魯 洋 吉春粉 顧 琪 史明基

（1.江蘇省興化市合陳畜牧獸醫(yī)站，江蘇興化225700；2.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站，江蘇興化225700；3.興化市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇興化225700）

興化地區(qū)小鵝瘟疫情的監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)室診斷

魯 洋1吉春粉1顧 琪2史明基3

（1.江蘇省興化市合陳畜牧獸醫(yī)站，江蘇興化225700；2.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站，江蘇興化225700；3.興化市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇興化225700）

對(duì)興化地區(qū)從2007年4月至5月間小鵝瘟的流行情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，在整個(gè)監(jiān)測(cè)期內(nèi)共收集到疑似小鵝瘟臨床病例3個(gè)，對(duì)3個(gè)病例分別采集肝、脾、腎等病料組織，處理后接種12日齡發(fā)育鵝胚，所有接種胚均于72～84h內(nèi)死亡，死亡胚的病變特征與小鵝瘟病毒致死鵝胚的特征相符。提取死亡胚尿囊液總DNA，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，所有樣品均可擴(kuò)增出大小為2200bp的目的條帶，與小鵝瘟弱毒疫苗SYG26-35株擴(kuò)增結(jié)果一致，從而將3個(gè)臨床病例確診為小鵝瘟。

小鵝瘟 監(jiān)測(cè) 實(shí)驗(yàn)室診斷

興化市地處長(zhǎng)江三角洲，水資源十分豐富。該地區(qū)的水禽養(yǎng)殖發(fā)展十分迅速，已形成一系列具有特色的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)。周邊的相鄰地區(qū)的水禽養(yǎng)殖發(fā)展也十分迅速，成為當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)民增收的一大亮點(diǎn)。興化市共有孵坊37家，其中孵化苗鵝的有26家，種蛋主要來自昆山、浙江以及興化本地，苗鵝主要售往南通、揚(yáng)州、昆山、連云港、安徽等地，本地也有一部分。2015年4月～2016年5月間，有孵坊反映苗鵝發(fā)生了大批量死亡，發(fā)生問題的孵坊有13家。發(fā)病情況基本一致，苗鵝在4～10日齡期間發(fā)生疫病，病程6d左右，發(fā)病率50%～80%，死亡率40%～70%。發(fā)病鵝表現(xiàn)為精神委頓，厭食，拉白色或淡黃綠色稀糞，喙端顏色發(fā)暗，臨死前出現(xiàn)兩腿麻痹。病死鵝剖檢病變?yōu)楦闻K略腫大，顏色較淡，空腸和回腸表現(xiàn)為卡他性腸炎。所有發(fā)病鵝群其種蛋來源均有一個(gè)共同特征，即母鵝免疫接種所用的疫苗均為吉林生物制品廠的疫苗（G D株），而同期使用揚(yáng)州威克生物制品有限公司生產(chǎn)的小鵝瘟活疫苗（種鵝用）的母鵝所產(chǎn)的種蛋孵化出的雛鵝均未見發(fā)病。據(jù)孵坊反映在湖州、嘉興也有類似情況發(fā)生。為了防止該病在2017年度再次發(fā)生，興化市畜牧獸醫(yī)站除對(duì)免疫用疫苗進(jìn)行調(diào)整以外，還制定了針對(duì)該地區(qū)重點(diǎn)養(yǎng)殖戶的疫情監(jiān)測(cè)計(jì)劃，本文的主要研究?jī)?nèi)容正是結(jié)合該監(jiān)控計(jì)劃，從該地區(qū)收集疑似小鵝瘟臨床病例，并通過實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行確診，以期為該地區(qū)的小鵝瘟的防控提供必需的疫情信息。

1 材料與方法

1.1 12日齡非免疫種鵝胚

選用未接種小鵝瘟疫苗的種鵝群所產(chǎn)的種蛋，自行孵化至12日齡。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

GPV特異性PCR引物按照文獻(xiàn)[7]方法設(shè)計(jì)，針對(duì)的靶基因?yàn)閂P1，可用于擴(kuò)增全長(zhǎng)V P1基因，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為2200bp。引物序列為：GPV-F：5'-GCAGATATGTCTACTTTTTTAG-3'；GPV-R：5'-AATTTACAGATTTTGAGT -3'。引物由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成，用滅菌超純水稀釋至25μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為了實(shí)現(xiàn)擺桿角度和小車位移的高精度控制，對(duì)倒立擺角度的控制同時(shí)要兼顧對(duì)小車位移的控制，假定系統(tǒng)的補(bǔ)償輸入是以小車位移為輸入通過兩個(gè)相同的改進(jìn)型ESO的擾動(dòng)作用之和來進(jìn)行補(bǔ)償，所設(shè)計(jì)的改進(jìn)型ADRC結(jié)構(gòu)如圖2所示。

1.3 生化試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Wide Range DNA Marker（500～12000bp）購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；蛋白酶K購(gòu)自MERCK公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）購(gòu)自Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4 主要儀器

在整個(gè)小鵝瘟疫情高發(fā)季節(jié)（2016年4月～5月），總共發(fā)現(xiàn)3例疑似小鵝瘟病例（分別命名為樣品1、樣品2和樣品3），且3批發(fā)病雛鵝均來源于同一孵坊。

1.5 疫病監(jiān)測(cè)與樣品采集和處理

取收獲的鵝胚尿囊液500μl，加入蛋白酶K至終濃度為500μg/mL，加入SDS至終濃為1%，充分混勻后，置55℃水浴作用30min。然后分別用Tris飽和酚（pH8.0）、苯酚：氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，吸取水相，加1/10體積3mol/LNaAc（pH5.2）及2.5倍體積無水乙醇沉淀，置-20℃10min。12000 rpm離心15min，沉淀用70%乙醇洗滌，晾干后懸浮于30μl含RNaseA（20μg/mL）、無DNase的TE（pH8.0）中。同時(shí)提取小鵝瘟疫苗毒株SYG26-35含毒尿囊液和健康鵝胚尿囊液DNA分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照[7]。

1.6 病毒分離

PCR反應(yīng)體系（50μl）為：

1.7 PCR檢測(cè)

1.7.1 PCR模板DNA的制備

對(duì)所有臨床發(fā)現(xiàn)的小鵝瘟疑似病例，均無菌采集發(fā)病鵝肝、脾、腎，用滅菌生理鹽水按1：10比例勻漿，-20℃與37℃反復(fù)凍融3次，3000 r/min離心10min取上清，加入雙抗溶液（含青、鏈霉素各10000μg/ml）進(jìn)行除菌處理[6]。

1.7.2 PCR反應(yīng)

將處理好的病料按0.3ml/胚的量接種13日齡鵝胚，37℃繼續(xù)孵化，每日照胚3～4次，死亡鵝胚置4℃冰箱4h左右收縮血管，無菌收集尿囊液[5]。

超純水 37.5μL10×Reaction buffer（with15mmol/L MgCl2） 5.0μLdNTPs（2.5mmol/L） 4.0μL引物GPV-F（25μmol/L） 0.5μL引物GPV-R（25μmol/L） 0.5μL DNA模板 2.0μL Taq DNA聚合酶 0.5μL

PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性1min→50℃退火1min→72℃延伸2.5min，共30次循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存[6]。

取PCR產(chǎn)物5μl，加6×上樣緩沖液1μl混勻，1.2%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠0.5μg/ml）電泳，于0.5×T B E電泳緩沖液80 V電泳1h觀察結(jié)果。

1.7.3 瓊脂糖凝膠電泳

本文以南通藍(lán)印花布的數(shù)字化紋樣圖像為研究對(duì)象，通過數(shù)碼相機(jī)等設(shè)備為其進(jìn)行數(shù)字化圖像的采集。另外，針對(duì)藍(lán)白兩色的藍(lán)印花布這一特點(diǎn)，對(duì)其數(shù)字化圖像進(jìn)行相關(guān)預(yù)處理，包括灰度化、中值濾波去噪和歸一化等操作；經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)后，確定采用加權(quán)值法與最大值法結(jié)合的灰度化處理來處理，其公式如下所示：

性狀:較正品大,呈寬卵形,長(zhǎng)5-6mm,寬5-8mm,表面淡黃白色,略光滑,一端圓闊,有一淡棕色點(diǎn)狀種臍,另端稍窄。背面圓凸;腹面有一條較寬而深的縱溝。[13]

2 結(jié)果

2.1 小鵝瘟疫情監(jiān)測(cè)結(jié)果

臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL-16型）為上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品；PCR儀（2400型）為美國(guó)Applied Biosystem 公司產(chǎn)品；BIORAD3000 XI型電泳儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；Millipore純水儀Milli-Q（低熱源型）為法國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；20μl及200μlGilson移液器為法國(guó)Gilson 公司產(chǎn)品。

3.2 地草地螟、蚜蟲防治：用20%殺滅菊酯乳油2000倍液～3000倍液，或2.5%敵殺死乳油倍液2500倍液～3000倍液，或2.5%功夫乳油2500倍液～3000倍液均勻噴霧。

2.2 病毒分離結(jié)果

病料接種后72-84h鵝胚死亡，死亡胚的病變特征為絨尿膜增厚，全身皮膚充血，翅尖、趾、胸部毛孔、頸、喙旁均有較嚴(yán)重出血點(diǎn)。

2.3 PCR試驗(yàn)結(jié)果

電泳結(jié)果顯示S YG26-35疫苗毒和病料接種收獲的尿囊液均可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的2200 b p的目的條帶，而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶，結(jié)果如圖1所示。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果M. Wide Range DNA Marker

3 討論

小鵝瘟主要侵害的是4～20日齡的雛鵝，自然條件下成年鵝的感染是無癥狀的，但可經(jīng)卵將病傳給下一代，而且該病在鵝群中的發(fā)病主要集中于3周齡以內(nèi)的雛鵝。根據(jù)這一特點(diǎn)，對(duì)留種母鵝進(jìn)行免疫接種是防治該病最有效的辦法，可以保證新生雛鵝在出殼后的一段時(shí)間內(nèi)能夠保持較高的母源抗體水平，幫助其度過最易感的年齡階段。在這種情況之下，種鵝的免疫效果直接決定了雛鵝群中該病的防治效果。在興化地區(qū)2015年的小鵝瘟疫清的流行中，其發(fā)生的原因可能就是與疫苗的質(zhì)量有直接的關(guān)系，因?yàn)橥谑褂脫P(yáng)州威克生物制品有限公司生產(chǎn)的小鵝瘟活疫苗（種鵝用）的母鵝所產(chǎn)的種蛋孵化出的雛鵝均未見發(fā)病。當(dāng)然，疫苗免疫失敗除了疫苗本身的原因外，疫苗的保存不當(dāng)也會(huì)造成疫苗的失效，從而影響免疫效果。在2017年度的防控計(jì)劃中，全部改用了揚(yáng)州威克生物制品有限公司生產(chǎn)的小鵝瘟活疫苗（S YG26-35株），同時(shí)在生產(chǎn)季節(jié)到來之前對(duì)2016年污染比較嚴(yán)重的孵坊進(jìn)行徹底消毒。從疫情監(jiān)測(cè)的結(jié)果看，疫情得到了很好的控制，在兩個(gè)月的監(jiān)測(cè)期中只發(fā)現(xiàn)了3起小鵝瘟病例。在發(fā)現(xiàn)的病例中，雛鵝均來源于同一孵坊，提示可能是由于孵坊污染GPV所致，因?yàn)樵摬《緦?duì)環(huán)境的抵抗力相當(dāng)強(qiáng)，污染之后清除的難度比較大，可能是導(dǎo)致消毒不徹底的原因。

[1]賈月樓.一起小鵝瘟疫情的實(shí)驗(yàn)室診斷[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2011，7（11）：141-142.

[2]劉兵.小鵝瘟細(xì)胞適應(yīng)毒的培育及其特性的研究[D].揚(yáng)州大學(xué)，2012.