趙小惠，李 琛，張 華，鄭銘喆，季延紅 （西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)和免疫學(xué)系，陜西西安710061）

淋巴細(xì)胞特有重組激活基因蛋白載體構(gòu)建及功能鑒定

趙小惠，李 琛，張 華，鄭銘喆，季延紅 （西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)和免疫學(xué)系，陜西西安710061）

目的：淋巴細(xì)胞特異性重組激活基因（RAG）蛋白1和2共同組成的RAG重組酶是造成淋巴細(xì)胞發(fā)育及產(chǎn)生抗體多樣性的關(guān)鍵性蛋白.本研究構(gòu)建并優(yōu)化同時(shí)表達(dá)RAG1和RAG2的慢病毒載體，為研究RAG1和RAG2的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ).方法：構(gòu)建同時(shí)表達(dá)RAG1、RAG2和綠色熒光蛋白（GFP）的載體；Western Blotting驗(yàn)證該載體RAG1和RAG2蛋白表達(dá)；體外重組實(shí)驗(yàn)證實(shí)該載體表達(dá)的RAG蛋白具有催化斷裂DNA的功能.結(jié)果：構(gòu)建了表達(dá)RAG重組酶的載體pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP；Western Blotting驗(yàn)證了該載體表達(dá)RAG1和RAG2蛋白，并顯示該載體RAG1和RAG2蛋白的表達(dá)量具有較高的一致性.體外重組實(shí)驗(yàn)證實(shí)該載體表達(dá)的RAG1和RAG2組成的重組酶具有更好的催化斷裂DNA的活性.結(jié)論：優(yōu)化后的pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體可以保證RAG1和RAG2同時(shí)有效表達(dá)，GFP可作為熒光標(biāo)記，為后續(xù)細(xì)胞以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ).

載體優(yōu)化；重組激活基因蛋白；P2A序列；綠色熒光蛋白（GFP）

0 引言

哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答主要依賴(lài)于B或T淋巴細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中通過(guò)基因重排產(chǎn)生多樣性的免疫球蛋白（immunoglobulins，Igs）或T細(xì)胞受體（T?cell receptors，Tcrs）分子.Igs和Tcrs分別包括Igh、Igκ、Igλ和Tcrβ、Tcrα、Tcrδ、Tcrγ7個(gè)抗原受體基因位點(diǎn).每個(gè)抗原受體基因在淋巴前體細(xì)胞或非淋巴細(xì)胞中以無(wú)翻譯表達(dá)蛋白功能的胚系基因片段簇形式存在，表現(xiàn)為每個(gè)基因位點(diǎn)的5'端含有多個(gè)可變區(qū)（varia?ble，V）和連接區(qū)（joining，J）基因片段，3'端含有數(shù)個(gè)恒定區(qū)（constant，C）基因片段.此外，Igh、Tcrβ和Tcrδ在V和J基因片段中間還含有多樣區(qū)（diversity，D）基因片段，V、D和J基因片段的重排過(guò)程稱(chēng)為V（D）J重組［1］.這些特異性基因片段的V（D）J重組是由淋巴細(xì)胞特有的重組激活基因（recombination activating gene，RAG1和RAG2）編碼的重組激活基因蛋白（RAG1和RAG2）組成的RAG重組酶（后簡(jiǎn)稱(chēng)RAG），結(jié)合于V、D、J基因片段旁的重組信號(hào)序列（recombination signal sequence，RSS），催化基因片段和RSS之間的DNA斷裂.然后通過(guò)傳統(tǒng)的非同源末端連接途徑（non?ho?mologous end joining，NHEJ）將斷裂的基因片段組合在一起，形成編碼抗原受體可變區(qū)的基因，與編碼恒定區(qū)基因共同轉(zhuǎn)錄翻譯形成完整的Igs或Tcrs分子［2］.RSS是由5'端高度保守的回文結(jié)構(gòu)——七聚體Heptamer（5'?CACAGTG?3'），3'端富含A/T堿基的九聚體Nonamer（5'?ACAAAAACC?3'）組成，和它們之間序列相對(duì)不保守，但長(zhǎng)度固定在12 bp或23 bp空間間隔序列，把間隔序列長(zhǎng)度為12 bp或23 bp的RSS分別稱(chēng)為12RSS或23RSS.正常的V（D）J重組只發(fā)生在一個(gè)12RSS和一個(gè)23RSS之間，這種限制特點(diǎn)稱(chēng)為12/23規(guī)則［3－4］.淋巴細(xì)胞特有的重排機(jī)制不僅對(duì)其發(fā)育和產(chǎn)生獲得性免疫應(yīng)答起著決定性作用，而且V（D）J重組過(guò)程出現(xiàn)錯(cuò)誤也可以促進(jìn)淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生［2］.

小鼠全長(zhǎng)RAG1（full length RAG1，fRAG1）含有1040個(gè)氨基酸，是重組酶必需的催化活性單位［5］.fRAG1從功能上分為兩部分，羧基端384?1008氨基酸為核心區(qū)（core RAG1，cRAG1），氨基端的1?383氨基酸為非核心區(qū)（non?core RAG1）［6－7］.390?448氨基酸區(qū)域稱(chēng)為九聚體結(jié)合域（nonamer binding domain，NBD），能夠結(jié)合RSS的nonamer；528?760氨基酸區(qū)域能夠與RAG2相互作用并執(zhí)行RAG催化斷裂DNA的功能［8－9］.小鼠全長(zhǎng)RAG2（full length RAG2，fRAG2）包括527個(gè)氨基酸，是RAG重組酶必需的輔助單位［10－13］.fRAG2在功能上也分為核心區(qū)和非核心區(qū)，氨基端的1?383氨基酸為核心區(qū)（core RAG2，cRAG2），羧基端384?527氨基酸為非核心區(qū)（non?core RAG2）［5］.盡管RAG2本身沒(méi)有直接結(jié)合DNA的活性，但可以與RAG1相互作用，增強(qiáng)RAG1結(jié)合DNA的親和力，是RAG催化斷裂DNA必不可少的單位［14］.RAG2的非核心區(qū)包含多個(gè)調(diào)控功能，非核心區(qū)的414?487氨基酸稱(chēng)為植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain?finger，PHD?finger），能夠特異性地識(shí)別三甲基化修飾的組蛋白H3K4（H3K4me3），引導(dǎo)RAG2結(jié)合到活化的染色質(zhì)區(qū)增強(qiáng)RAG的催化斷裂活性［15－18］.RAG2氨基酸序列的第490位的蘇氨酸（threonine，T）位點(diǎn)對(duì)于調(diào)節(jié)RAG2的穩(wěn)定性起著重要的作用.RAG2非核心區(qū)360?408富含酸性氨基酸，稱(chēng)為酸性鉸鏈區(qū)（acidic hinge region），可以調(diào)控RAG介導(dǎo)的V（D）J重組DSB以c?NHEJ進(jìn)行修復(fù)，起著維持基因組穩(wěn)定性的作用［19－21］.本研究通過(guò)構(gòu)建同時(shí)表達(dá)RAG1和RAG2的慢病毒載體，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證它們的表達(dá)及功能，為進(jìn)一步深入研究RAG1和RAG2的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料pWPI?fRAG1、pWPI?fRAG2、pMSCV?P2A?Thy1.1、pWPI?IRES?GFP、pWPI?RAG1?IRES?RAG2質(zhì)粒和重組載體pMX?Thy1.1均由本實(shí)驗(yàn)室提供.293T細(xì)胞儲(chǔ)存于液氮中.RAG1、RAG2抗體由Schatz lab提供.FuGENE?6（Cat＃1814443，Roche）、抗hCD4抗體（Cat＃555347，abcam）、抗Thy1.1抗體（Cat＃561409，abcam）.PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)表1.

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體 設(shè)計(jì)末端帶有BglII、NotI限制性酶切位點(diǎn)和能夠擴(kuò)增全長(zhǎng)RAG2的引物，以pWPI?fRAG2為模板，利用表1引物R2?BglII?L和R2?NotI?R按94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，30 cycles的步驟PCR擴(kuò)增并獲得全長(zhǎng)RAG2，并利用BglII、NotI限制性核酸內(nèi)切酶消化全長(zhǎng)RAG2片段及pMSCV?P2A?Thy1.1載體，通過(guò)T4連接酶將全長(zhǎng)RAG2連接到pMSCV?P2A?Thy1.1上，利用表1引物R2?BglII?L、R2?NotI?R進(jìn)一步進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得序列正確的pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體.

1.2.2 構(gòu)建pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1載體

設(shè)計(jì)末端帶有SalI、ClaI限制性酶切位點(diǎn)和能夠擴(kuò)增全長(zhǎng)RAG1的引物，以pWPI?fRAG1為模板，利用表1引物R1?SalI?L和R1?ClaI?R按照94℃、30 s，58℃、1 min，72℃、1 min，30 cycles的步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增并獲得全長(zhǎng)RAG1，并利用SalI、ClaI限制性核酸內(nèi)切酶消化全長(zhǎng)RAG1片段及pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體，通過(guò)T4連接酶將全長(zhǎng)RAG1連接到pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1上，利用表1引物pMSCV?R1?R、R1?M?L，按照94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、1 min，30 cycles的步驟進(jìn)一步進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得序列正確的pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1載體.

1.2.3 構(gòu)建pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體

設(shè)計(jì)末端帶有PacI、PmeI限制性酶切位點(diǎn)和能夠擴(kuò)增全長(zhǎng)RAG2?P2A?RAG1的引物，以pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1為模板，利用表1引物pWPI?PacI?L、pWPI?PmeI?R，按照94℃、1 min，60℃、1 min，72℃、2 min，30 cycles的步驟PCR擴(kuò)增并獲得全長(zhǎng)RAG1，利用PacI、PmeI限制性核酸內(nèi)切酶消化全長(zhǎng)RAG2?P2A?RAG1片段及pWPI?IRES?GFP載體，通過(guò)T4連接酶將全長(zhǎng)RAG2?P2A?RAG1連接到pWPI?IRES?GFP上，利用表1引物R2?BglII?L、R2?M?R、按照94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，30 cycles的步驟進(jìn)一步進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得序列正確的pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體.

1.2.4 載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 用FuGENE?6轉(zhuǎn)染法將pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃培養(yǎng)72 h.

1.2.5 Western Blotting實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞并提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度，加入3×SDS，100℃變性10 min；配制分離膠（8%）和濃縮膠（4%），每孔上樣20 μg，電泳結(jié)束以后采用濕轉(zhuǎn)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，100 V恒壓轉(zhuǎn)PVDF膜，電流差達(dá)到250 mA停止轉(zhuǎn)膜.將膜置于5%牛奶封閉液中封閉，室溫下在搖床上孵育2 h.按照1∶1000稀釋RAG1、RAG2抗體，置于4℃搖床上孵育過(guò)夜；第二天用TBST洗膜3次，15 min/次；用5%牛奶稀釋二抗（1∶5000稀釋?zhuān)?，室溫下在搖床上避光孵育45 min；用TBST洗膜3次，20 min/次；用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影.

1.2.6 體外重組實(shí)驗(yàn) pWPI?RAG1?IRES?RAG2或pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體分別跟pMX?Thy1.1重組載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72 h熒光顯微鏡下觀(guān)察GFP表達(dá)，隨后收集細(xì)胞.取1×106上述轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，4℃，1500 rpm，離心5 min，棄上清，預(yù)冷1×PBS洗2次，100 μL預(yù)冷1×PBS重懸.每管加入5 μL hCD4抗體，2 μL Thy1.1抗體，4℃，避光，20 min，預(yù)冷1×PBS洗2次，500 μL預(yù)冷1×PBS重懸細(xì)胞，過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFPPCR擴(kuò)增帶有BglII，NotI限制性酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)RAG2序列（圖1A）.用BglII，NotI限制性?xún)?nèi)切酶消化全長(zhǎng)RAG2的DNA以及pMSCV?P2A?Thy1.1載體，克隆形成pMSCV?RAG2?P2A?Thy1.1載體，利用引物R2?BglII?L和R2?NotI?R進(jìn)行菌液PCR鑒定陽(yáng)性克?。▓D1B），將陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒后酶切并測(cè)序（圖1C）.PCR擴(kuò)增帶有SalI，ClaI酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)RAG1序列（圖1D），克隆形成pMSCV?RAG2?P2A?RAG1?Thy1.1載體，利用引物pMSCV?R1?R、R1?M?L進(jìn)行菌液PCR鑒定陽(yáng)性克?。▓D1E），將陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒后酶切并測(cè)序（圖1F）.PCR擴(kuò)增帶有PacI，PmeI限制性酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)RAG2?P2A?RAG1序列（圖1G），用PacI，PmeI限制性?xún)?nèi)切酶消化全長(zhǎng)RAG2?P2A?RAG1的DNA以及pWPI?IRES?GFP載體，形成pW?PI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體，利用引物R2?BglII?L、R2?M?R進(jìn)行菌液PCR，將陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒后酶切并測(cè)序（圖1H、I）.

圖1 pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體構(gòu)建過(guò)程

2.2 pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFP載體表達(dá)RAG1、RAG2和GFP成功構(gòu)建pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體（圖2A），將其和實(shí)驗(yàn)室原有的pWPI?RAG1?IRES?RAG2載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞.流式細(xì)胞術(shù)顯示pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP表達(dá)GFP，效率為93%（圖2B）.提取細(xì)胞蛋白，蛋白定量后Western Blotting檢測(cè)RAG1和RAG2蛋白表達(dá)，顯示pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體兩種蛋白的表達(dá)量一致性高于PWPI?RAG1?IRES?RAG2載體（圖2C）.

圖2 pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體表達(dá)RAG1和RAG2

2.3 pWPI-RAG2-P2A-RAG1-IRES-GFP載體具有催化斷裂RSS的功能重組pMX?Thy1.1載體含有hCD4序列為標(biāo)記基因，反義的Thy1.1的序列為報(bào)告基因，其兩端分別為12RSS和23RSS.RAG結(jié)合并斷裂pMX?Thy1.1載體12RSS和23RSS，通過(guò)NHEJ途徑把斷裂的DNA連接在一起，反義的Thy1.1序列倒置成正義序列，斷端被修復(fù)，載體即可表達(dá)Thy1.1（圖3A）.pWPI?RAG1?IRES?RAG2和pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光顯微鏡下可觀(guān)察到GFP綠色熒光（圖3B）.驗(yàn)證RAG重酶組的功能驗(yàn)證時(shí)，流式結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體的293T細(xì)胞表達(dá)12.9%，pWPI?RAG1?IRES?RAG2載體表達(dá)7.9%.說(shuō)明pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體表達(dá)重組酶的活性高于pWPI?RAG1?IRES?RAG2載體表達(dá)重組酶的活性（圖3C）.

3 討論

目前，慢病毒載體已經(jīng)被作為一種常用的基因表達(dá)工具，廣泛應(yīng)用于基因治療等其他研究領(lǐng)域［22］.對(duì)于基礎(chǔ)研究者來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建功能完整的慢病毒載體是進(jìn)行后續(xù)基礎(chǔ)研究的基石.淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中經(jīng)歷的基因重排對(duì)其發(fā)育和產(chǎn)生獲得性免疫起決定性作用，反之，這種基因的重排過(guò)程出現(xiàn)錯(cuò)誤將導(dǎo)致淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生.介導(dǎo)重組的蛋白為RAG重組酶，由RAG1和RAG2共同組成.因此，建立RAG1和RAG2同時(shí)有效表達(dá)的載體對(duì)研究淋巴細(xì)胞發(fā)育和RAG異常表達(dá)造成淋巴系統(tǒng)惡性增殖性疾病至關(guān)重要.

內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）序列來(lái)源于腦心肌炎病毒，其被廣泛應(yīng)用的原因如下.①位于IRES上下游基因可以同時(shí)表達(dá)；②促進(jìn)核糖體結(jié)合在mRNA上，并促使不同位點(diǎn)的mRNA進(jìn)行翻譯［23］.因此，IRES連接的兩個(gè)基因可以被同時(shí)轉(zhuǎn)錄并翻譯，使兩種蛋白同時(shí)表達(dá).但研究發(fā)現(xiàn)含有IRES序列的載體其上下游基因表達(dá)水平不一致［24］.小RNA病毒如手足口病病毒和馬鼻炎病毒等含有特定的2A序列，研究證實(shí)2A肽段由18～22個(gè)氨基酸組成，其C末端序列高度保守，為?AspxGluxAsnProGlyPro?，這種肽段能在其C末端介導(dǎo)多聚蛋白的剪切，而剪切斷裂常發(fā)生在Gly?Pro殘基之間［25］.但2A肽剪切蛋白的功能并不通過(guò)蛋白水解酶作用，而是經(jīng)“核糖體跳躍”實(shí)現(xiàn)的［26］，研究認(rèn)為2A肽改變了核糖體的活性，促進(jìn)2A肽殘基Gly與tRNAGly之間的酯鏈水解，所以從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上釋放上游多肽的同時(shí)又推進(jìn)了下游蛋白的翻譯，從而可以保證2A肽上下游蛋白同時(shí)表達(dá).研究［27］表明2A肽上下游蛋白的同時(shí)有效表達(dá)可以避免IRES上下游蛋白表達(dá)不一致的缺點(diǎn)，所以本研究通過(guò)應(yīng)用P2A這種2A肽構(gòu)建表達(dá)重組激活基因蛋白的載體，并證實(shí)了P2A序列連接的RAG1與RAG2蛋白表達(dá)量一致性高于由IRES序列連接的RAG1與RAG2蛋白；在功能方面，含有P2A序列載體表達(dá)的RAG蛋白結(jié)合與斷裂DNA的活性也高于含有IRES序列的載體；而且pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP載體具有綠色熒光蛋白標(biāo)記，對(duì)后期載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率、分選等都提供了便利.

圖3 流式檢測(cè)Thy1.1表達(dá)量

本研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的重組激活基因蛋白載體的兩種蛋白R(shí)AG1與RAG2表達(dá)效率高于實(shí)驗(yàn)室原有的表達(dá)RAG重組酶的載體，同時(shí)也增強(qiáng)了RAG蛋白的功能，其帶有的綠色熒光蛋白也為載體提供了熒光標(biāo)記，這為研究RAG重組酶對(duì)淋巴細(xì)胞發(fā)育及淋巴細(xì)胞惡性腫瘤的作用提供了更好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

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Construction and functional identification of lymphocytes specific recombination activating gene protein vector

ZHAO Xiao-Hui，LI Chen，ZHANG Hua，ZHENG Ming-Zhe，JI Yan-Hong
Department of Pathogenic Biology and Immunology，School of Basic Medical Sciences，Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061，China

AIM：To construct and optimize the vector expressing recombination activating gene（RAG）protein 1 and RAG protein 2 simultaneously and lay a solid foundation for studying the structure and function of RAG recombinase.METHODS：Vector expressing RAG1，RAG2 and green fluorescent protein（GFP）simultane?ously were constructed；The expression of RAG1 and RAG2 protein were identified by Western Blotting，then the function of RAG protein was detected by in vitro recombinant experiment.RESULTS：A recombinant vector expressing RAG recombinase was successfully constructed，and Western Blotting indicated that the expression level of RAG1 had a good consistency with the expres?sion of RAG2 protein in this vector.Vitro recombinant experiment suggested that pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFP vector has a better DNA cleavage activity，and GFP reporter gene of the optimized pWPI?RAG2?P2A?RAG1?IRES?GFPvectorcould be used as cell labeling.CONCLUSION：After optimization，the RAG vector can ensure the expression of RAG1 and RAG2 at the same level effectively，and the reporter gene GFP can be used as a fluorescent marker and lays the foundation for further animal and cell experiments.

vector optimization；recombinant activated gene（RAG）protein；P2A sequence；GFP

R392.9

A

2017－08－11；接受日期：2017－08－26

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31170821，31370874，81670157）

趙小惠.碩士生.E?mail：18229016281＠163.com

季延紅.博士，教授，博導(dǎo).研究方向：抗體多樣性機(jī)制.Tel：029?82655182 E?mail：jiyanhong＠xjtu.edu.cn

2095?6894（2017）10?21?05