李紅彩 馬壯

不同管徑鈦納米管對成纖維細(xì)胞增殖、伸展和膠原分泌功能的影響

李紅彩 馬壯

目的研究不同管徑Ti-TiO2納米管對成纖維細(xì)胞增殖、伸展和膠原分泌功能的影響。方法以1、5、10、20 V電壓陽極氧化制備不同管徑Ti-TiO2納米管試件，試件表面培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞增殖，掃描電鏡觀察形態(tài)，天狼星紅苦味酸染色檢測細(xì)胞膠原分泌功能。結(jié)果1、5、10、20 V制備的納米管徑依次為15、30、50和100 nm。細(xì)胞在拋光表面的增殖均高于納米管表面；第5天時，100 nm納米管表面細(xì)胞的增殖顯著高于其他(P<0.01)。第3天時，拋光表面細(xì)胞呈典型長梭型，納米管表面細(xì)胞偽足明顯。100 nm納米管表面細(xì)胞的試件膠原分泌功能最大(P<0.05)。結(jié)論100 nm納米管對細(xì)胞增殖的抑制作用較小并能促進(jìn)細(xì)胞的膠原纖維分泌功能。

納米管； 成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞伸展； 膠原纖維

種植體與牙齦軟組織的結(jié)合直接影響到種植體的臨床成敗，而成纖維細(xì)胞是牙齦組織中的重要組織細(xì)胞類型，其在種植體表面良好的生長和功能分化直接影響種植體-軟組織界面的形成。眾所周知，相對于微米級粗糙表面，成纖維細(xì)胞更傾向于光滑的表面，而成骨細(xì)胞則更喜歡粗糙一點兒的表面[1]。因而臨床常用種植體的頸部也通常采用與根部粗化處理不同的光滑表面設(shè)計。

陽極氧化技術(shù)可在純鈦及鈦合金等表面生成垂直排布、均勻一致的TiO2納米管陣列[2]；與拋光純鈦相比，該納米級管狀陣列結(jié)構(gòu)擁有更大的比表面積和生物活性，可影響細(xì)胞在其表面的黏附、增殖、分化、基因表達(dá)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能[3-5]。機(jī)械拋光純鈦表面常有微米級拋光劃痕，但由于陽極氧化過程中的化學(xué)腐蝕作用，陽極氧化納米管表面粗糙度顯著降低；隨著陽極氧化電壓的增大，納米管管徑的增大，其表面粗糙度變化不明顯[3,6]。本研究用陽極氧化方法控制電壓在1～20 V之間、室溫下氧化1 h，形成直徑在15～100 nm范圍的不同尺寸的TiO2納米管結(jié)構(gòu)，觀察成纖維細(xì)胞在各種不同管徑TiO2納米管表面的伸展、增殖和膠原纖維分泌功能，評價不同管徑納米管對成纖維細(xì)胞的影響，為種植體頸部的設(shè)計提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

醫(yī)用純鈦板材(TA2,西北有色金屬研究院)；小鼠成纖維細(xì)胞L929(第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程研發(fā)中心提供)；PBS；DMEM、胎牛血清(Gibco BRL，美國)；胰蛋白酶(Sigma，美國)； Hoechst33342熒光染料(碧云天生物技術(shù)研究所)；二甲基亞砜(DMSO)、MTT試劑(北京索來寶科技有限公司)、1%天狼星紅/苦味酸液(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理教研室提供)；酶聯(lián)免疫儀(BIO-TEK，美國)；S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM-6700F，日本)；體視顯微鏡(Leica,德國)；醫(yī)用離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)。

1.2 Ti-TiO2納米管的制備

10 mm×10 mm×1 mm純鈦試件經(jīng)碳化硅砂紙打磨至1 500 目，丙酮、95%乙醇及雙蒸水超聲清洗，自然干燥后備用。以鈦試件為陽極、鉑片為陰極，在1 mol/L磷酸和質(zhì)量百分比為0.3%的氫氟酸電解液中，控制電壓分別為1、5、10和20 V，常溫反應(yīng)1 h，制備1、5、10和20 V納米管鈦試件，分別用NT1、NT5、NT10和NT20表示；以未行電解處理的拋光純鈦為對照組，用PT表示。

1.3 試件表面形貌分析

每組試件中任取1 個試件，超聲清洗后，真空干燥，場發(fā)射掃描電子顯微鏡分析試件表面形貌。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

L-929成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、1%抗生素(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天換液1 次，細(xì)胞層生長至70%～80%時傳代。

1.5 細(xì)胞增殖

試件經(jīng)60Co輻照消毒后置入24 孔培養(yǎng)板內(nèi)(每組23 個試件，每孔1 個試件)，將L-929以2×104個/L、1 ml/孔接種于24 孔板，置于37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)1、3和5 d后，每組各取5 孔終止細(xì)胞培養(yǎng)，PBS清洗3 次，每孔加入MTT(5 mg/ml)200 μl和無血清無酚紅DMEM 800 μl，37 ℃孵育4 h后吸棄上清，加入DMSO 1 ml/孔溶解生成的結(jié)晶物，每孔分別取3 份200 μl溶解液轉(zhuǎn)移至96 孔培養(yǎng)板，空白孔調(diào)零，測490 nm處測其吸光度A值。

1.6 掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

試件放置和細(xì)胞接種同細(xì)胞增殖。細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，每組任選2 個試件，PBS清洗3 遍， 2.5%戊二醛4 ℃ 24 h，之后梯度乙醇(50%、70%、80%、90%和100%)脫水，臨界點干燥法干燥后噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.7 膠原分泌功能

試樣放置和細(xì)胞接種同細(xì)胞增殖。細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，每組6 個試件， PBS漂洗3 次，4%多聚甲醛固定過夜，PBS漂洗3 次，室溫下1%天狼星紅/苦味酸液染色2 h，0.1 mol/L醋酸輕輕漂洗，室內(nèi)自然干燥后備用。每組任選1 個試件體式顯微鏡下拍照。量化分析，每孔1 個試樣，加入500 μl/孔去染液(0.2 mol/L NaOH溶液和99%甲醇按體積比1∶1混合配制)，室溫靜置30 min，每孔取3 份150 μl染液分別轉(zhuǎn)移到96 孔培養(yǎng)板，空白孔加入150 μl去染液，空白孔調(diào)零，540 nm處測量其A值。結(jié)果用3 d時細(xì)胞增殖的吸光度A值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗比較組間差別，檢驗水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 各組試件表面形貌的掃描電鏡觀察

不同陽極氧化電壓可制備出不同管徑的納米管(圖 1)。1、5、10和20 V陽極氧化電壓所形成的納米管管徑依次為約15、30、50和100 nm。1 V電壓可形成網(wǎng)格狀的納米孔結(jié)構(gòu)，管孔之間無明顯界限。5 V電壓可形成典型的管狀納米管結(jié)構(gòu)，有獨立的管壁；隨著電壓增大，納米管管徑也相應(yīng)增大。對照組拋光試件在較低放大倍數(shù)時可見拋光劃痕。

2.2 各組試件表面成纖維細(xì)胞的增殖

拋光表面成纖維細(xì)胞的增殖均高于所有陽極氧化組試樣表面，其中這種差異在第1天和第5天具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；第3天和5天時，5 V納米管表面成纖維細(xì)胞的增殖均顯著小于同時間點其余各組(P<0.01)；第5天時，20 V納米管表面成纖維細(xì)胞的增殖顯著高于其余納米管組(P<0.01)(圖 2)。

2.3 各組試件表面3 d時成纖維細(xì)胞形態(tài)

拋光表面的細(xì)胞多數(shù)呈現(xiàn)出典型的長梭型形態(tài)，沿拋光劃痕伸展；各納米管表面細(xì)胞伸展寬度增加，充滿大量細(xì)胞質(zhì)，板狀偽足明顯，其中1 V和5 V納米管表面的細(xì)胞呈現(xiàn)大量的板狀偽足和絲狀偽足(圖 3)。

2.4 各組試樣表面3 d時纖維細(xì)胞的膠原分泌

成纖維細(xì)胞3 d時的膠原分泌A540 nm值用細(xì)胞3 d時增殖結(jié)果A490 nm標(biāo)準(zhǔn)化(圖 4)，結(jié)果如圖 5所示。成纖維細(xì)胞在各組試樣表面培養(yǎng)3 d后的相對膠原分泌功能組間差異顯著(P<0. 05)，除1 V納米管組外，其余納米管組表面成纖維細(xì)胞的相對膠原分泌功能均顯著高于拋光表面(P<0.05)，且隨著陽極氧化電壓增大，細(xì)胞相對膠原分泌功能也越大，20 V納米管表面成纖維細(xì)胞的相對膠原分泌功能最大，且與其余各組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖 1 各組試件表面形貌(SEM， ×100 000)

Fig 1 Surface morphology of the samples(SEM， ×100 000)

3 討 論

理想情況下，種植體-軟組織界面應(yīng)形成緊密的“袖口”，阻擋細(xì)菌及其他致炎因子侵入，成為功能性的生物封閉屏障，保持種植體在體內(nèi)的長期穩(wěn)定作用。影響種植體-軟組織界面的因素很多，如種植體表面特征、種植體形狀、手術(shù)操作及患者自身因素等。種植體表面的納米管形貌可提高種植體-骨組織結(jié)合，同時納米管的管狀形貌可作為生長因子和抗炎藥物等的載體，這為種植體周圍炎的防治提供了新思路，成為近年來的研究熱點。

圖 2 成纖維細(xì)胞在各組試樣表面增殖(MTT實驗)

Fig 2 Proliferation of fibroblasts(MTT assay)

圖 3 各組試件表面3 d后的成纖維細(xì)胞形態(tài)(SEM， A～E： ×500， F～J： ×2 000)

Fig 3 Fibroblasts on the sample surfaces after 3 days of culture(SEM， A～E： ×500， F～J： ×2 000)

圖 4 成纖維細(xì)胞3 d時分泌的膠原纖維(天狼星紅染色)

Fig 4 Collagen production of fibroblasts after 3 days of culture on the sample surfaces(Alizarin red staining)

圖 5 成纖維細(xì)胞在各組試樣表面3 d時膠原分泌功能檢測

Fig 5 Relative collagen production of fibroblasts after 3 days of culture on the sample surfaces

研究表明成纖維細(xì)胞的在生物材料表面的黏附、伸展、增殖、分化等受材料表面納米級形貌的影響。研究發(fā)現(xiàn)PMMA表面直徑為120 nm的納米坑陣列降低了成纖維細(xì)胞的黏附、伸展等和廣泛的基因下調(diào)[7]。鈦合金表面10～180 nm的納米孔也阻礙了成纖維細(xì)胞的增殖。也有報道認(rèn)為成纖維細(xì)胞在細(xì)胞排列上對直徑30 nm的納米坑的反應(yīng)比直徑為160 nm時更敏感[8]。有研究表明：管徑約120 nm的TiO2納米管結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞的黏附、增殖等功能，而且在人工唾液中表現(xiàn)出良好的電化學(xué)穩(wěn)定性，可以促進(jìn)口腔種植體與周圍牙齦組織結(jié)合[9]。本研究結(jié)果提示納米管表面不同程度的抑制了成纖維細(xì)胞的增殖和兩極伸展，同時促進(jìn)了細(xì)胞的膠原分泌功能。納米形貌對細(xì)胞的影響受到納米尺寸、形貌結(jié)構(gòu)的空間方向、結(jié)構(gòu)的排列有序或者無序、結(jié)構(gòu)的混雜或者均一以及結(jié)構(gòu)間距等眾多因素的制約，這可能是造成納米級形貌對成纖維細(xì)胞的影響研究結(jié)果不一致的重要原因。本研究中成纖維細(xì)胞在各納米管表面增殖明顯少于拋光純鈦表面，細(xì)胞的兩極伸展也不同程度受到抑制，表明納米管形貌跟其他納米級結(jié)構(gòu)一樣抑制成纖維細(xì)胞的生長。不同管徑納米管對成纖維細(xì)胞增殖抑制作用也不同，1 V電壓下形成的管徑約15 nm的納米管對成纖維細(xì)胞增殖的影響較?。? V電壓下形成的約30 nm管徑的納米管對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用最大；之后隨著陽極氧化電壓的增大，納米管管徑增大，納米管對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用也逐漸減弱；在各納米管組中，20 V電壓下陽極氧化形成的約100 nm管徑的納米管對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用最小。

材料表面形貌可影響其表面黏附的成纖維細(xì)胞的形態(tài)[10]。研究顯示120 nm管徑的TiO2納米管表面細(xì)胞形態(tài)伸長且有較多的長短不一的絲狀偽足[9]，這與我們前期細(xì)胞黏附的實驗結(jié)果一致[11]。材料表面形貌通過影響?zhàn)じ较嚓P(guān)整合素受體的表達(dá)，改變其聚集、組裝，進(jìn)而決定細(xì)胞的形態(tài)和伸展方面的多樣性[12]。本研究觀察了成纖維細(xì)胞在各組試樣表面培養(yǎng)3 d后呈現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)。與拋光純鈦相比，納米管形貌抑制了細(xì)胞的兩極伸展，同時呈現(xiàn)較多的板狀偽足和絲狀偽足，而這種細(xì)胞形態(tài)改變同時受納米管管徑大小的影響。

試樣表面形貌顯著影響成纖維細(xì)胞功能分化和相關(guān)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，5、10、20 V納米管表面成纖維細(xì)胞的膠原分泌功能顯著增強(qiáng)，且隨著陽極氧化電壓的增大，納米管管徑增大，成纖維細(xì)胞的膠原分泌功能也越強(qiáng)。有研究表明100 nm的TiO2納米管與自然狀態(tài)下的TiO2相比，周圍形成的纖維囊層較薄，軟組織的炎癥反應(yīng)更小，提示在種植體軟組織接觸部位的應(yīng)用價值[13]。而張程程等[14]的研究結(jié)果提示管徑為130 nm的納米管比較小管徑的種植體表面形貌有利于軟組織的早期修復(fù)和改建。本實驗結(jié)果顯示，與拋光純鈦表面相比，納米管表面成纖維細(xì)胞的增殖較差且受納米管管徑的影響，但細(xì)胞的膠原分泌明顯增強(qiáng)，提示納米管表面可能會形成薄而韌的軟組織,有利于軟組織的早期修復(fù)。材料表面形貌對細(xì)胞功能的影響除了通過形貌直接給細(xì)胞傳遞的空間信號來調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)及相關(guān)功能分化外，還通過對細(xì)胞形態(tài)的改變來傳遞信號調(diào)節(jié)細(xì)胞的相關(guān)功能。最近的研究也證實鈦納米管形貌對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響有多種信號通路參與調(diào)節(jié)[5]。

由于細(xì)胞增殖和分化之間不可逃避的生物學(xué)負(fù)性關(guān)系，因而最重要的問題是在細(xì)胞增殖和分化之間的尋找合適的平衡點，并同時促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。本研究的結(jié)果提示在不同管徑的納米管中，20 V陽極氧化納米管表面成纖維細(xì)胞的增殖和膠原分泌功能最大，因而20V陽極氧化納米管最適合成纖維細(xì)胞的生長，然而最適宜種植體頸部軟組織愈合的納米管管徑仍需進(jìn)一步的體內(nèi)試驗研究。

4 結(jié) 論

與拋光表面相比，納米管表面成纖維細(xì)胞的增殖受到抑制；各納米管組中，5 V納米管對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用最大，20 V納米管對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用最小。成纖維細(xì)胞在拋光和陽極氧化納米管表面形態(tài)差異明顯；拋光試樣表面成纖維細(xì)胞呈典型的長梭型，而納米管表面細(xì)胞的兩極伸展受到抑制。納米管表面成纖維細(xì)胞的相對膠原分泌功能增強(qiáng)，20 V納米管表面成纖維細(xì)胞的相對膠原分泌功能最大。

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Theeffectsofdiameter-controlledtitaniumnanotubesontheproliferation,strechingandcollagensecretionoffibroblasts

LIHongcai，MAZhuang.

412000，ZhuzhouCentralHospital,DepartmentofStomatology，China

Objective： To study the effects of Ti-TiO2nanotubes with different diameters on the proliferation, stretching and collagen secretion of fibroblasts.MethodsTiO2nanotubes formed at 1，5，10 and 20 V potentials served as the experimental samples and polished pure titanium served as the control. Fibroblasts was cultivated on the surface of the various samples. MTT assay was used to examine the cell proliferation. The surface morphology of the cells was observed with SEM. Collagen secrection was tested by sirius red/bitter acid staining.ResultsThe nanotubes prepared by 1,5,10 and 20 V were with the diameter of 15,30,50 and 100 nm respectively. At day 1，3 and 5，the cell proliferation on polished pure titanium surface was more than that on the nanotubes surfaces at the same time；at day 5，cell proliferation on 100 nm nanotubes was significantly more than that on the other nanotube surfaces(P<0.01). At day 3, fibroblasts at polished pure titanium surface stretched as typical long spindle form, while with obvious pseudopodium at nanotube surfaces. The collagen secretion of fibroblasts was highest at 100 nm nanotubes(P<0.01).Conclusion100 nm nanotubes may have minimal negative effect on fibroblast proliferation and the greatest positive effect on the collagen secretion.

Nanotubes；Fibroblasts；Cellproliferation；Cellspreading；Collagenfiber

湖南省2013年度醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃課題(編號： C2013-051)

412000, 株洲市中心醫(yī)院口腔科

李紅彩 E-mail: 495401889@qq.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.009

(收稿： 2017-03-30 修回： 2017-05-22)