吳白雪 王 莎 秦光成 肖 垚 謝景梅 譚 戈 周冀英 陳力學(xué)Δ

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，重慶 400016；2重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

·論 著·

蛋白激酶C參與大鼠慢性偏頭痛中樞敏化*

吳白雪1王 莎1秦光成1肖 垚1謝景梅1譚 戈2周冀英2陳力學(xué)1Δ

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，重慶 400016；2重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

目的：本文旨在研究蛋白激酶C (PKC)是否通過中樞敏化參與慢性偏頭痛病理生理過程。方法：SD雄性大鼠隨機(jī)分為7組，假手術(shù)組(n= 11)，模型組 (n= 12)，模型+溶劑組(n= 8)，PKC抑制劑4 μg組(n= 11)，PKC抑制劑8 μg組(n= 10)，PKC激動(dòng)劑100 ng組(n= 10)，PKC激動(dòng)劑200 ng組(n= 11)?！把仔詼狈磸?fù)刺激硬腦膜，模擬硬腦膜痛覺感受器的反復(fù)激活，建立慢性偏頭痛大鼠模型，側(cè)腦室給予PKC抑制劑和PKC激動(dòng)劑，使用von Frey test測(cè)定大鼠面部及后足的機(jī)械痛閾值，Western blot 檢測(cè)PKC、CGRP、c-Fos蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：“炎性湯”反復(fù)刺激硬腦膜后，大鼠面部及足底的機(jī)械痛閾值顯著降低，而三叉神經(jīng)脊束尾核部位的CGRP、c-Fos及PKC蛋白表達(dá)顯著增加。使用CHE抑制PKC可以顯著增高大鼠面部及足底痛閾值，顯著降低CGRP、c-Fos的表達(dá)；而使用PMA激活PKC則降低痛閾值，顯著增高CGRP、c-Fos的表達(dá)。結(jié)論：本研究表明PKC可以調(diào)節(jié)機(jī)械痛閾值以及CGRP、c-Fos的表達(dá)變化，提示PKC參與慢性偏頭痛中樞敏化的病理生理過程。

蛋白激酶C；慢性偏頭痛；中樞敏化；三叉神經(jīng)脊束尾核

偏頭痛是一種臨床常見的反復(fù)發(fā)作原發(fā)性頭痛疾病，根據(jù)其發(fā)作頻率可分為發(fā)作性偏頭痛(episodic migraine, EM)和慢性偏頭痛(chronic migraine, CM)。慢性偏頭痛在普通人群中的患病率約為 2%，給患者和社會(huì)均帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已經(jīng)被 WHO列為四種最嚴(yán)重的慢性功能障礙性疾病之一[1]。然而目前尚無針對(duì)慢性偏頭痛的特效治療方法和根治手段，因此慢性偏頭痛的病理機(jī)制研究對(duì)于探尋新的治療方法至關(guān)重要。目前有許多研究表明中樞敏化(central sensitization)這一機(jī)制在慢性偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中起著尤為重要的作用[2～5]。偏頭痛中樞敏化主要是由三叉神經(jīng)脊束尾核(trigeminal nucleus caudalis, TNC)部位神經(jīng)元的興奮性異常增高引起，從而導(dǎo)致皮膚痛覺過敏(hyperalgesia )和痛覺超敏(cutaneous allodynia, CA)[6,7]。蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[8,9]，已有研究證實(shí)在疼痛的中樞調(diào)節(jié)中，PKC可能起著關(guān)鍵性的作用，抑制PKC可以改善中樞敏化，減輕痛覺過敏[9,10]。然而關(guān)于PKC是否參與慢性偏頭痛的中樞敏化機(jī)制，目前尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)參照Melo-Carrillo報(bào)道的方法建立大鼠慢性偏頭痛模型[11]，檢測(cè)TNC部位PKC的蛋白表達(dá)量，然后給予PKC的激動(dòng)劑Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)和抑制劑chelerythrine chloride (CHE)，應(yīng)用Von Frey test檢測(cè)面部和足底的機(jī)械痛閾值，Western blotting檢測(cè)TNC部位CGRP、c-Fos的蛋白表達(dá)水平，探討PKC在慢性偏頭痛的中樞敏化機(jī)制中的作用，以期待為慢性偏頭痛的防治提供新的靶點(diǎn)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí) SD 雄性大鼠（SPF）73只（體重250～300 g），由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（渝）2012-0001），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均置于22±2 ℃室溫，濕度50±5%以及12 h/12 h 晝夜明暗交替控光的環(huán)境中，自由攝食飲水。所有實(shí)驗(yàn)SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。本研究均遵守國際疼痛學(xué)會(huì)(IASP)相關(guān)指南，盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)目，盡量降低對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害，并經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可。

2.慢性偏頭痛中樞敏化模型的建立

參照 Melo-Carrillo等人的報(bào)道：通過“炎性湯”(inflammatory soup, IS)反復(fù)刺激硬腦膜建立慢性偏頭痛模型[11]。腹腔注射 10%的水合氯醛（i.p.0.4 g/kg體重）麻醉后，將大鼠固定于立體定位儀（美國 Stoelting公司）上，常規(guī)備皮、消毒。頭部正中切開約 1 cm的皮膚切口，鈍性分離皮下組織，3% H2O2處理顱骨表面，臺(tái)式顱骨鉆建立一個(gè)孔徑約1 mm 的顱骨窗，避免損傷硬腦膜。在骨窗安裝微量套管，使用自凝牙托粉和自凝牙托水固定，全層縫合皮膚，術(shù)后將大鼠置于37 ℃恒溫板，待蘇醒后送回飼養(yǎng)間，每只實(shí)驗(yàn)大鼠在同等條件下分籠飼養(yǎng)。術(shù)后1周后，選擇傷口未感染，恢復(fù)良好的SD大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分到不同的實(shí)驗(yàn)組。參照文獻(xiàn)報(bào)道的“炎癥湯”配方：組胺(1 mmol/L)、5-羥色胺(1 mmol/L)、緩激肽(1 mmol/L)和前列腺素E2（0.1 mmol/L）加入PBS緩沖液配制而成[11,12]。每日通過微螺旋定量推進(jìn)裝置勻速緩慢泵入2 μl“炎癥湯”滴注到硬腦膜表面，重復(fù)7天；Sham 組大鼠在同樣的時(shí)間給予PBS硬腦膜滴注。

3.側(cè)腦室注射

本實(shí)驗(yàn)使用的PKC抑制劑CHE (chelerythrine chloride, Abcam)及PKC激 動(dòng) 劑 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, Abcam)在既往文獻(xiàn)[12～17]中證實(shí)對(duì)PKC有明確的抑制或激動(dòng)作用，此次試驗(yàn)中CHE（10 mmol/L）及PMA（100 mmol/L）溶于DMSO，經(jīng)側(cè)腦室給藥，PKC抑制劑低劑量組給予CHE（4 μg/只），PKC抑制劑高劑量組給予CHE（8μg/只），PKC激動(dòng)劑低劑量組給予PMA（100 ng/只），PKC激動(dòng)劑高劑量組給予PMA（200 ng/只）。建模成功后（7次“炎性湯”滴注硬腦膜），麻醉好的SD 大鼠固定在立體定位儀上，常規(guī)消毒、備皮，切開皮下組織，止血鉗取出微量套管，3%H2O2處理顱骨表面，在前囟左側(cè)1.5 mm后方1 mm，顱骨鉆建立直徑約1 mm骨窗。微量注射器固定于立體定位儀上，將微量注射器的針頭從顱骨窗插入約 4 mm 到達(dá)側(cè)腦室后，勻速緩慢泵入藥物5 μl(10 min)。待藥物注射完成，留針 5 min 后拔出，用骨蠟封閉骨窗，縫合皮膚。SD大鼠置于 37 ℃恒溫板，蘇醒后送回飼養(yǎng)間。

4.機(jī)械痛閾值的測(cè)定

機(jī)械性痛閾值的測(cè)定參照Oshinsky報(bào)道的方法[18]。將實(shí)驗(yàn)SD大鼠置于22 cm×22 cm×30 cm的透明籠子中適應(yīng)10 min后，使用電子Von Frey痛閾儀(WoodLand Hills，CA，USA)測(cè)定大鼠面部、足底機(jī)械痛閾值。用痛閾儀的硬頭垂直輕觸大鼠面部或后爪的皮膚，大鼠頭部或后爪快速回縮，儀器自動(dòng)記錄痛閾值，每個(gè)部位測(cè) 3 次，然后取平均值作為該部位的疼閾值。每次給予炎性湯前測(cè)定其基礎(chǔ)痛閾值，以及給予PKC激動(dòng)劑和抑制劑24小時(shí)后，再次測(cè)定各組痛閾值的改變。

5.蛋白提取與蛋白水平檢測(cè)

將大鼠麻醉后斷頭取腦，取三叉神經(jīng)脊束尾核(TNC)組織，加入含有PMSF (Beyotime,China)和磷酸酶抑制劑(Boster, China)的RIPA緩沖液(Beyotime, China)，充分勻漿后置于4 ℃冰箱90 min，使其充分裂解，然后，將組織液放入低溫離心機(jī)離心(4 ℃，12 000 rpm, 20 min)，取上清液，用BCA試劑盒(Beyotime, China)測(cè)定蛋白濃度。待測(cè)樣品加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(Beyotime,China)，放入100 ℃沸水使其變性 5 min，冷卻后分裝。取50 μg/孔蛋白樣品上樣，10% SDS-PAGE膠(Beyotime，China)電泳分離后，電轉(zhuǎn)(250 mA)至PDVF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)。分別加入相應(yīng)一抗anti-PKC (1:1 000, Abcam)、anti-CGRP(1:2 000, abcam)和anti-c-Fos (1:500, Abcam) 4℃孵育過夜。第二日復(fù)溫2小時(shí)，TBST 漂洗 3 次，10 min/次。加入相應(yīng)濃度二抗（1:5 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，China）37 ℃孵育2小時(shí)。TBST 漂洗 3 次，10 min/次。采用ECL (Beyotime,China)試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)(Fusion, Germany)發(fā)光成像?；叶戎到Y(jié)果使用Fusion軟件分析。

6.數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料均以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間的均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independentsamples T test)，多組均值的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜ 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.“炎性湯”反復(fù)刺激硬腦膜后，大鼠面部及足底的機(jī)械痛閾值顯著降低，而三叉神經(jīng)脊束尾核部位CGRP、c-Fos及PKC的蛋白表達(dá)顯著增加

用電子Von Frey痛閾儀測(cè)定大鼠面部、足底機(jī)械痛閾值結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與給藥前的面部及足底基礎(chǔ)痛閾值 (7.25±0.35 g；15.90±0.44 g)比較，反復(fù)硬膜滴注PBS組大鼠機(jī)械痛閾值(7.75±0.30 g；15.00±0.34 g)無 明 顯 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 差 異 (P＞ 0.05)；而反復(fù)硬膜滴注IS組大鼠的面部及足底痛閾值(3.09±0.20 g；5.89±0.42 g)與 PBS組 的 痛 閾 值(7.75±0.30 g；15.00±0.34 g)相比，顯著下降(P＜0.05, 見圖 1、2)。Western blot結(jié)果顯示：硬膜外滴注7次“炎性湯”后，CM組大鼠TNC部位CGRP、c-Fos的蛋白表達(dá)較Sham組均顯著增高(P＜0.05)。以上結(jié)果表明反復(fù)硬膜外滴注炎性湯可以降低大鼠機(jī)械痛閾值，導(dǎo)致TNC部位CGRP、c-Fos表達(dá)增高，提示該模型成功模擬了慢性偏頭痛的中樞敏化機(jī)制。此外，CM組TNC部位PKC蛋白表達(dá)水平較Sham組亦顯著增高(P＜ 0.05)，該結(jié)果表明了PKC可能在慢性偏頭痛中起著重要作用。

圖1 兩組大鼠滴注不同IS/PBS次數(shù)的面部機(jī)械痛閾值的改變情況(n=16,±SEM)*P ＜ 0.05，與 PBS 組相比Fig.1 The change of mechanical threshold in face after IS/PBS infusion in each group (n=16,±SEM)* P ＜ 0.05, compared with PBS group

圖2 兩組大鼠滴注不同IS/PBS次數(shù)的足底機(jī)械痛閾值的改變情況(n=16,±SEM)*P ＜ 0.05，與 PBS 組相比Fig.2 The change of mechanical threshold in hindpaw after IS/PBS infusion in each group (n=16,±SEM)*P ＜ 0.05, compared with PBS group.

2.使用CHE抑制PKC可以顯著增高大鼠面部及足底痛閾值，而使用PMA激活PKC則降低大鼠面部及足底痛閾值

圖3 給予PKC抑制劑CHE后各組大鼠面部機(jī)械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05,與 CM+DMSO 組相比Fig.3 The comparison of mechanical threshold in face among different groups after administration of PKC inhibitor CHE*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05,compared with CM+DMSO group.

圖5 給予PKC抑制劑CHE后各組大鼠足底機(jī)械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與 Sham組相比； #P ＜ 0.05,與 CM+DMSO 組相比Fig.5 The comparison of mechanical threshold in hindpaw among different groups after administration of PKC inhibitor CHE*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

圖4 給予PKC激動(dòng)劑PMA后各組大鼠面部機(jī)械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與Sham 組相比； #P ＜ 0.05,與 CM+DMSO組相比Fig.4 The comparison of mechanical threshold in face among different groups after administration of PKC activator PMA*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

圖6 給予PKC激動(dòng)劑PMA后各組大鼠足底機(jī)械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05,與 CM+DMSO 組相比Fig.6 The comparison of mechanical threshold in hindpaw among different groups after administration of PKC activator PMA*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

與Sham組面部及足底機(jī)械痛閾值(8.97±0.50 g；17.02±0.82 g)比較，CM組(3.76±0.17 g；6.49±0.48 g)及 CM+DMSO 組 (3.45±0.28 g；5.05±0.48 g)機(jī)械痛閾值均顯著降低(P＜ 0.05)，而CM組與CM+DMSO組大鼠面部及足底痛閾值并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞ 0.05)，提示側(cè)腦室給予DMSO并不影響大鼠的機(jī)械痛閾值。給予PKC抑制劑CHE后，大鼠面部及足底機(jī)械痛閾值均顯著增高(P＜ 0.05)，但是，CHE高劑量組(6.38±0.38 g；10.36±0.75 g)與低劑量組(5.19±0.31 g；8.80±0.60 g)面部及足底機(jī)械痛閾值并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞ 0.05, 見圖3、4)，提示CHE改善痛覺過敏不成劑量依耐性。此外，給予PKC激動(dòng)劑PMA后，高、低劑量組大鼠面部機(jī)械痛閾值(2.14±0.17 g；2.03±0.13 g)均顯著降低(P＜ 0.05)，但是，PMA低劑量組(3.52±0.27 g)的大鼠足底痛閾值變化較CM組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而PMA高劑量組的足底痛閾值(3.22±0.23 g)則顯著下降(P＜ 0.05, 見圖5、6)，PMA高、低劑量組之間面部及足底機(jī)械痛閾值亦無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示PMA加重面部痛覺過敏不成劑量依賴性，以及高劑量的PMA可以降低大鼠足底的痛閾值。

3.使用CHE抑制PKC可以顯著降低CGRP、c-Fos的表達(dá)，而使用PMA激活PKC則顯著增高CGRP、c-Fos的表達(dá)

與Sham組相比，CM組TNC部位CGRP的表達(dá)顯著增高(P＜ 0.05)；給予PKC抑制劑CHE后，CGRP的表達(dá)顯著降低(P＜ 0.05)；而給予PKC激動(dòng)劑PMA后，CGRP的表達(dá)顯著增高(P＜ 0.05)。此外，與Sham組比較，CM組TNC部位c-Fos的表達(dá)量亦顯著增高(P＜ 0.05)；給予PKC的抑制劑CHE后，c-Fos的表達(dá)顯著降低(P＜ 0.05)；而給予PKC的激動(dòng)劑后，c-Fos的表達(dá)顯著增高 (P＜ 0.05, 見圖 7～9)。

圖7 兩組PKC蛋白表達(dá)量*P ＜ 0.05，與 Sham 組相比Fig.7 The comparison of PKC protein expression levels between two groups*P ＜ 0.05, compared with sham group.

討 論

每年大約有2%的發(fā)作性偏頭痛轉(zhuǎn)化為慢性偏頭痛[19]。慢性偏頭痛因?yàn)轭l繁和嚴(yán)重的頭痛發(fā)作影響患者的學(xué)習(xí)與工作能力、生活質(zhì)量, 給患者個(gè)人以及社會(huì)帶來了非常嚴(yán)重的危害。因此，治療及預(yù)防慢性偏頭痛是神經(jīng)病學(xué)的一重要領(lǐng)域。在偏頭痛的病理過程，尤其是偏頭痛慢性化過程中，中樞敏化發(fā)揮了重要作用[5～7]。Burstein R等人1996年首次在Nature雜志上提出中樞敏化參與了偏頭痛發(fā)病過程[20]。中樞敏化主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)在疼痛產(chǎn)生以及疼痛傳遞的過程中發(fā)生了可塑性變化，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)傷害區(qū)域內(nèi)和傷害區(qū)域周圍非傷害區(qū)域的刺激反應(yīng)增強(qiáng)（痛覺過敏，hyperalgesia），對(duì)非傷害性刺激產(chǎn)生疼痛異常的傷害性反應(yīng)（痛覺超敏，allodynia）[21]。皮膚異常性疼痛（CA）作為偏頭痛中樞敏化的外在征象，疼痛范圍牽涉面部，還可以擴(kuò)展到整個(gè)面部以及頭皮，甚至達(dá)到四肢[22～25]。在偏頭痛的動(dòng)物模型中，多采用電、化學(xué)刺激敏化硬腦膜以及三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)來誘導(dǎo)這種中樞敏化狀態(tài)，多以 von-Frey 絲檢測(cè)面部和后足的皮膚痛閾來評(píng)價(jià)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（PBS組）相比，慢性偏頭痛組大鼠（IS組）面部及足底的機(jī)械痛閾值都顯著降低，隨著“炎性湯”刺激硬腦膜次數(shù)增加，大鼠面部及足底痛閾值進(jìn)行性下降，提示“炎性湯”反復(fù)刺激硬腦膜可以誘導(dǎo)皮膚異常性疼痛（CA），導(dǎo)致偏頭痛的中樞敏化狀態(tài)。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是一種血管舒張肽，廣泛分布于中樞系統(tǒng)，是三叉神經(jīng)微血管激活的標(biāo)志物，在偏頭痛中樞敏化的疼痛感覺調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[27,28]。Cady等的研究表明CGRP可以促進(jìn)中樞以及外周的三叉神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的敏感性[29]。c-Fos是即刻早期基因的重要成員，參與偏頭痛的痛覺調(diào)控過程[7,30]。CGRP 和c-Fos在偏頭痛病理過程，尤其在慢性偏頭痛的發(fā)展和維持中起重要作用，可以作為中樞敏化和神經(jīng)元激活的生物學(xué)標(biāo)志[7,27～30]。本研究發(fā)現(xiàn)：慢性偏頭痛大鼠（7次“炎性湯”后）TNC部位觀察到CGRP和c-Fos表達(dá)的顯著增加，提示重復(fù)給予“炎性湯”刺激硬腦膜可以導(dǎo)致中樞敏化和神經(jīng)元激活。綜上所述，在我們的研究中：給予“炎性湯”反復(fù)刺激硬腦膜可以顯著降低大鼠面部和足底痛閾值，增加中樞敏化標(biāo)志CGRP 和c-Fos的表達(dá)，提示“炎性湯”反復(fù)刺激硬腦膜可以較好的模擬慢性偏頭痛中樞敏化的過程，該模型是一種可行的偏頭痛中樞敏化模型。

蛋白激酶C（PKC）是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，至今已發(fā)現(xiàn)12種亞型，它們構(gòu)成了一個(gè)絲氨酸／蘇氨酸激酶超家族。PKC在介導(dǎo)細(xì)胞分裂、增殖、凋亡、細(xì)胞骨架蛋白的重塑、離子通道的調(diào)節(jié)及細(xì)胞分泌等方面發(fā)揮著重要作用[8,9]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，在多種疼痛模型中， PKC活性顯著增高，而抑制PKC的活性后往往可以明顯減輕疼痛，提示PKC在疼痛的中樞敏化形成過程中發(fā)揮著重要作用[3,9,10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠慢性偏頭痛中樞敏化模型中，觀察到伴隨著大鼠面部及足底痛閾值的下降，TNC部位PKC的蛋白表達(dá)水平顯著增加，而使用PKC的抑制劑CHE后可以顯著改善CM大鼠痛覺過敏，進(jìn)一步使用PKC激動(dòng)劑PMA可以加重大鼠痛覺過敏，提示PKC同樣參與慢性偏頭痛痛覺過敏的過程。前文提到：CGRP 和c-Fos可以作為偏頭痛中樞敏化和神經(jīng)元激活的生物學(xué)標(biāo)志。在此次研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠慢性偏頭痛中樞敏化模型中，使用PKC的抑制劑CHE后可以顯著抑制CGRP 和c-Fos的表達(dá)，而使用PKC激動(dòng)劑PMA可以增加CGRP 和c-Fos的表達(dá)，提示PKC參與了慢性偏頭痛中樞敏化的病理生理過程。PKC共有12 種亞型,已有研究表明PKC γ亞基是痛覺過敏、中樞敏化關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[31～33]，遺憾的是，此次研究并未細(xì)究PKC各亞型對(duì)偏頭痛中樞敏化的作用，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

圖8 各組CGRP蛋白表達(dá)量*P ＜ 0.05，與Sham組相比； #P ＜ 0.05，與CM+DMSO組相比Fig.8 The comparison of CGRP protein expression levels among four groups*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

圖9 各組c-Fos蛋白表達(dá)量*P ＜ 0.05，與Sham組相比；#P ＜ 0.05，與CM+DMSO組相比Fig.9 The comparison of c-Fos protein expression levels among four groups*P ＜ 0.05, compared with Sham group；#P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

綜上所述，“炎性湯”反復(fù)刺激硬腦膜后，大鼠面部及足底機(jī)械痛閾值顯著降低，CGRP、c-Fos表達(dá)顯著增加，證實(shí)了該模型是一種可行的慢性偏頭痛中樞敏化模型。此外，PKC可以有效調(diào)節(jié)中樞敏化標(biāo)志CGRP、c-Fos的表達(dá)變化及大鼠機(jī)械痛閾值的變化，提示PKC參與慢性偏頭痛中樞敏化的病理生理過程。我們的研究不僅為慢性偏頭痛的動(dòng)物模型進(jìn)行了探索證實(shí)，更為未來慢性偏頭痛的預(yù)防治療提供了可靠思路。

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PKC CONTRIBUTES TO CENTRAL SENSITIZATION IN A RAT MODEL OF CHRONIC MIGRIANE*

WU Bai-Xue1, WANG Sha1, QIN Guang-Cheng1, XIAO Yao1, XIE Jing-Mei1, TAN Ge2, ZHOU Ji-Ying2,CHEN Li-Xue1Δ
(1Laboratory Research Center, The First Af fi liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;2Chongqing Key Laboratory of Neurology, Chongqing 400016, China)

Objective: The purpose of this paper is to investigate whether PKC participates in central sensitization in chronic migraine pathophysiological process. Methods: Sprague-Dawley rats were randomly divided into 7 groups: Sham group (n=11), CM group (n=12), CM+DMSO group (n=8), CM+CHE4 μg group (n=11), CM+CHE 8 μg group (n=10), CM+PMA100 ng group (n=10), CM+PMA 200 ng group(n=11). We repeatedly infused inflammatory soup (IS) on the intact dura in awake rats to model the recurrent dural nociceptor activation assumed to occur in patients with chronic migraine (CM). PKC blocker chelerythrine chloride (CHE) and PKC activator Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were administrated to investigate the role of PKC in central sensitization induced by in fl ammatory soup. Then we used von Frey test to detect the change of pain threshold. Western blotting was performed to detect the expression of PKC,CGRP and c-Fos in trigeminal nucleus caudalis (TNC). Results: Repeated infusion of IS decreased pain threshold in the face and hindpaw region, and up-regulated the expression of PKC, CGRP and c-Fos in TNC.Furthermore, inhibition of PKC by CHE relieved the allodynia, and reduced the expression of CGRP and c-Fos. Activation of PKC by PMA aggravated the allodynia, and increased the expression of CGRP and c-Fos.Conclusion: Inhibition and activation of PKC could regulate the pain threshold and the expression of CGRP and c-Fos. These data indicate that PKC might play a prominent part in central sensitization of CM model.

PKC; Chronic migraine; Central sensitization; Trigeminal nucleus caudalis

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.05.004

國家自然科學(xué)基金（No. 81671093, No. 81500957）；重慶市渝中區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（YCSTC，2016BE02）

△通訊作者 chenlixue@hospital.cqmu.edu.cn