅲ）、As（V）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算 RSD 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲參數(shù)的確定

確定以超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度、超聲提取鹽酸濃度的3個(gè)參數(shù)為研究對(duì)象，確定最佳的提取條件。

2.1.1 超聲時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)處理的樣品1.0 g，在40℃超聲提取溫度下，考察10 min～100 min不同超聲提取時(shí)間對(duì)樣品中無(wú)機(jī)砷含量的影響，測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)無(wú)機(jī)砷提取的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction efficiency of inorganic arsenic

由圖1可以看出，超聲時(shí)間在10 min～100 min范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，所測(cè)樣品中無(wú)機(jī)砷含量隨之提高，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min后，樣品中無(wú)機(jī)砷含量趨于穩(wěn)定。優(yōu)選60 min為本試驗(yàn)超聲波提取時(shí)間。

2.1.2 超聲溫度的確定

在60 min超聲提取時(shí)間下，其他條件不變，選擇超聲溫度 30、40、50、60、70、80 ℃，考察超聲溫度對(duì)樣品中無(wú)機(jī)砷含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲溫度對(duì)無(wú)機(jī)砷提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction efficiency of inorganic arsenic

由圖2可知，隨著超聲溫度的提高，樣品中無(wú)機(jī)砷測(cè)定含量逐漸升高，從60℃開始測(cè)定值趨于穩(wěn)定，優(yōu)選60℃為本試驗(yàn)超聲提取溫度。

2.1.3 鹽酸濃度的確定

在溫度為60℃，提取時(shí)間為60 min情況下，分別采用 2、3、4、5、6、7 mol/L 優(yōu)級(jí)純的鹽酸溶液用超聲波提取同一種樣品，考察酸濃度對(duì)樣品中無(wú)機(jī)砷含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酸濃度對(duì)無(wú)機(jī)砷提取的影響Fig.3 Effect of acid concentration on the extraction efficiency of inorganic arsenic

由圖3可知，隨著酸濃度的提高，樣品中無(wú)機(jī)砷測(cè)定含量逐漸升高，當(dāng)在酸濃度為5 mol/L后提取效果無(wú)顯著變化，測(cè)定值趨于穩(wěn)定。酸濃度較低時(shí)會(huì)降低提取效果，酸濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)液相柱造成損壞[15]。因此選擇5 mol/L鹽酸溶液作為超聲提取液。

2.2 無(wú)機(jī)砷的分離檢測(cè)

2.2.1 無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)系列

目前無(wú)機(jī)砷形態(tài)之所以能夠被離子交換分離的主要原因在于多數(shù)砷的化合物在選定的分離條件下多是以離子型化合物形式存在。試驗(yàn)選取5 mmoL/L（NH4）2HPO4作為流動(dòng)相，并用氨水調(diào)節(jié)至pH 8.45，使用Hamilton PRP-X100液相柱能夠?qū)崿F(xiàn)2種無(wú)機(jī)砷形態(tài)分離，分離度和保留時(shí)間均可以達(dá)到試驗(yàn)要求。2種形態(tài)無(wú)機(jī)砷的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度為20、40、60、80、100 μg/L。標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)入高效液相色譜－原子熒光光譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，得到色譜圖。以目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。詳見圖4～圖6。

圖4 As（Ⅲ）、As（V）HPLC-HG-AFS 標(biāo)準(zhǔn)系列圖譜Fig.4 Chromatograms of As（Ⅲ）and As（V）mixture standard by HPLC-HG-AFS

圖5 As（Ⅲ）標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線Fig.5 Calibration curve for As（Ⅲ）determination

圖6 As（V）標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線Fig.6 Calibration curve for As（V）determination

2.2.2 線性關(guān)系與檢出限

配制系列無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0～100 μg/L范圍內(nèi)，考察其線性試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)空白溶液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定21次，得到無(wú)機(jī)砷空白溶液測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作為儀器檢出限[18]。本研究以添加量為20.0 μg/L的空白樣品考察方法靈敏度。加標(biāo)樣品按上述方法進(jìn)行提取、測(cè)定并計(jì)算信噪比。以3倍信噪比（S/N=3）時(shí)對(duì)應(yīng)的添加濃度為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）對(duì)應(yīng)的添加濃度為定量下限[19]。依此計(jì)算得出本方法 As（Ⅲ）相關(guān)系數(shù)（r）為 1.000 0、檢出限為0.02 mg/L、相對(duì)偏差為 2.08%，As（V）相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 8、檢出限為0.02 mg/L、相對(duì)偏差為2.36%。該法檢出限低于國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)機(jī)砷檢出限0.03 mg/L，結(jié)果可靠，可以滿足新疆額爾齊斯河水域中魚類的無(wú)機(jī)砷檢測(cè)工作等需求。詳見表2。

2.3 額爾齊斯河水域中10種魚無(wú)機(jī)砷含量

額爾齊斯河水域中10種魚的無(wú)機(jī)砷檢測(cè)結(jié)果見表3。

表2 無(wú)機(jī)砷線性關(guān)系及檢出限Table 2 Linear correlation，limits of detection and linear ranges

表3 額爾齊斯河水域中10種魚的無(wú)機(jī)砷檢測(cè)結(jié)果Table 3 Contents of inorganic arsenic in fishers in Irtysh River Basin

將建立的方法對(duì)新疆額爾齊斯河水域中的10種魚進(jìn)行了無(wú)機(jī)砷分析測(cè)定，10種魚包括北極茴魚、白斑狗魚、草魚、鯉魚、銀鯽、西伯利亞鱘、河鱸、北鮭、江鱈。樣品測(cè)定結(jié)果如表2、3所示，新疆額爾齊斯河水域10種魚中無(wú)機(jī)砷測(cè)定的加標(biāo)回收率為87%～108%，其中 As（Ⅲ）的含量為未檢出～0.082 mg/kg，As（V）的含量為未檢出～0.051 mg/kg，含量均小于GB 2762-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中規(guī)定水產(chǎn)動(dòng)物及其制品無(wú)機(jī)砷的限量值0.5 mg/kg[20]。

3 結(jié)論

采用超聲波提取-HPLC-HG-AFS分析額爾齊斯河水域魚中無(wú)機(jī)砷的形態(tài)。與傳統(tǒng)的現(xiàn)行國(guó)標(biāo)法提取相比，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，該方法無(wú)機(jī)砷檢出限為0.02 mg/kg。檢測(cè)結(jié)果顯示新疆額爾齊斯河水域10種魚中無(wú)機(jī)砷檢測(cè)中7種魚無(wú)機(jī)砷未檢出，另外3種魚中無(wú)機(jī)砷含量在0.051 mg/kg～0.082 mg/kg間，新疆額爾齊斯河水域魚類中無(wú)機(jī)砷含量較低，符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定0.5 mg/kg的限量要求，為新疆額爾齊斯河水域中魚類及其制品深加工提供安全性的技術(shù)保證，為相關(guān)部門進(jìn)一步監(jiān)管工作提供依據(jù)。

[1] 林燕奎,王丙濤,顏治,等.食用菌中的總砷和砷形態(tài)分布研究[J].食品科技,2012,37(5):295-299

[2] 王繼霞,胡蔚娜,葉明德,等.貝殼類海產(chǎn)品砷形態(tài)分析實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)驗(yàn)室技術(shù)與管理,2016,33(10):45-48,54

[3] 尚德榮,趙艷芳,郭瑩瑩,等.食品中砷及砷化合物的食用安全性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2012,2(4):21-32

[4] 趙紅波,許萍,潘雷明,等.大米中無(wú)機(jī)砷測(cè)定方法的改進(jìn)[J].食品科學(xué),2014,35(14):189-192

[5] 郝云彬,宋洪強(qiáng),吳益春,等.高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定動(dòng)物源性中藥材中無(wú)機(jī)汞和甲基汞[J].分析儀器,2016,20(6):89-93

[6] 張麗華,胥學(xué)鵬,史寶成,等.河流底泥中甲基汞、乙基汞的測(cè)定中國(guó)環(huán)境監(jiān)[J].中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè),2015,21(2):14-16[7] 吳雅紅,傅曉輝,趙智鋒.對(duì)魚體中甲基汞的萃取富集和測(cè)定的研究[J].食品科學(xué),2005,26(6):213-215

[8] 蔣夢(mèng).液相色譜-原子熒光檢測(cè)水中汞形態(tài)方法研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011

[9] 歐陽(yáng)珮珮,黃城,丘福保.高效液相色譜－等離子質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中無(wú)基汞、甲基汞和乙基汞[J].中國(guó)衛(wèi)生雜志,2016,26(1):50-53

[10]高志強(qiáng),張毅強(qiáng),李杰,等.珠江入海口海產(chǎn)品中總汞與甲基汞含量特征及食用風(fēng)險(xiǎn)[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2015,24(9):1499-1504

[11]郝云彬,宋洪強(qiáng),吳益春,等.氫化物發(fā)生原子熒光法對(duì)貝類中無(wú)機(jī)砷監(jiān)測(cè)及其安全性評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué),2012,33(4):219-222

[12]江晨潔,吳光紅,張美琴,等.全國(guó)6省市甲殼類水產(chǎn)品中鉛和鎘污染情況調(diào)查與分析[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2015,6(8):3237-3246

[13]劉洋,付強(qiáng),高軍,等.江蘇鹽城地區(qū)水產(chǎn)品重金屬含量與安全評(píng)價(jià)[J].環(huán)境科學(xué),2013,6(10):4081-4089

[14]TAPIA J,VARGAS-CHACOFF L,BERTRN C,et al.Study of the content of cadmium,chromium and lead in bivalve molluscs of the Pacific Ocean (Maule Region,Chile)[J].Food Chemistry,2010,121(3):666-671

[15]Jones F T.A Broad View of Arsenic[J].Poultry Science,2007,86:2-14

[16]Peterson SA,Van Siekle J,Herlihy AT,et al．Mercury concentration in fish from streams and rivers throughout the Western United States[J].Environmental Science＆Technolo-gy,2007,41(1):58-65

[17]Zavala Yamily J,Gerads R,Williams P N,et al.Arsenic in rice:Ⅱ.Arsenic speciation in USA grain and implicationsfor human health[J].Environmental science&technology,2008,42(10):3861-3866

[18]劉麗萍,呂超,王穎.液相色譜電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)品中汞化合物形態(tài)分析方法探討[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2010,29(8):767-771

[19]陳學(xué)昌,梅光明,張小軍,等.高效液相色譜-原子熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基汞含量[J].2012,33(4):234-237

[20]中華人名共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 2762-2012食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012

Detection of Inorganic Arsenic in Fishers in Irtysh River Basin by Ultrasonic-HPLC-HG-AFS

GUO Jin-xi1，2，SUN Lei1，2，YUAN Hui1，2
（1.Xinjiang Product Quality Supervision and Inspection Institute，Urumqi 830011，Xinjiang，China；2.National Quality Supervision and Inspection Center of Agricultural Byproducts，Urumqi 830011，Xinjiang，China）

Various extraction parameters were optimized，including the time（60 min），temperature （60℃）and HCl（5 mol/L）.A method of high performance liquid chromatography-hydride coupled with generation atomic fluorescence spectrometry （HPLC-HG-AFS）had been developed for speciation inorganic arsenic[As（Ⅲ），As（V）]in ten kinds of fish in Irtysh River Basin.This method was simple，rapid，accurate and stable.Results showed that inorganic arsenic was far less than 0.5 mg/kg in GB 2762-2012“The National Standards for Food Safety，Contaminants Limits in Food”，which set limitation of inorganic arsenic.The result provide technical guarantee for the safety of fish products in Xinjiang and the Irtysh River waters in the deep processing industry and the basis for the relevant departments to further supervision.

ultrasonic wave；high performance liquid chromatography（HPLC）；hydride atomic fluorescencespectrometry（HG-AFS）；inorganic arsenic

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.035

郭金喜（1981—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品安全與衛(wèi)生。

2017-05-04