李福帥，李國峰，張 璐，王麒雄， 戴 博，王占一

（1. 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東棗莊 277160；2. 空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取長紅棗多糖及其抗氧化活性

李福帥1，李國峰1，張 璐1，王麒雄1， 戴 博2，*王占一1

（1. 棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東棗莊 277160；2. 空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142）

以魯南地區(qū)長紅棗為原料，長紅棗多糖得率為考查指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出長紅棗多糖最佳的提取工藝條件為料液比1∶16（g∶mL），超聲溫度50 ℃，超聲時間30 min；在此條件下，長紅棗多糖得率達(dá)15.12%。采用·O2-，·OH和NO2-的清除試驗(yàn)，研究了長紅棗多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，當(dāng)長紅棗多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，對·OH和·O2-清除率分別達(dá)到53%和56%；在pH值2～3的酸性條件下，對NO2-清除率達(dá)40%以上。

長紅棗；多糖；超聲波輔助提??；響應(yīng)面優(yōu)化；抗氧化活性

（1. College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang， Shandong 277160， China；2. Department of Medicine Air Force General Hospital， Beijing 100142， China）

棗（ZiziphusjujubeMill.）是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物棗樹的果實(shí)，在我國有悠久的栽種歷史，被民間列入“五果”已久。而長紅棗作為魯南地方名產(chǎn)果品，因肉多核小、營養(yǎng)豐富、含糖量高，有著較高的滋補(bǔ)和藥用價值，被譽(yù)為“天然維生素丸”。長紅棗富含多糖、黃酮類化合物、香豆素等多種成分，其中尤以多糖活性最佳。長紅棗多糖兼具治療肺熱咳嗽、化痰和影響淋巴細(xì)胞分裂過程等作用，在改善免疫力和抗衰老等方面具有潛在價值[1-2]。同時，長紅棗多糖可以清除體外多種功能因子[3]。依據(jù)黃杰等人[4-5]試驗(yàn)表明，超聲空化效應(yīng)可縮短提取時間，但沒有探究長紅棗多糖提取的最佳優(yōu)化工藝。試驗(yàn)以魯南長紅棗為原料，采用超聲空化原理輔助提取長紅棗多糖，并通過體外抗氧化試驗(yàn)測定其抗氧化能力，為魯南地區(qū)長紅棗資源進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

長紅棗，采自魯南地區(qū)長紅棗培育園區(qū)；對氨基苯磺酸，無極宏通化工有限責(zé)任公司提供；鹽酸萘乙二胺，長沙市裕豐化玻器械有限公司提供；葡萄糖、三氯乙酸、鄰苯三酚、濃硫酸等，均為國產(chǎn)AR級。

SB25-12DTN型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；XFB-200型小型多功能粉碎機(jī)，永康市小寶電器有限公司產(chǎn)品；U-3900型紫外-可見分光光度計(jì)，日本日立公司產(chǎn)品；JA5003B型電子分析天平，上海精科儀器有限公司產(chǎn)品；RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；PHS-2F型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

（1） 長紅棗總糖測定依據(jù)苯酚-硫酸法[6]。精密稱量50 mg烘干至恒質(zhì)量葡萄糖，取水補(bǔ)至50 mL，量取10 mL移至100 mL容量瓶，定容即得0.1 mg/mL葡萄糖溶液，分別吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL至試管，純水補(bǔ)至1.0 mL，加6%苯酚（由80%苯酚現(xiàn)配） 1.0 mL和5.0 mL濃硫酸，于40 ℃條件下水浴30 min，放冷10 min后于波長490 nm處測量吸光度。

苯酚-硫酸法得標(biāo)準(zhǔn)試液質(zhì)量濃度X（mg/mL）與吸光度Y回歸方程為：Y=71.08X+0.008 6，R2=0.999 3， 總糖質(zhì)量濃度范圍為0～10 μg/mg。

（2） 長紅棗還原糖測定依據(jù)3,5 -二硝基水楊酸（DNS） 法[7]。配制0.5 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0， 0.3，0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8，0.9 mL至試管，純水補(bǔ)至1.0 mL，添加2.0 mL DNS顯色劑，開水中水浴5 min后，冷水沖至室溫，純水補(bǔ)至10.0 mL，于波長540 nm處測量吸光度。

DNS法標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程為：Y=16.664X-0.008 7， R2=0.999 5，還原糖質(zhì)量濃度為 0～45 μg/mg。

1.3.2 長紅棗多糖含量的測定[8]

將5 g長紅棗粉的提取液抽濾后減壓精煉定容至100 mL，制成供試液。吸取0.4 mL供試液定容在100 mL容量瓶中，以苯酚-硫酸法測得總糖，再吸取0.9 mL供試液補(bǔ)水至25 mL容量瓶，以DNS法測得還原糖，二者相減得多糖含量。公式如（1）：

式中：W——長紅棗多糖得率，%；

c——測定多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——供試液的體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——長紅棗多糖的質(zhì)量，g。

將凈制的長紅棗于烘箱中，于60 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，攤開晾涼，粉碎并過60目篩，長紅棗粉以石油醚為提取溶劑，應(yīng)用索氏提取器回流處理2次（第1次1.0 h，第2次0.5 h），脫脂[9-10]，脫脂后的粉末于通風(fēng)處自然陰干。將5 g處理后長紅棗粉置于150 mL錐形瓶中，封口膜密封，皮筋拴緊。調(diào)節(jié)超聲波提取器輸出功率為500 W，在設(shè)定溫度下反應(yīng)至設(shè)定的時刻，取出后抽濾，濃縮并定容。每70 mL粗多糖試液加10 g處理好的吸附樹脂于500 mL燒杯中，用磁力攪拌器攪動0.5 h（120 r/min），靜置1 h，脫色[11]，抽濾。處理液采用Sevage輔助酶法脫除雜蛋白[12]，重復(fù)脫雜2次，得脫蛋白液[13]。將所得的處理液中添加約3倍體積的無水乙醇，于4 ℃條件下靜置8 h，紗布濾得沉淀，冷凍干燥，得到粗多糖。

1.5.1 單因素試驗(yàn)

稱取粉碎至規(guī)定粒度的長紅棗干粉5 g，分別設(shè)定料液比 1∶8， 1∶12， 1∶16， 1∶20， 1∶24（固定超聲溫度50 ℃，超聲時間30 min），超聲時間20， 25，30，35， 40 min（固定料液比1∶16，超聲溫度50 ℃），超聲溫度30，40，50，60，70 ℃（固定料液比1∶16，超聲時間30 min），測定多糖得率，考查各個因素對于試驗(yàn)結(jié)果的作用。

1.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）3個因素作為考查對象，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)模型開展響應(yīng)面分析，獲取最適工藝參數(shù)。

響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計(jì)

1.6.1 溶液的配制

以長紅棗粗多糖為樣品，以VC為對照品。配制方法：精確稱取樣品及VC各0.2 g，分別用超純水補(bǔ)至100 mL，即配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的水溶液，然后依次倍數(shù)稀釋共得到6個質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別為 2， 1， 0.5， 0.25， 0.125， 0.062 5 mg/mL， 用于后續(xù)的抗氧化試驗(yàn)。

1.6.2 長紅棗多糖對O2-自由基清除力的測定

準(zhǔn)確移取5 mL Tris-HCl緩沖液（pH值8.2） 于10 mL具蓋刻度試管中，滴加對應(yīng)濃度的待測供試液，用超純水補(bǔ)至9.7 mL，于25 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min，移出后滴加同溫水浴的3 mmol/L鄰苯三酚試液0.3 mL，立刻振勻，移入比色皿中，以10 mmol/L的HCl作對照液，于波長325 nm處以30 s為一區(qū)間測吸光度A，共測5.5 min，制作吸光度A與作用時間t相關(guān)聯(lián)的線性圖。用超純水代替樣品液，所得的關(guān)聯(lián)圖中縱橫坐標(biāo)比值即為鄰苯三酚的自氧化速率V0[14]。

待測樣品清除·O2-的測定：由上述自氧化速率關(guān)聯(lián)圖，求出縱橫坐標(biāo)比值即為加入樣品后的自氧化速率Vt。以VC作為標(biāo)準(zhǔn)對照，按照公式（2） 計(jì)算紅棗多糖對·O2-的清除率[15]。

式中：Vt——樣品的自氧化速率；

V0——鄰苯三酚的自氧化速率。

1.6.3 長紅棗多糖對·OH清除率的測定

在10 mL具蓋刻度試管中滴加0.75 mmol/L鄰二氮菲試液1 mL，0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH值7.4）和超純水1 mL，振蕩混勻，滴加濃度為0.75 mmol/L的FeSO41 mL，振蕩搖勻后加入3%H2O21 mL啟動反應(yīng)，于37 ℃條件下保溫1 h，于波長511 nm處測定吸光度A1。將H2O2置換成樣品溶液1 mL，按前述流程測定A2。另取等同體積樣品液代替超純水，按前述流程測定A3。采用抗壞血酸對位對照，各組試驗(yàn)平行3次，按照公試（3） 計(jì)算結(jié)果并取平均值[16]。

式中：A1——不加樣品所測吸光度；

A2——不加H2O2所測吸光度；

A3——樣品液所測吸光度。

1.6.4 長紅棗多糖在體外模擬不同pH值胃環(huán)境對NO2-清除率的測定

（1） NO2-清除率的測定。配置25 μg/mL的多糖樣品液，并依據(jù)李志洲等人的方法測定NaNO2含量。NO2-清除率計(jì)算按公式（4）。

另取pH值2，3，4，5，6，7緩沖液配制的多糖溶液1.0 mL，每管滴加10 μg/mL NO2-對照液2 mL，以適宜pH值（即2，3，4，5，6，7） 的緩沖液補(bǔ)至相同體積（剩余步驟同上），作用10，20，30，40，

50，60 min后取出，測定對NO2-的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 不同料液比對長紅棗多糖得率的作用

料液比對長紅棗多糖得率的作用見圖1。

由圖1可知，長紅棗多糖得率伴隨料液比的減小而呈現(xiàn)出先增長后減少的趨向，在料液比1∶16處有明顯的峰值，即在一定范圍內(nèi)長紅棗得率達(dá)到最大值；當(dāng)料液比大于1∶16時，則長紅棗多糖得率顯著下降。這說明了在料液比達(dá)到1∶16后，再持續(xù)增加溶劑量不會持續(xù)增加多糖得率，相反呈現(xiàn)出多糖得率減少的情況。從試驗(yàn)工藝和經(jīng)濟(jì)成本考慮，確定料液比為1∶12 ～ 1∶20。

圖1 料液比對長紅棗多糖得率的作用

2.1.2 不同超聲溫度對長紅棗多糖得率的作用

超聲溫度對長紅棗多糖得率的作用見圖2。

圖2 超聲溫度對長紅棗多糖得率的作用

由圖2可知，當(dāng)超聲溫度較小時，伴隨超聲溫度的增大，長紅棗多糖得率提高；當(dāng)超聲溫度為50 ℃時，長紅棗多糖得率達(dá)峰值；大于50 ℃后，伴隨超聲溫度的提高，長紅棗多糖得率會下降?？赡艿脑蚴情L紅棗多糖在50 ℃時會局部產(chǎn)生糊化，以致長紅棗多糖得率降低。因此，確定超聲溫度為40～60 ℃。

2.1.3 不同超聲時間對長紅棗多糖得率的作用

超聲時間對長紅棗多糖得率的作用見圖3。

圖3 超聲時間對長紅棗多糖得率的作用

由圖3可知，在20～30 min范圍內(nèi)，伴隨超聲時間的增長，長紅棗多糖得率上升；30 min時，達(dá)最高值；30 min過后，長紅棗多糖得率降低。這說明長紅棗多糖得率與超聲時間緊密關(guān)聯(lián)，超聲時間少，多糖溶出的不完全；超聲時間過多，可能導(dǎo)致多糖構(gòu)造水解，并浪費(fèi)能量。因此，確定超聲時間為25～35 min。

2.2.1 回歸方程的建立及方差分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，以料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C） 為設(shè)計(jì)因素，以長紅棗多糖得率（Y） 為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件對三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，BBD設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design Expert V.8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件，對所得數(shù)據(jù)采取回歸分析，對3個因素?cái)M合，得到長紅棗多糖得率（Y） 的回歸方程為：

對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以看出，整個回歸模型極顯著 （p=0.001 8＜0.01）， R2=0.938 8； 失擬性檢驗(yàn)不顯著（p=0.092 0＞0.05），說明該模型的擬合性較好，用于長紅棗多糖的提取試驗(yàn)是可行的。其中，一次項(xiàng)B，二次項(xiàng)及A2，B2，C2對長紅棗多糖得率響應(yīng)值影響均極顯著；一次項(xiàng)C，交互相AC，BC對長紅棗多糖得率響應(yīng)值影響均顯著；各因素對多糖得率影響順序?yàn)槌暅囟龋境晻r間＞料液比。

表3 BBD設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面圖和等高線圖是響應(yīng)值對試驗(yàn)因素A，B，C所組成的三維空間曲面立體圖，從響應(yīng)面圖中可以直觀的看出各個試驗(yàn)因素及兩兩因素之間的交互作用對響應(yīng)面值的影響。

各因素交互作用對長紅棗多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線見圖4。

圖4 各因素交互作用對長紅棗多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線

由圖4（a） 可知，等高線圖中超聲溫度的等高線比料液比密集，超聲溫度比料液比對長紅棗多糖得率的作用大；從曲面圖可以看出，當(dāng)超聲溫度一定時，伴隨料液比的提高，長紅棗多糖得率呈現(xiàn)先增長后降低的趨向，而且增長趨向平緩，降低的趨向陡峭。這可能由于料液比提高會使料液變稀薄，增大了料液濃度差，從而減小了多糖溶出阻力，利于多糖提取，但過高的料液比使料液過度稀薄，可能引起后續(xù)試驗(yàn)中多糖的破損。

由圖4（b） 可知，等高線圖中超聲時間的等高線比料液比密集，超聲時間比料液比對長紅棗多糖得率的影響大。當(dāng)料液比到達(dá)一恒定值時，長紅棗多糖得率也呈先增長后降低的趨向。

由圖4（c） 可知，等高線圖中超聲溫度的等高線比超聲時間密集，伴隨超聲時間的改變，長紅棗多糖得率先升高后降低。超聲作用時間過長對多糖也有一定的分解作用，即超聲時間越久多糖得率不一定越大。當(dāng)超聲時間一定時，隨著超聲溫度的提高，長紅棗多糖得率也呈先增長后降低的趨向，這是由于升高溫度有促于長紅棗粉溶脹充分，加快了多糖分子傳質(zhì)過程和溶散速度，但溫度偏高可能導(dǎo)致多糖裂解而被破壞。

2.2.3 多糖提取工藝的驗(yàn)證結(jié)果

應(yīng)用Design Expert V.8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件，通過響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測最優(yōu)值，得到最佳工藝參數(shù)為料液比1∶17.4（g∶mL），超聲溫度55.6 ℃，超聲時間32.1 min，在此優(yōu)化工藝前提下長紅棗多糖得率為14.32%。因?yàn)樵囼?yàn)因素的限制，為了便于可行，將最優(yōu)條件工藝修正為料液比1∶17（g∶mL），超聲溫度56 ℃，超聲時間32 min，采取3次平均試驗(yàn)測得長紅棗多糖平均得率為14.23%，說明該提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化條件試驗(yàn)結(jié)果可靠，可重復(fù)性好。

2.3.1 長紅棗多糖對O2-自由基清除能力的測定結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·O2-的清除作用見圖5。

圖5 不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·O2-的清除作用

由圖5可知，長紅棗多糖和VC對·O2-均有一定的清除作用，并且清除率隨供試液質(zhì)量濃度的提高逐漸增長。在質(zhì)量濃度為0～0.25 mg/mL時，長紅棗多糖和VC對·O2-清除率隨供試液質(zhì)量濃度的提高上升不太明顯；在質(zhì)量濃度為0.25～4.00 mg/mL時，VC對·O2-的清除率高達(dá)89%，長紅棗多糖對·O2-的清除率僅為56%，說明長紅棗多糖對·O2-有一定的清除作用，但其去除效果比同質(zhì)量濃度的VC低。

2.3.2 長紅棗多糖對·OH清除能力的測定結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·OH的清除作用見圖6。

圖6 不同質(zhì)量濃度的長紅棗多糖溶液與VC對·OH的清除作用

由圖6可知，長紅棗多糖和VC對·OH 均有一定的清除作用，并且清除率隨供試液質(zhì)量濃度的增高而逐漸增長。當(dāng)長紅棗多糖質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時，其抗氧化水平與VC幾乎相近；大于此值后，VC對·OH的清除率明顯高于長紅棗多糖，說明長紅棗多糖對·OH有一定的清除作用，但其清除效果低于同質(zhì)量濃度的VC。

2.3.3 不同pH值下長紅棗多糖對NO2-清除率的測定結(jié)果

不同pH值下長紅棗多糖對NO2-的清除作用見圖7。

圖7 不同pH值下長紅棗多糖對NO2-的清除作用

由圖7可知，在pH值2～3的環(huán)境下，多糖試液對NO2-的清除率在18 min時達(dá)到最高值（為50%），在40 min后變化程度不是很大，清除率在43%處浮動；在pH值4～5的環(huán)境下，多糖試液對NO2-的清除率在50 min后趨于穩(wěn)定，清除率在36%前后浮動；在pH值7的環(huán)境下，多糖試液對NO2-的清除率在30 min時達(dá)最高值，此后伴隨反應(yīng)時間的進(jìn)行在30%前后浮動。結(jié)果表明，在pH值2～5環(huán)境下，多糖試液對NO2-的清除率高于pH值6～7環(huán)境處。說明在酸性環(huán)境下，長紅棗多糖富有良好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以單因素分析考查試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助提取長紅棗多糖的最佳參數(shù)。結(jié)果表明，在料液比1∶17（g∶mL），超聲溫度56 ℃，超聲時間32 min試驗(yàn)前提下，長紅棗多糖得率為14.23%，與預(yù)測值接近。長紅棗多糖具有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力隨供試液質(zhì)量濃度的升高而升高。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL，對·OH的清除率為53%，對·O2-的抑制率為56%。在體外模擬不同pH值的胃環(huán)境清除NO2-試驗(yàn)中，在pH值2～3環(huán)境下，長紅棗多糖對NO2-的清除率接近50%。試驗(yàn)結(jié)果為長紅棗多糖提取的工藝放大提供了理論依據(jù)，也為魯南地區(qū)長紅棗資源的開發(fā)利用提供了廣闊空間。

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R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.002

1671-9646（2017） 10a-0005-06

2017-08-07

李福帥（1995— ），男，在讀本科，研究方向?yàn)橹扑幑こ獭?/p>

*通訊作者：王占一（1980— ），男，碩士，講師，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞痔崛∨c分離。