倪建秀++陳濤++陳桂芳

摘要 通過優(yōu)化前處理建立水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的UPLC-MS/MS測定方法，并應(yīng)用控制圖。樣品經(jīng)乙腈提取、固相萃取柱凈化和濃縮，采用Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱，以乙腈-乙酸銨緩沖液（5 mmol/L）為流動相，在ESI正離子模式下檢測。通過對36批次孔雀石綠和46批次無色孔雀石綠加標(biāo)回收率測試，經(jīng)過數(shù)理統(tǒng)計(jì)，繪制孔雀石綠和無色孔雀石綠的回收率質(zhì)量控制圖，得出孔雀石綠的行動限為71.8%～121.9%，警告限為80.2%～113.6%；無色孔雀石綠的行動限為79.5%～129.0%，警告限為87.8%～120.7%。結(jié)果表明，質(zhì)量控制圖能直觀有效地反映UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和無色孔雀石綠的分析質(zhì)量變化趨勢，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞 優(yōu)化；控制圖；孔雀石綠；水產(chǎn)品；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號 TS207.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）20-0240-04

Application of Control Chart in Determination of Malachite Green Residues in Aquatic Products by UPLC-MS/MS

NI Jian-xiu CHEN Tao CHEN Gui-fang

（Nanjing Agricultural Products Quality Inspection of Jiangsu Province，Nanjing Jiangsu 210036）

Abstract A detection method of malachite green residues in aquatic products was established by UPLC-MS/MS，through the optimization of pretreatment extraction methods，and control chart was used.The samples were extracted with acetonitrile，purified by a solid-phase extraction column and concentrated，separated by using Zorbax Eclipse Plus C18 column with acetonitrile-ammonium acetate buffer（5 mmol/L） as the mobile phase and ESI positive ion mode detection.Recoveries of standard addition were tested for 36 batches of malachite green and 46 batches of leucomalachite green samples， and then mathematical statistics were used to work out the quality control chart，the action limits of malachite green were 71.8%-121.9%，the warning limits were 80.2%-113.6%；the action limits of leucomalachite green were 79.5%-129.0%，the warning limits were 87.8%-120.7%.It was indicated that the quality control chart could directly and effectively control the determination of malachite green in aquatic products with UPLC-MS/MS，and ensure the accurate and reliable detection result.

Key words optimization；control chart；malachite green；aquatic product；UPLC-MS/MS

孔雀石綠（malachite green，MG）是一種三苯甲烷型綠色染料，曾因其廉價(jià)、高效的殺菌、殺寄生蟲等性能而被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，由于沒有有效的替代品，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用屢禁不止?？兹甘G易被魚體吸收并快速代謝為無色孔雀石綠（leucomalachite green，LMG），無色孔雀石綠親脂性強(qiáng)，在水生生物體中殘留時(shí)間長，故水生生物體中的孔雀石綠殘留主要以無色孔雀石綠的形式存在，目前孔雀石綠及其代謝物檢測主要采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[1-4]、液相色譜-熒光法（HPLC-FLD）[5-6]、液相色譜-紫外法（HPLC-UVD）[7-8]等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理操作相對簡易，并且可同時(shí)進(jìn)行定性分析和定量分析，現(xiàn)被作為陽性樣品的確證方法。

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定孔雀石綠及其代謝物的回收率，對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，制作出水產(chǎn)品中孔雀石綠和無色孔雀石綠回收率質(zhì)量控制圖，對檢測系統(tǒng)實(shí)施有效內(nèi)部質(zhì)量控制，為準(zhǔn)確檢測孔雀石綠和無色孔雀石綠提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460C超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有ESI離子源，Agilent公司）；Avanti J-E離心機(jī)（美國貝克曼公司）；數(shù)顯型多管式漩渦混合器（美國Talboys公司）；BP211D電子天平，感量0.000 01 g（德國賽多利斯公司）；PL602E電子天平，感量0.01 g（瑞士梅特勒公司）；MV5全自動濃縮儀（美國萊伯泰科公司）；Synergy超純水儀（德國默克密理博公司）；0.45 μm GHP萬用膜針式過濾器（美國Pall公司）。endprint

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，純度98%（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；無色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，純度98.5%（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；同位素內(nèi)標(biāo)MG-D5，LMG-D6（WITEGA）；乙腈（色譜純，Tedia公司）；5 mol/L乙酸銨（Sigma-aldrich公司）；中性氧化鋁固相萃取小柱（1 g/3 mL，SUPELCO公司）。

準(zhǔn)確稱取適量的孔雀石綠及無色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再用流動相稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

試驗(yàn)中所采用的樣品為淡水產(chǎn)品取可食部分。用多功能攪拌料理機(jī)打成勻漿，放置-20 ℃冰箱中冷凍貯存，將其在室溫解凍后供前處理用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理。稱取5.00 g±0.02 g樣品于50 mL離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 mL乙腈，渦旋提取5 min，以6 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，離心管再次加入10 mL乙腈，渦旋提取5 min，以6 000 r/min離心5 min，上清液合并至另一離心管中，移取10 mL樣品溶液至用5 mL乙腈活化的中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45 ℃氮?dú)獯抵?.5 mL，用乙腈定容至1.0 mL，渦旋1 min，加入1.0 mL 5 mmol/L乙酸銨，渦旋1 min，樣液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

1.2.2 色譜與質(zhì)譜條件。①色譜條件。色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相，A為水（含5 mmol/L乙酸銨），B為乙腈；A相梯度洗脫，0—4 min為40%—15% 4—10 min為15%—5%，10—12 min為 5%—40%；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。②質(zhì)譜條件。電噴霧離子源ESI為正離子模式；霧化氣為氮?dú)?；離子噴霧電壓4 000 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速11 L/min；霧化氣壓力0.31 MPa，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取、凈化和濃縮方式的優(yōu)化

《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 19857—2005）[9]方法中需要加入提取液乙腈22 mL，定容至25 mL，而本方法加入乙腈20 mL，無需定容步驟，操作簡單；GB/T 19857—2005方法中凈化需要4 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，而本方法中無需該步驟，節(jié)約試劑用量；GB/T 19857—2005方法中用KD濃縮瓶接受固相萃取洗脫液，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL。

本方法中應(yīng)用15 mL玻璃離心管接收固相萃取洗脫液，應(yīng)用MV5全自動濃縮儀進(jìn)行濃縮，相對于傳統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而言，具有溶劑揮發(fā)平穩(wěn)、能同時(shí)濃縮54個(gè)樣品、批量效率高、節(jié)約時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)（表1），又能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性（表2、3）。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧質(zhì)譜、正離子監(jiān)測模式下，分別對毛細(xì)管電壓、碰撞能量和選擇離子等進(jìn)行優(yōu)化，選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高的2個(gè)子離子作為定量和定性離子，并確定最佳碰撞能量的電壓值。最終所選擇的母離子、子離子和碰撞能量等參數(shù)見表4、圖1～4。

2.3 線性范圍、檢出限及定量限

精確量取100 ng/mL孔雀石綠和無色孔雀石綠混合工作液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10.0、20.0 ng/mL的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng/mL，以分析物的相對響應(yīng)值（分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比）為縱坐標(biāo)，相對濃度（分析物與內(nèi)標(biāo)的濃度比）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，孔雀石綠和無色孔雀石綠在0.5～20.0 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（圖5、6）。

試驗(yàn)采用向空白中添加孔雀石綠的方法，依據(jù)定性、定量離子色譜峰的信噪比S/N≥3為檢出限、S/N≥10為定量限，則該方法的檢出限為0.2 μg/kg、定量限為0.5 μg/kg。

2.4 數(shù)據(jù)收集與處理

常使用孔雀石綠和無色孔雀石綠加標(biāo)回收率試驗(yàn)作為常規(guī)測定的質(zhì)量監(jiān)控手段。每測定10個(gè)樣品的同時(shí)檢測空白樣品和加標(biāo)質(zhì)控樣品，計(jì)算回收率。共收集2015年3月至2017年3月期間的36組孔雀石綠和46組無色孔雀石綠質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算出36組孔雀石綠和46組無色孔雀石綠的回收率（表5、6）。以此為基礎(chǔ)，計(jì)算回收率平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差S，然后計(jì)算上下行動限X±3S、上下警告限X±2S和上下輔助限X±S[10]（表7、8）。

2.5 控制圖的繪制

在Excel中錄入表5～7的數(shù)據(jù)，繪制孔雀石綠和無色孔雀石綠回收率控制圖，見圖7、8。由圖7可知，孔雀石綠回收率行動限范圍為71.8%～121.9%，警告限為80.2%～113.6%。所有控制值均落在上下警告限范圍內(nèi)，各控制值數(shù)據(jù)是隨機(jī)排列，沒有連續(xù)7個(gè)控制值遞增或遞減，第7～16批次共計(jì)10個(gè)連續(xù)控制值落在中位線同一側(cè)，屬于方法受控但統(tǒng)計(jì)失控[10]，但大多數(shù)控制值離中位線較近，且16批次之后的控制值分布在中位線兩側(cè)，說明該控制圖可以用于孔雀石綠測定的日常質(zhì)量監(jiān)控。由圖8可知，無色孔雀石綠回收率行動限范圍為79.5%～129.0%，警告限為87.8%～120.7%。所有控制值均落在警告限之內(nèi)，屬于方法受控[10]，說明該控制圖可以用于無色孔雀石綠測定的日常質(zhì)量監(jiān)控。

3 結(jié)論與討論

如控制值落在警告限之內(nèi)，或控制值在警告限與行動限之間，但前2個(gè)控制值在警告限之內(nèi)，則檢驗(yàn)過程處于方法受控狀態(tài)，可以報(bào)告分析結(jié)果。如果所有控制值落在警告限之內(nèi)（最后3個(gè)控制值中最多有1個(gè)落在警告限和行動限之間），且連續(xù)7個(gè)控制值單調(diào)上升或下降，或連續(xù)11個(gè)控制值中有10個(gè)落在中位線的同一側(cè)，則可以報(bào)告分析結(jié)果，但問題可能在發(fā)展。應(yīng)盡早發(fā)現(xiàn)重要的變化趨勢，以避免將來發(fā)生嚴(yán)重的問題。endprint

方法失控的判斷原則[10]：控制值落在行動限之外，或控制值落在警告限和行動限之間，且前2個(gè)控制值中至少有1個(gè)落在警告限和行動限之間，在這種情況下，不得報(bào)告分析結(jié)果。所有在上一個(gè)受控的控制值之后分析的樣品均應(yīng)重新分析。失控后首先排除存在粗大誤差，方法是在與分析該批樣品完全相同的條件下，嚴(yán)格按照分析方法重新分析控制樣品。如果新的控制值受控，可以認(rèn)為前次分析未嚴(yán)格按分析方法進(jìn)行，或者發(fā)生了粗大誤差，可以重新分析整個(gè)分析批；如果新的控制值仍然失控但可重復(fù)，則說明極有可能存在系統(tǒng)誤差。

為了檢查孔雀石綠檢測的系統(tǒng)誤差，可以分析不同類型的能夠監(jiān)控分析程序正確度的控制樣品，如標(biāo)準(zhǔn)溶液、至少含定量限濃度和高濃度的加標(biāo)樣品各1個(gè)、空白樣品、對存留樣品進(jìn)行再檢驗(yàn)檢測、使用不同方法進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)檢測等。在檢查確認(rèn)存在系統(tǒng)誤差的情況下，應(yīng)逐個(gè)步驟進(jìn)行檢查以找出導(dǎo)致偏倚的原因，如變換乙腈等試劑、變換生產(chǎn)廠家或批次的固相萃取小柱、變換針式過濾器材質(zhì)、變換設(shè)備和人員等。

控制圖是在穩(wěn)定狀態(tài)下繪制的，如果出現(xiàn)操作人員更換、

設(shè)備更新和改變方法參數(shù)等情況，必須重新繪制?？刂葡藓椭形痪€應(yīng)每年或每新增20個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)后評估1次，在精密度或偏倚發(fā)生顯著變化的情況下應(yīng)考慮改變控制限。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用LC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量相對穩(wěn)定，建議使用固定的控制限，根據(jù)1年以上且不少于60個(gè)控制值來計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，這樣可更真實(shí)地反映檢測體系變化趨勢，從而有效地監(jiān)控檢測系統(tǒng)，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理和控制提供依據(jù)，確保檢測過程持續(xù)受控和檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

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