韓 雪

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730030;2.清水鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅岷縣 745400)

單味中草藥對(duì)仔豬致病性大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)

韓 雪

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730030;2.清水鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅岷縣 745400)

為了篩選出對(duì)仔豬致病性大腸桿菌流行株體外抑菌活性強(qiáng)的單味中草藥,本實(shí)驗(yàn)用水提法制備復(fù)方中草藥藥液,濃度為1g/mL;利用平板打孔法和試管二倍稀釋法分別測(cè)定單味中草藥抑菌圈直徑大小和最小抑菌濃度(MIC)。

藥物;大腸桿菌

豬腹瀉是由具有特定血清型的大腸桿菌引起的。致病性大腸桿菌病因年齡的不同而表現(xiàn)出不同的差異，根據(jù)研究，這種差異與仔豬腸道黏膜上皮細(xì)胞的受體的表達(dá)水平有關(guān)，而這種差異的表現(xiàn)在豬發(fā)病日齡和發(fā)病特征上，例如 1 周齡以內(nèi)的仔豬易患仔豬黃痢，10～30 日齡的豬易患仔豬白痢，在斷奶前后的仔豬最易患水腫病。大腸桿菌引起豬腹瀉的機(jī)理還與致病性大腸桿菌的存在有一個(gè)或更多的菌毛有關(guān)，是導(dǎo)致仔豬腹瀉的一個(gè)前提條件就是菌毛與腸道內(nèi)的受體結(jié)合，所以，我們把菌毛也叫做粘附素（adh esin）或定居因子（Colonization factor，CF），菌毛的生物學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，是引起仔豬腹瀉主要的致病機(jī)理。

中草藥富含多種抑菌的化學(xué)活性物質(zhì)，不僅對(duì)E.coli具有直接或者間接的殺滅作用，還可以清除內(nèi)毒素和消除E.coli菌耐藥質(zhì)粒，降低其耐藥性，在國(guó)內(nèi)中草藥防治雞、豬源大腸桿菌病的研究相對(duì)較多，被廣泛應(yīng)用與豬源大腸桿菌病的防治中。

1 單味中草藥藥液的制備

用水提法提取中藥的有效成分，將12味中藥烘干，各取50g，加入5～10倍蒸餾水浸泡2h，煮開后慢火煮30min左右，12層紗布過濾，用同樣方法再煮一次，過濾，合并2次煮的藥液進(jìn)行濃縮，濃度的濃度為1g/mL，離心后，調(diào)整pH值為7.2～7.3，121℃高壓滅，15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 大腸桿菌菌液的制備

取出仔豬致病性大腸桿菌的菌種，室溫解凍后，接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12h后，挑單菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h，利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)該菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整仔豬致病性大腸桿菌終濃度為108CFU/ml。

3 單味中草藥抑菌圈直徑的測(cè)定與結(jié)果

利用平板打孔法測(cè)定中藥水提物抑菌圈直徑大小，取仔豬致病性大腸桿菌0.1ml（108CFU/ml）涂布在平板，在超凈工作臺(tái)中待完全吸收后，取無菌的牛津杯放在普通培養(yǎng)平板上，加滿藥液，靜置0.5h后，置37℃培養(yǎng)12h，每一種藥物做3個(gè)重復(fù)，取平均值；判定標(biāo)準(zhǔn)為：10mm＜抑菌直徑為低敏，10mm≤抑菌直徑＜15mm為中敏，15mm≤抑菌直徑＜20mm為高敏，20mm≤抑菌直徑為極敏。由表1可知，仔豬致病性大腸桿菌對(duì)金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參5味單味中藥高度敏感，抑菌圈直徑分別為在19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm；對(duì)板藍(lán)根、白頭翁、連翹、五倍子4種3種藥物中度敏感，抑菌圈直徑分別為14.7 mm、13.6 mm、15.4 mm、12.1 mm；對(duì)秦皮、蒲公英2種藥物低敏，抑菌圈直徑在分別為8.5mm、9.2mm；仔豬致病性大腸桿菌對(duì)敗醬草無明顯作用。

4 單味中草藥體外抑菌MlC的測(cè)定與結(jié)果

利用試管二倍稀釋法測(cè)定中藥水提物的最小殺菌濃度（MBC）[8]，取12只編號(hào)的滅菌的試管，每個(gè)試管中加入無菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯2mL，在第1管中加2ml中藥水提物混勻，取出2ml混合藥液放入第2管，依此類推，稀釋到第10管，棄去2ml，第11管為陽性對(duì)照，第12管為陰性對(duì)照。在1～11只管中加入菌液20μl（108CFU/ml），每一種藥物3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)18～24h后，將每個(gè)藥物不同濃度的培養(yǎng)物接種于普通培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18h。無細(xì)菌生長(zhǎng)中藥水提物濃度梯度為該藥的MBC。由表2可知，仔豬致病性大腸桿菌對(duì)金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參5味單味中藥高度敏感，體外抑菌MIC分別為7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml；對(duì)板藍(lán)根、白頭翁、連翹、五倍子4種藥物中度敏感，體外抑菌MIC分別為62.5 mg/ml、62.5 mg/ml、125 mg/ml、125 mg/ml；對(duì)秦皮、蒲公英2種藥物低敏，體外抑菌MIC分別為分別為250mg/ml、250mg/ml仔豬致病性大腸桿菌對(duì)敗醬草無明顯作用。

5 小結(jié)

豬腹瀉是由具有特定血清型的大腸桿菌引起的，感染不同階段的仔豬，會(huì)引發(fā)同的癥狀，仔豬因年齡的不同而表現(xiàn)出不同的病候，1 周齡以內(nèi)的仔豬易患仔豬黃痢，10～30 日齡的豬易患仔豬白痢，在斷奶前后的仔豬最易患水腫病，這3種病均是由仔豬的致病性大腸桿菌引起的來，仔豬的致病性大腸桿菌發(fā)病率和感染率均較高，該菌易產(chǎn)生耐藥性。本文利用平板打孔法和試管二倍稀釋法分別測(cè)定單味中草藥抑菌圈直徑大小和最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果顯示，篩選出來了對(duì)豬致病性大腸桿菌流行株高度敏感的5種種草喲，金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參；抑菌圈直徑分別為19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm；體外抑菌MIC分別為7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml；為進(jìn)一步研制復(fù)方中草藥防治仔豬致病性大腸桿菌病和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

表1 單味中草藥對(duì)仔豬致病性E.coli抑菌圈直徑結(jié)果（單位：mm）注“-”無敏感性

表2 單味中草藥對(duì)仔豬致病性E.coli抑菌圈MlC結(jié)果（單位：mg/ml）注“-”無敏感性

[1]向雙云，周珍輝，李玉冰，等.8種中草藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016，（5下）：167-169.