曾漢日 鄭煥英 劉冷 陸靖 譚小華 孫立梅 方苓 李暉 柯昌文

511430 廣州，廣東省疾病預防控制中心(曾漢日、鄭煥英、劉冷、譚小華、孫立梅、方苓、李暉、柯昌文)；511430 廣州，廣東省公共衛(wèi)生研究院(陸靖)

2015年廣東省廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎病原學特征分析

曾漢日 鄭煥英 劉冷 陸靖 譚小華 孫立梅 方苓 李暉 柯昌文

511430 廣州，廣東省疾病預防控制中心(曾漢日、鄭煥英、劉冷、譚小華、孫立梅、方苓、李暉、柯昌文)；511430 廣州，廣東省公共衛(wèi)生研究院(陸靖)

目的了解2015年廣東省廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎病原學特征，為皰疹性咽峽炎的防控提供數據基礎。方法收集123例皰疹性咽峽炎病例的糞便標本和咽拭子標本共211份，采用熒光定量PCR和巢式PCR進行腸道病毒檢測，腸道病毒陽性標本接種RDa細胞進行病毒分離，選取CVA6陽性標本或毒株進行VP1全長序列擴增與測序，運用DNAStar6.0和MEGA5.2軟件對獲取序列進行系統(tǒng)進化分析。結果123例皰疹性咽峽炎病例中，腸道病毒陽性率為93.50%，共檢出CVA6、CVA10、CVA2、EV71、CVA16、CVB2、Echo14和Echo30等8種腸道病毒，其中CVA6陽性率最高(60.98%)，其次為CVA10(13.01%)；糞便標本腸道病毒陽性率(χ2=29.88,P<0.01)和病毒分離陽性率(χ2=8.67,P<0.01)均高于咽拭子標本；基于VP1全長序列遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，皰疹性咽峽炎CVA6核苷酸同源性96.9%～99.9%，氨基酸同源性99.0%～100.0%，均屬于D3基因亞型。結論2015年廣東省廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎的病原體以A組腸道病毒為主，其中D3基因亞型的CVA6是優(yōu)勢流行株。

皰疹性咽峽炎(Herpangina, HA)是由人腸道病毒(Human enterovirus, HEV)引起的以發(fā)熱、咽痛、咽峽部充血并出現(xiàn)散在灰白色皰疹和潰瘍?yōu)橹饕R床特征的一種自限性疾病。常見于嬰幼兒，傳染性強，全年均可發(fā)生[1,2]。大多數病例癥狀較輕，可自愈，但少數病例可發(fā)展為重癥病例，甚至引起死亡。皰疹性咽峽炎的病原體以腸道病毒柯薩奇病毒A群(Coxsackievirus group A)或EV71為主[3-4]，其中CVA1～CVA6、CVA8、CVA10和CVA22較為常見[5]。

近年來，皰疹性咽峽炎在世界上多個國家或地區(qū)廣泛流行[6-7]，在國內部分城市也出現(xiàn)了暴發(fā)疫情[5,8-12]。然而，由于皰疹性咽峽炎在國內不屬于法定傳染病，目前報道較少，對于其病原研究更是缺乏。因此，為了解廣東省廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎的病原學特征，本研究于2015年5月—8月期間收集了廣州市兒童醫(yī)院皰疹性咽峽炎病例的病原學標本進行病原檢測并對其優(yōu)勢病原體進行基因分析，以期為皰疹性咽峽炎的防治提供病原學依據。

1 材料與方法

1.1材料來源2015年5月—8月期間，收集了由廣州市兒童醫(yī)院送檢的123例皰疹性咽峽炎病例標本211份及病例基本信息，其中糞便標本101份，咽拭子標本110份。所有標本均在冷藏條件下送檢并及時置于-70 ℃冰箱保存。

1.2核酸檢測與病毒分型標本經前處理后，采用德國Qiagen公司Viral RNA Mini Kit試劑盒進行病毒核酸提取，運用江蘇碩世公司的熒光定量PCR試劑進行總腸道病毒檢測，對于陽性標本進行EV71、CVA16、CVA6和CVA10熒光定量PCR分型鑒定檢測，如果這4種病毒均為陰性，則運用半巢式PCR(Semi-nested PCR, Sn-PCR)[13]進行腸道病毒部分VP1序列擴增，通過序列測定進一步分型。

1.3病毒分離對腸道病毒陽性標本采用人橫紋肌肉瘤(RDa)細胞進行病毒分離，參考世界衛(wèi)生組織《脊髓灰質炎實驗室操作手冊》[14]第4版腸道病毒分離操作規(guī)程操作。病毒株鑒定與標本檢測方法相同。

1.4CVA6VP1序列擴增選取CVA6毒株或陽性標本進行VP1全長序列擴增，PCR擴增引物為參考CVA6代表序列通過Primer Premier5.0軟件設計獲得。引物序列(5′→3′)為：CVA6-VP1-F: TGTGCAAGGACACYGAYGAG，CVA6-VP1-R: AGATGYCGGTTTACCACTCT。采用德國Qiagen公司One-step RT-PCR Kit試劑進行PCR擴增，反應條件為：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min； 95 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠進行特異核酸片段電泳分離。

1.5CVA6序列測序與分析采用美國Affymetrix公司的ExoSAP-IT試劑純化PCR產物，測序反應試劑和測序反應產物純化試劑分別采用美國ABI公司的BigDye terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit試劑和BigDye X-terminator試劑，應用ABI3100全自動遺傳分析儀進行測序分析。對于獲取的CVA6原始序列采用DNAStar6.0、MEGA5.2等軟件進行序列拼接、整理、分析并構建VP1全長序列系統(tǒng)進化樹。用于序列分析的國內外CVA6參比序列下載自GenBank。

1.6統(tǒng)計學方法采用統(tǒng)計軟件SPSS18.0建立數據庫，對檢測數據進行統(tǒng)計分析。組間比較運用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1病例基本信息123例皰疹性咽峽炎病例中，男性病例101例，女性病例22例，男女比例為4.6∶1，均為輕癥病例，發(fā)病年齡最小為19 d，最大為25歲，中位數為1.42(0.05，25)歲。收集的病例為5至8月份病例，以7月份病例為主，占53.66%(66/123)。

2.2病例病原構成運用熒光定量PCR和Sn-PCR，對收檢的123例皰疹性咽峽炎病例的211份標本進行腸道病毒檢測及分型鑒定，糞便標本和咽拭子標本其中之一檢測陽性則表示該病例為陽性。經檢測，共檢出115例病例為腸道病毒陽性，陽性率為93.50% (115/123)，其中CVA6陽性率為60.98% (75/123)，CVA10陽性率為13.01% (16/123)，CVA2陽性率為4.88% (6/123)，EV71陽性率為4.88% (6/123)，CVB2和Echo30陽性各1例，6例病例為兩種腸道病毒混合感染，分別為CVA2/CVA10、CVA2/Echo14、CVA2/EV71、CVA6/CVA10、CVA6/CVA16和CVA6/EV71，另有4例腸道病毒陽性病例未能成功分型。

表1 糞便標本與咽拭子標本腸道病毒檢出率比較

2.3病毒分離與鑒定對115例病例的176份腸道病毒陽性標本采用RDa細胞進行病毒分離，共從17例病例18份標本中分離獲得腸道病毒毒株18株，陽性分離率為10.23% (18/176)。經鑒定，7株為CVA10，4株為CVA6，3株為CVA2，2株為EV71，有2株為混合毒株，分別為CVA2/Echo14和CVA6/CVA10。

2.4不同標本檢出率經熒光定量PCR檢測結果統(tǒng)計，糞便標本腸道病毒陽性率為98.02% (99/101)，平均Ct值為23.70；咽拭子標本腸道病毒陽性率為70.00% (77/110)，平均Ct值為31.47。糞便與咽拭子標本PCR腸道病毒檢出率差別有統(tǒng)計學意義(χ2=29.88,P<0.01)。對176份腸道病毒陽性標本進行病毒分離，其中糞便標本腸道病毒分離陽性率為16.16% (16/99)，咽拭子標本腸道病毒分離陽性率為2.60% (2/77)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，糞便與咽拭子標本腸道病毒分離陽性率差別有統(tǒng)計學意義(χ2=8.67,P<0.01)。詳見表1。

2.5CVA6遺傳進化分析本研究共從不同病例的3株CVA6毒株和6份CVA6陽性標本獲得9條CVA6病毒VP1全長序列。為了解2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎優(yōu)勢病原體CVA6病毒的遺傳進化情況，將獲得的9條CVA6病毒VP1全長序列進行序列同源性分析并與57條CVA6參比序列構建系統(tǒng)進化樹。參比序列包括了20條廣東省手足口病監(jiān)測病例序列、6條2004—2007年廣東省急性弛緩性麻痹(AFP)監(jiān)測病例序列和31條下載自GenBank的部分國家或地區(qū)及國內城市的代表序列。

同源性分析顯示，本研究的9條CVA6病毒VP1全長序列核苷酸同源性96.9%～99.9%，氨基酸同源性99.0%～100.0%，與CVA6原型株Gdula的核苷酸同源性82.6%～83.3%，氨基酸同源性94.8%～95.7%。構建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)， CVA6可分為A、B、C、D等4個基因型，其中D基因型包括了D1、D2、D3等3個基因亞型，與相關文獻腸道病毒的分型相同[15]。2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎CVA6病毒株在系統(tǒng)進化樹中處于較為集中的一簇，同源性高，與2012年上海流行株(KC414740)、2015年深圳地區(qū)引起皰疹性咽峽炎的CVA6流行株(KU844071、KU844078)和廣東省手足口病2015年大部分CVA6流行株及2013年流行株(HFMD839)在系統(tǒng)進化樹中處于同一分支，均屬于D3基因亞型。另外，2008年西班牙、2010年法國、2009—2011年中國臺灣和日本的部分流行株也屬于D3基因亞型，與2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎CVA6流行株親緣關系較近。2004—2007年廣東省AFP病例的6株CVA6分離株在進化樹處于B和D2兩個分支中，分別屬于B基因型或D2基因亞型，與2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎CVA6流行株的親緣關系較遠。詳見圖1。

注：●2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎CVA6流行株；▲2015年廣東省手足口病CVA6流行株圖1 2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎CVA6 VP1全長序列系統(tǒng)進化樹Note: ●Guangzhou strains of herpangina in 2015; ▲Guangdong strains of hand-foot-mouth disease in 2015Fig.1 Phylogenetic tree of the entire VP1 of CVA6 from herpangina cases of Guangzhou in 2015

3 討論

皰疹性咽峽炎常引起聚集性疫情的發(fā)生，對兒童的身心健康可造成嚴重影響。2009年10月巴西亞馬遜地區(qū)出現(xiàn)了皰疹性咽峽炎疫情，共44個患者，以1～9歲兒童為主[6]；2012年泰國暴發(fā)一起皰疹性咽峽炎疫情，共166個患者，以1歲組兒童為主，7月份疫情最為嚴重[1]。國內江蘇等6省市近幾年接連報道皰疹性咽峽炎流行[5, 8-12]，引起社會各界廣泛關注。加強皰疹性咽峽炎監(jiān)測對于嬰幼兒童的健康具有重要意義。

本研究對于2015年廣州地區(qū)的皰疹性咽峽炎病例監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，病例均為輕癥，男性多于女性，發(fā)病年齡以1歲左右嬰幼兒為主，病例主要集中在7月份，與其他報道相符[1]。病原學檢測發(fā)現(xiàn)，檢出CVA6、CVA10、CVA2、CVA16、CVB2、EV71、Echo14和Echo30等8種腸道病毒，其中陽性率前3位的病原體分別為CVA6(60.98%)、CVA10(13.01%)、CVA2(4.88%)和EV71(4.88%)，表明2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎主要由腸道病毒A組的柯薩奇病毒引起，其中CVA6為優(yōu)勢病原。另外，有6例病例同時檢出兩種腸道病毒，提示腸道病毒共同感染可能是一種普遍現(xiàn)象。在國內，2015年東莞市和杭州市報道引起皰疹性咽峽炎的優(yōu)勢病原體為CVA2，2015年深圳市報道主要流行病原體為CVA6，江蘇省報道2013—2014年皰疹性咽峽炎主要病原體為EV71(10.5%)，長春市2012和2013年的主要流行病原分別為CVA10和CVA6[5,8,10-12]。在國外，2009年巴西亞馬遜地區(qū)暴發(fā)腸道病毒B群引起的皰疹性咽峽炎疫情[6]，2010年法國報道CVA6和CVA10為主要流行株的皰疹性咽峽炎和手足口病疫情暴發(fā)[7]，2012年泰國發(fā)生了以CVA8和CVA6為主要病原的皰疹性咽峽炎疫情[1]。以上數據表明，國內外皰疹性咽峽炎的優(yōu)勢病原體以柯薩奇A組病毒較為常見，但不同時間、不同地區(qū)流行的病原體種類可能不同。

比較皰疹性咽峽炎病例不同類型標本的腸道病毒檢出率發(fā)現(xiàn)，在熒光定量PCR和病毒分離兩種方法檢測中糞便標本的腸道病毒檢出率均高于咽拭子標本。因此，糞便標本在皰疹性咽峽炎病原檢測中優(yōu)于咽拭子標本。然而，咽拭子標本的檢測對于皰疹性咽峽炎病例的實驗室確診也具有較高的臨床意義。建議對于皰疹性咽峽炎病例應同時采集糞便和咽拭子標本進行病原學檢測。另外，本研究中熒光定量PCR與病毒分離兩種檢測方法對于腸道病毒的檢出率差異較大，推測可能與采集的咽拭子標本病毒含量偏低及病毒分離只選擇RDa一種細胞系有關。

近年來CVA6已成為引起手足口病的主要病原體之一，在2013年CVA6更是取代了EV71和CVA16成為國內部分城市的優(yōu)勢病原體[15]。因此，CVA6的分子流行病學研究越來越受到關注和重視。本研究選取9條CVA6病毒VP1全長序列與57條國內外參比序列進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，CVA6可分為A、B、C、D等4個基因型，其中D基因型可分為D1、D2、D3等3個基因亞型，與相關文獻報道相符[15]。2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎CVA6流行株同源性高，與原型株Gdula的親緣關系較遠，而與2012年上海市部分流行株、2015年深圳市皰疹性咽峽炎流行株和2015年廣東省手足口病大部分CVA6流行株的親緣關系較近，均屬于D3基因亞型。較有意義的是，引起2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎與廣東省手足口病的CVA6流行株在系統(tǒng)進化樹處于同一簇，同源性高，提示二者具有共同的致病原。因此，加強皰疹性咽峽炎的病原監(jiān)測也可為手足口病的防控提供相關參考數據。另外，部分國家或地區(qū)的CVA6流行株也屬于D3基因亞型，與2015年廣州流行株親緣關系較近，提示與廣東省2015年CVA6流行株可能具有共同的進化來源。廣東省2004—2007年AFP監(jiān)測病例CVA6毒株屬于B基因型或D2基因亞型，與2015年廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎CVA6流行株基因型不同，親緣關系較遠。引起二者的CVA6病毒親緣關系較遠，可能與病毒隨著時間的推移持續(xù)進化相關，是否CVA6的B基因型或D2基因亞型更易引起AFP的發(fā)生，亟待對兩種疾病在同一時期的CVA6病毒作比對研究。本研究通過對皰疹性咽峽炎的病原學特征分析，闡明了2015年廣東省廣州地區(qū)皰疹性咽峽炎的病原學特征，進一步證實皰疹性咽峽炎與手足口病的發(fā)病趨勢相近，且二者的病原體大部分一致，為皰疹性咽峽炎病原變化規(guī)律的深入研究及防控策略的制訂提供了一定的病原學數據。

[1] Puenpa J, Mauleekoonphairoj J, Linsuwanon P, et al.Prevalence and characterization of enterovirus infections among pediatric patients with hand foot mouth disease, herpangina and influenza like illness in Thailand, 2012[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e98888. doi: 10.1371/journal.pone.0098888.

[2] Chen KT, Chang HL, Wang ST, et al.Epidemiologic features of hand-foot-mouth disease and herpangina caused by enterovirus 71 in Taiwan, 1998-2005[J]. Pediatrics, 2007, 120(2): e244-252.doi: 10.1542/peds.2006-3331.

[3] 賀錦曄, 趙小紅, 馬利維, 等. 118例皰疹性咽峽炎患兒心肌損傷臨床分析[J]. 檢驗醫(yī)學與臨床, 2012, 9(19):2442-2443.doi:10.3969/j.issn.1672-9455.2012.19.024.

[4] 王宏宇, 張小愛, 許紅梅, 等. 手足口病患者不同標本中腸道病毒檢測結果比較[J]. 中華疾病控制雜志, 2014, 18(6):501-503.

[5] 許爽, 劉金香, 吳東林, 等. 長春地區(qū)兒童皰疹性咽峽炎病原研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2016, 26(3):391-393.

[6] Oliveira DB, Campos RK, Soares MS, et al. Outbreak of herpangina in the Brazilian Amazon in 2009 caused by Enterovirus B[J].Arch Virol, 2014, 159(5):1155-1157. doi: 10.1007/s00705-013-1858-5.

[7] A.Mirand, C.Henquell, C.Archimbaud, et al. Outbreak of hand, foot and mouth disease/herpangina associated with coxsackievirus A6 and A10 infections in 2010, France: a large citywide, prospective observational study[J]. Clin Microbiol Infect, 2012, 18(5): E110-118. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03789.x.

[8] Yao X, Bian LL, Lu WW,et al. Epidemiological and etiological characteristics of herpangina and hand foot mouth diseases in Jiangsu, China, 2013-2014[J]. Hum Vaccin Immunother, 2017, 13(4): 823-830. doi: 10.1080/21645515.2016.1236879.

[9] 李佳萌, 李琳, 呂莉琨, 等. 2014年天津市腸道病毒所致皰疹性咽峽炎臨床流行病學分析[J]. 中華疾病控制雜志, 2016, 20(1):26-29.doi:10.16462/j.cnki.zhjbkz.2016.01.007.

[10] 王玉潔, 楊洪, 姚相杰, 等. 2015年深圳地區(qū)皰疹性咽峽炎的病原學與流行病學特征分析[J]. 中華疾病控制雜志, 2016, 20(8):759-763.doi:10.16462/j.cnki.zhjbkz.2016.08.002.

[11] Peng Q, Xie M, Zhang Y, et al. Molecular epidemiology of the enteroviruses associated with hand, foot and mouth disease/herpangina in Dongguan, China, 2015[J]. Arch Virol, 2016, 161(12):3463-3471.doi: 10.1007/s00705-016-3058-6.

[12] Li W, Gao HH, Zhang Q, et al. Large outbreak of herpangina in children caused by entero- virus in summer of 2015 in Hangzhou, China[J]. Sci Rep, 2016, 6:35388. doi: 10.1038/srep35388.

[13] Nix WA, Oberste MS, Pallanch MA. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original specimens[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(8): 2698-2704. doi: 10.1128/JCM.00542-06.

[14] 世界衛(wèi)生組織. 脊髓灰質炎實驗手冊[M].4版. 北京: 中國疾病預防控制中心, 2004: 78-96.

[15] 曾漢日, 陸靖, 李暉, 等. 廣東省2008-2013年柯薩奇A6型腸道病毒的流行及其基因特征分析[J]. 中華微生物和免疫學雜志, 2014, 34(10):742-746. doi:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2014.10.003.

2017-05-19)

(本文編輯：呂新軍)

EtiologicalcharacteristicsofherpanginacasesinGuangzhoucityinGuangdongprovince,2015

ZengHanri,ZhengHuanying,LiuLeng,LuJing,TanXiaohua,SunLimei,FangLing,LiHui,KeChangwen.

GuangdongProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention, 511430Guangzhou,China(ZengHR,ZhengHY,LiuL,TanXH,SunLM,FangL,LiH,KeCW);GuangdongProvincialInstituteofPublicHealth, 511430Guangzhou,China(LuJ)

LiHui,Email:gdcdclihui@163.com

ObjectiveTo analyze the etiological of herpangina(HA) in Guangzhou City in 2015, and to provide laboratory data for the epidemic control.MethodsTwo hundred and eleven herpangina samples (stool and throat swab) were collected.Real-time (RT)-PCR and semi-nested (Sn)-PCR assays were performed to detect human enteroviruses (HEVs)-positive samples. The human rhabdomyosarcoma (RDa) cell lines were used to inoculate virus from HEVs-positive samples. The entire sequences of viral genes encoding VP1 of CVA6 positive samples or strains were amplified and sequenced. The phylogenetic analysis was performed to analyze the full-length gene sequences encoding VP1 of CVA6 by using DNAStar6.0 and MEGA5.2 software packages.ResultsAccording to the laboratory test results, 115 cases were HEVs-positive and positive rate was 93.50%,eight serotypes of EV including CVA6, CVA10, CVA2, EV71, CVA16, CVB2, Echo14 and Echo30 were detected.The CVA6 positive rate was the highest with a percentage of 60.98%, followed by CVA10 with a percentage of 13.01%. The enterovirus positive rate of stool samples (χ2=29.88,P<0.01) and viruses isolated positive rate (χ2=8.67,P<0.01) were higher than that in throat swab samples. Phylogenetic analysis showed that all CVA6 strains detected in this study belonged to D3 subgenotype, and shared 96.9%-99.9% homologies in nucleotide and 99.0%-100.0% in amino acid.ConclusionsCVA6 of the enterovirus A group accounted for the main pathogen of herpangina in Guangzhou City in Guangdong province in 2015,which belonged to D3 subgenotype.

Herpangina; Enterovirus; CVA6; Phylogenetic analysis

李暉，Email:gdcdclihui@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.007

皰疹性咽峽炎；腸道病毒；CVA6；系統(tǒng)進化分析

廣東省省級科技計劃項目(2014A020212243)；廣東省自然科學基金項目(2015A030310013)

FundprogramsScience and Technology Planning Project of Guangdong Province (2014A020212243);National Natural Science Foundation of Guangdong, China(2014A020212243)