張 震，謝 和，張文杰，龍金花

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

貴州西南喀斯特地區(qū)土壤芽孢桿菌資源及多樣性研究

張 震，謝 和*，張文杰，龍金花

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

采集興義市坡崗、興仁縣清水河和安龍縣青龍山三個(gè)貴州省西南部喀斯特保護(hù)區(qū)土樣，利用平板分離方法分離芽孢桿菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16SrRNA基因序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：從54份土樣中共分離到芽孢桿菌129株，鑒定為24個(gè)種，分為3個(gè)屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬(93.80%)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)(20.16%)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)(14.73%)和維德曼芽孢桿菌(Bacilluswiedmannii)(10.08%)為優(yōu)勢(shì)種。在多樣性方面，清水河保護(hù)區(qū)的Margalef豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)皆最高(3.937 7，2.445 5，0.903)，坡崗保護(hù)區(qū)的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)最低(2.216 0，0.818 3)，青龍山保護(hù)區(qū)的Margalef豐富度指數(shù)最低(3.358 1)；從Jaccard相似性指數(shù)來(lái)看，坡崗與清水河、青龍山保護(hù)區(qū)的芽孢桿菌資源不相似(0.243 2，0.187 5)，而清水河與青龍山中等不相似(0.257 1)。

喀斯特地區(qū)；芽孢桿菌；資源；多樣性

芽孢是生命世界中抗逆性最強(qiáng)的一種結(jié)構(gòu)，能夠抵抗高溫、干燥、紫外線、電磁輻射和腐蝕性化學(xué)藥品等極端因素的影響，廣泛分布于自然界的各種生境中[1，2]。能夠形成芽孢的細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬、類(lèi)芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬、梭菌屬和脫硫腸狀菌屬、八疊球菌屬等。芽孢桿菌因其獨(dú)有的生理特征和理化性質(zhì)，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)保和軍事領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。

土壤作為微生物聚集的大本營(yíng)，是調(diào)查微生物資源及多樣性的重要場(chǎng)所。貴州省地處云貴高原，平均海拔1 100 m，擁有典型的喀斯特巖溶地貌。位于副熱帶東亞大陸的季風(fēng)區(qū)內(nèi)，屬于中國(guó)亞熱帶高原季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，大部分地區(qū)氣候溫和，年均氣溫14～16℃，年平均降水量1 100～1 300 mm，雨量充沛，相對(duì)濕度較大。土壤類(lèi)型十分豐富，從亞熱帶的紅壤到暖溫帶的棕壤均有分布，以黃壤為主。這些獨(dú)特的地理、氣候和土壤特點(diǎn)，使得該地區(qū)蘊(yùn)含豐富的土壤芽孢桿菌資源。目前為止，關(guān)于貴州喀斯特地區(qū)芽孢桿菌資源及多樣性的系統(tǒng)研究較少。鑒于此，本研究從采集貴州省喀斯特地區(qū)土壤樣本入手，通過(guò)土壤芽孢桿菌分離鑒定和多樣性分析，對(duì)貴州喀斯特地區(qū)芽孢桿菌資源和生態(tài)多樣性展開(kāi)調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1土壤樣品 選取貴州省興義市坡崗、興仁縣清水河、安龍縣青龍山三個(gè)喀斯特保護(hù)區(qū)采樣點(diǎn)(參見(jiàn)表1)，于保護(hù)區(qū)內(nèi)不同海拔、不同生境下，采集地表以下5～10 cm的土壤，裝入無(wú)菌密封袋，及時(shí)分離土壤芽孢桿菌。

表1 土壤樣本采集地環(huán)境描述Tab.1 Environment description of soil samples from collection sites

1.1.2分離培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[3]。

1.1.3試劑 芽孢桿菌基因組DNA提取采用BIOMIGA公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(GD2411 Bacterial gDNA Miniprep kit)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1分離純化 分離純化方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[3]。

1.2.2芽孢桿菌的分類(lèi)鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn) 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[4]與Bergey’sManual?ofSystematicBacteriology[5]。

1.2.2.2 16SrRNA基因序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增引物為細(xì)菌16SrRNA基因擴(kuò)增通用引物63F(CAGGCCTAACACATGCAAGTC，5’→3’)和1387R(GGGCGGWGTGTACAAGGC，5’→3’)[6]。

PCR反應(yīng)體系為25 μl體系(參見(jiàn)表2)，反應(yīng)條件參見(jiàn)表3。

表2 25μl PCR反應(yīng)體系Tab.2 PCR reaction system of 25μl

表3 PCR反應(yīng)條件Tab.3 PCR reaction condition

PCR產(chǎn)物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到16SrRNA 基因序列。將序列于EzTaxon(www.ezbiocloud.net)進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建各個(gè)保護(hù)區(qū)內(nèi)分離所得芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。參數(shù)為：鄰位相連法(Neighbor-joining)、Kimura2-Parameter Distance模型、重復(fù)取樣自展值(Bootstrap)為1 000[7]。

1.2.3芽孢桿菌種類(lèi)優(yōu)勢(shì)度分析 參數(shù)：所在群落的所有芽孢桿菌的個(gè)體數(shù)之和(N)、芽孢桿菌i的個(gè)體數(shù)(Ni)；分析公式：di=Ni/N=pi。芽孢桿菌占總物種的百分比di≥10%為優(yōu)勢(shì)種，1%

1.2.4芽孢桿菌群落多樣性分析 參數(shù)：所在群落的所有芽孢桿菌的菌株數(shù)之和(N)、種類(lèi)數(shù)目(S)、種群優(yōu)勢(shì)度(d)、Margalef豐富度指數(shù)(R)、香農(nóng)-維納(Shannon-Wiener) 的多樣性指數(shù)(H’)、Pielou均勻度指數(shù)(J)和Jaccard相似性指數(shù)(Cj)；各分析指數(shù)的公式如下：

Margalef豐富度指數(shù)：R=(S-1)/lnN；

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)：H’=-∑dilndi(i=1，2，3，…，n)；[8]

Pielou均勻度指數(shù)：J=H’/lnS；[9]

Jaccard相似性指數(shù)：Cj=c/(a+b+c)。

式中a和b分別為兩種生境地中芽孢桿菌的種數(shù)或?qū)贁?shù)，c為兩種生境地中共有的芽孢桿菌種數(shù)或?qū)贁?shù)。Jaccard相似性指數(shù)(Cj)用于比較兩個(gè)生境地中芽孢桿菌種類(lèi)組成的相似程度，當(dāng)0.00≤Cj<0.25時(shí)，表現(xiàn)為不相似；當(dāng)0.25≤Cj<0.50時(shí)，表現(xiàn)為中等不相似；當(dāng)0.50≤Cj<0.75時(shí)，表現(xiàn)為中等相似；當(dāng)0.75≤Cj≤1時(shí)，表現(xiàn)為極相似。

2 結(jié)果與分析

2.1分離純化結(jié)果

于三個(gè)喀斯特保護(hù)區(qū)共采集土樣54份，分離到細(xì)菌189株，通過(guò)芽孢染色及觀察，初步確定芽孢桿菌129株(68.25%)。

表4 芽孢桿菌形態(tài)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Physiological and biochemical test results of Bacillus-like species

注1：表格中“+”表示試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，“-”表示試驗(yàn)結(jié)果為陰性，“d”表示不同的菌株表現(xiàn)不同的試驗(yàn)結(jié)果，“w”表示陽(yáng)性反應(yīng)極其微弱；注2：Bacillushorneckiae尚未有對(duì)應(yīng)的中文芽孢桿菌命名；注3：CM000739_s、JH792383_s和JH792233_s在菌種庫(kù)中尚未有明確的芽孢桿菌命名。

2.2芽孢桿菌的分類(lèi)鑒定結(jié)果

結(jié)合部分生理生化試驗(yàn)結(jié)果(參見(jiàn)表4)，根據(jù)16SrRNA基因序列分析，將129株芽孢桿菌鑒定為24個(gè)種，涉及3個(gè)屬：分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)、賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)(參見(jiàn)表5)。

2.3各保護(hù)區(qū)芽孢桿菌分布概況及優(yōu)勢(shì)度分析

坡崗保護(hù)區(qū)內(nèi)蘇云金芽孢桿菌和短短芽孢桿菌屬于優(yōu)勢(shì)種，并且短短芽孢桿菌為該地區(qū)特有菌種；該地區(qū)其他特有芽孢桿菌為暹羅芽孢桿菌、JH792233_s菌株、橋石短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌枯草亞種。

清水河保護(hù)區(qū)優(yōu)勢(shì)種為蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌；該地區(qū)特有芽孢桿菌為病研所芽孢桿菌、解木糖賴(lài)氨酸芽孢桿菌、路西法芽孢桿菌和郭霍氏桿菌。

青龍山保護(hù)區(qū)優(yōu)勢(shì)種是蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、維德曼芽孢桿菌、高地芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌，其中蕈狀芽孢桿菌為該地區(qū)特有菌種；該地區(qū)其他特有芽孢桿菌為單純桿菌和彎曲芽孢桿菌。

三個(gè)保護(hù)區(qū)優(yōu)勢(shì)種為蘇云金芽孢桿菌(20.16%)、蠟樣芽孢桿菌(14.73%)和維德曼芽孢桿菌(10.08%)，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬(93.80%)。以上結(jié)果可以體現(xiàn)出貴州西南喀斯特地區(qū)生境下一定的芽孢桿菌資源及分布特點(diǎn)。具體參見(jiàn)表5。

表5 芽孢桿菌資源種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)度結(jié)果Tab.5 Resources and dominance of Bacillus-like species

注1：“0.0000”表示該區(qū)域未分離到該種芽孢桿菌；注2：Bacillushorneckiae尚未有對(duì)應(yīng)的中文芽孢桿菌命名；注3：CM000739_s、JH792383_s和JH792233_s在菌種庫(kù)中尚未有明確的芽孢桿菌命名。

2.4各保護(hù)區(qū)芽孢桿菌群落多樣性分析

從圖1(A， B)得出，清水河保護(hù)區(qū)數(shù)值皆最高，青龍山保護(hù)區(qū)R值最低，坡崗保護(hù)區(qū)H’值最低。表明清水河保護(hù)區(qū)土壤芽孢桿菌在種類(lèi)數(shù)量方面和種屬水平分布均勻度方面都具有優(yōu)勢(shì)，群落穩(wěn)定性更加明顯[10]。

從圖1(C)得出，清水河保護(hù)區(qū)J值最高，坡崗保護(hù)區(qū)J值最低。表明清水河保護(hù)區(qū)土壤芽孢桿菌在種屬間和種內(nèi)分布都比較均勻。

圖1 各保護(hù)區(qū)相關(guān)指數(shù)結(jié)果Fig.1 Relevant index of any reserve

坡崗與清水河之間的相似性指數(shù)Cj為0.243 2，表現(xiàn)為不相似；坡崗與清水河之間的相似性指數(shù)Cj為0.187 5，表現(xiàn)為不相似；清水河與青龍山之間的相似性指數(shù)Cj為0.257 1，表現(xiàn)為中等不相似(參見(jiàn)表6)。

表6 各保護(hù)區(qū)間相似性指數(shù)結(jié)果Tab.6 Similarity index between any reserve

3 討 論

土壤芽孢桿菌資源及多樣性研究越來(lái)越受到專(zhuān)家學(xué)者的青睞。王子旋等對(duì)新疆不同地區(qū)的土壤芽孢桿菌種類(lèi)及其多樣性進(jìn)行了調(diào)查， 結(jié)果顯示新疆地區(qū)芽孢桿菌種類(lèi)較豐富， 但在種類(lèi)和數(shù)量上受空間分布影響[11]；劉國(guó)紅等對(duì)玉米根際土壤的芽孢桿菌做了一定的研究，發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌與玉米根部之間的相關(guān)聯(lián)系[12]；葛慈斌等首次調(diào)查了武夷山地衣表生和內(nèi)生芽孢桿菌種類(lèi)多樣性，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，蘇云金芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)種[13]。

在貴州西南部喀斯特地區(qū)土壤芽孢桿菌多樣性方面，清水河保護(hù)區(qū)自然生境類(lèi)型豐富，海拔地勢(shì)低，氣候濕潤(rùn)溫?zé)?，人為活?dòng)影響小，參數(shù)相對(duì)較高；而坡崗保護(hù)區(qū)氣候偏干燥，人為活動(dòng)較頻繁，參數(shù)相對(duì)較低。一定程度上反映出人為活動(dòng)程度、濕度、海拔高度、生境種類(lèi)、種群密度等環(huán)境因素會(huì)對(duì)土壤芽孢桿菌豐富度、多樣性、分布均勻度等造成一定的影響，在人為活動(dòng)程度小、濕度大、海拔低、生境類(lèi)型豐富、種群密度適中的生境下，芽孢桿菌各種多樣性指數(shù)相對(duì)更有優(yōu)勢(shì)。受人為活動(dòng)因素影響較大的生境與自然生境在芽孢桿菌資源相似度方面有著較高的差異，自然生境間差異不顯著。

蘇云金芽孢桿菌是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的生防芽孢桿菌之一，在本次研究土壤中具有明顯的優(yōu)勢(shì)度，同樣，阿氏芽孢桿菌和短短芽孢桿菌也可應(yīng)用于生防制劑的研發(fā)，可以為生防芽孢桿菌的開(kāi)發(fā)和利用儲(chǔ)備菌種，提升作物病蟲(chóng)害防治水平；高地芽孢桿菌因其具有脫氮除磷作用[14]，是一種良好的廢水凈化功能菌種，蕈狀芽孢桿菌、彎曲芽孢桿菌等在污水處理的解磷、解氮和重金屬離子吸附方面也有相關(guān)應(yīng)用；維德曼芽孢桿菌是美國(guó)于2016年從乳制品分離出的一株新型耐冷、具有致病性的芽孢桿菌[15]，在喀斯特地區(qū)土壤中的報(bào)導(dǎo)尚屬首次；菌種JH792383_s、菌種CM000739_s和菌種JH792233_s在菌種庫(kù)中尚未有明確的芽孢桿菌命名，相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)極少，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

以上結(jié)果顯示了該地區(qū)具有較豐富的土壤芽孢桿菌資源，并且其分布及多樣性特征與當(dāng)?shù)厣持g存在一定的關(guān)聯(lián)，可為研究貴州西南喀斯特地區(qū)芽孢桿菌特點(diǎn)提供相應(yīng)的參考。

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ResearchonResourcesandDiversityaboutSoilBacillusofKarstAreaintheSouthwestofGuizhouProvince

ZHANGZhen，XIEHe*，ZHANGWen-jie，LONGJin-hua

(1.CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550000，China)

54 soil samples were collected from Pogang nature reserve in Xingyi city，Qingshui River nature reserve in Xingren county and Qinglong Mountain nature reserve in Anlong county in Karst landform area of southwest of Guizhou province.TheBacillus-like species were isolated by utilizing plate separation method and then identified using morphological observation，Physiological and biochemical experiments and 16SrRNA gene sequence analysis. Results showed that 129 strains isolated from these soil samples belonged to 24Bacillus-like species and 3 genus(Bacillus，LysinibacillusandBrevibacillus).The dominant bacteria forming spore areBacillusthuringiensis(20.16%)，Bacilluscereus(14.73%)，Bacilluswiedmannii(10.08%)of three reserves andBacillusis dominant genera(93.80%).Further research in terms of diversity indicated that every index ofBacillus-like in Qingshui River was the highest(3.9377，2.4455，0.9031)， but Pogang had the lowest level of what included Shannon-Wiener diversity index and Pielou evenness index (2.2160，0.8183)，and the Margalef richness index about Qinglong Mountain was the lowest (3.3581).Pogang was not similar to Qingshui River and Qinglong Mountain(0.2432，0.1875)， while Qingshui River and Qinglong Mountain were not either moderately concerning the Jaccard similarity index(0.2571).

Karst landform area；Bacillus；resources；diversity

2017-04-11；

2017-10-17

國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)，西南喀斯特地區(qū)特色微生物資源及多樣性調(diào)查(編號(hào)：2014FY120100)。

*

謝 和，副教授，主要研究方向：微生物資源學(xué)。E-mail：xieheh@163.com。

Q938

A

1008-0457(2017)05-0036-06國(guó)際DOI編碼10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.006