范建龍+胡修俊+邱森森+雍道敬+崔鳳云

摘 要：ZDC-01菌株為分離自海洋、對保護地蔬菜土傳病害具有較好防治效果的地下芽孢桿菌（Bacillus subterraneus）。為了提高菌株ZDC-01的活菌數(shù)，該研究通過單因子水平篩選和正交試驗法對活性菌株ZDC-01的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和搖瓶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，菌株ZDC-01的最佳培養(yǎng)基組成為可溶性淀粉2.0%，豆餅粉3.0%，葡萄糖0.5%，魚粉0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4·7H2O 0.03%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.3%。最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵起始pH 7.0、接菌量3%、裝液量50mL/250mL、發(fā)酵時間48h。經(jīng)驗證，優(yōu)化后發(fā)酵菌液活菌數(shù)為38×109cfu/mL，與初始發(fā)酵工藝的發(fā)酵菌液含菌量（23×109cfu/mL）相比，提高了65.22%。

關(guān)鍵詞：地下芽孢桿菌；生防菌株ZDC-01；活菌數(shù)；正交試驗

中圖分類號 TQ920 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）21-0032-05

Optimization of Fermentation Medium Components and Cultural Conditions for Marine Bacillus subterraneus ZDC-01 in Flask

Fan Jianlong et al.

（Qingdao Zhongda Biotech Co.Ltd.，Qingdao 266122，China）

Abstract：Bacillus subterraneus ZDC-01，originally isolated from the marine，showed strong biocontrol activities against a large number of soil-borne diseases of protected vegetable.This paper reports the fermentation medium and the culture conditions of strain ZDC-01 optimized by single factor horizontal and orthogonal experiments.The results showed that the best medium were Soluble starch 2.0%，soybean cake powder 3.0%，glucose 0.5%，fish meal 0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4.7H2O 0.03%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.3%.The optimal fermentation conditions were：culture temperature 30℃，rotation speed 200 r/min，initial pH value 7.0，inoculation 3%，liquid volume of 50mL/250mL，and fermentation for 48 h.Optimized biological fermentation process resulted in fermentation efficiency 38×109cfu/mL，increased by 65.22% in comparison with the initial fermentation process（23×109cfu/mL）.

Key words：Bacillus subterraneus；Bio-control strain；Viable count；Orthogonal experiments

植物病蟲害一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大敵，目前我國主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，長期大量施用對生態(tài)環(huán)境和我們?nèi)祟惗荚斐蓢?yán)重危害。隨著生物防治植物病害研究的深入，這種對環(huán)境友好、人畜無害、可降低化學(xué)農(nóng)藥的使用的防治方法，得到了社會越來越多的關(guān)注和認(rèn)可。芽孢桿菌以其耐熱抗逆、環(huán)境友好等諸多優(yōu)點，成為了近年生物防治的熱點[1]。其產(chǎn)生的多種抗菌活性物質(zhì)如脂肽類抗生素、抗菌蛋白或多肽類化合物對大多植物病原真菌都表現(xiàn)出很強的抑菌活性，且芽孢桿菌內(nèi)生芽孢抗逆性強，繁殖速度快，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，在農(nóng)牧業(yè)中具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景[2-5]。目前，用于防治植物病害的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、側(cè)孢芽孢桿菌（B.laterosporus）、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）等[6-7]。隨著生物防治研究的不斷深入，從陸生資源中分離篩選出新的有效生防菌越來越難，探索新的生防資源迫在眉睫。而海洋微生物資源豐富、種類繁多，獨特的海洋生態(tài)環(huán)境（高鹽、高壓、缺氧等）為微生物獨特的代謝途徑提供了可能，從而產(chǎn)生大量復(fù)雜多樣、具有較強生物活性和結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)，在抗菌、抗腫瘤以及環(huán)境治理方面有重要的意義[8-10]。目前，對于海洋活性菌株的報道也越來越多，陳香等[11]鑒定了一株海洋短小枯草芽孢桿菌，并對其生長條件和抑菌活性進行了研究；張君等[12]報道了對海洋芽孢桿菌B-9987中抗MDR菌活性成分的研究；石靈芳[13]等對海洋枯草芽孢桿菌UMBR1027產(chǎn)抑金黃色葡萄球菌活性蛋白分離鑒定以及發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

本實驗室從合作單位中國科學(xué)院海洋研究所獲得的海洋細菌中經(jīng)過篩選得到的一株拮抗地下芽孢桿菌B.subterraneus ZDC-01，該菌株具有廣譜抗菌活性對茄子灰霉病菌、白菜黑斑病菌、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、蘋果輪紋病菌和柑橘炭疽病菌等植物病原真菌均有較強的抑菌活性（另文發(fā)表），表現(xiàn)出良好的生防應(yīng)用開發(fā)前景。地下芽孢桿菌ZDC-01已獲得國家發(fā)明專利：一株地下芽孢桿菌制備方法及其應(yīng)用（專利號：201610395357.3）。采用單因子和正交試驗設(shè)計對該菌株的搖瓶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在提高其發(fā)酵活菌數(shù)量為該菌株微生物菌劑的開發(fā)和應(yīng)用，提供理論基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 菌種ZDC-01，是由本實驗室從中國科學(xué)院海洋研究所提供的海洋細菌中篩選得到，通過生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析確定為地下芽孢桿菌，菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏編號：CGMCC No.12216）。

1.1.2 培養(yǎng)基（1）固體種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母浸粉1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%；（2）液體種子培養(yǎng)基：其組成除不加瓊脂粉外，其他成分同固體種子培養(yǎng)基；（3）初始發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉3.0%，豆餅粉2.0%，葡萄糖0.5%，魚粉0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4.7H2O 0.02%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.1%。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面種子培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)24h，備用。

1.2.2 種子液的制備 取一環(huán)活化的菌種，接入裝量為50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，160r/min培養(yǎng)24h，備用。

1.2.3 搖瓶培養(yǎng) 分別取2mL種子液接入盛有100mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中（接種量為2%，v/v），pH調(diào)至7.0，30℃，160r/min振蕩培養(yǎng)48h，進行單因素和正交試驗的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件研究。

1.2.4 測定方法 活菌數(shù)測定：采用平板計數(shù)法[14]。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基單因子篩選（1）可溶性淀粉：在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，固定其他因子，依次改變可溶性淀粉的量為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0，取種子液2mL移至裝液量為100mL/250mL的各個發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160r/min振蕩培養(yǎng)48h后，采用稀釋平板法統(tǒng)計活菌數(shù)。初始培養(yǎng)基作對照，每個處理重復(fù)3次。（2）豆餅粉：在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，固定其他因子，依次改變豆餅粉的量為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。以下步驟同可溶性淀粉。（3）MgSO4·7H2O：在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，固定其他因子，依次改變MgSO4.7H2O的量為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%。以下步驟同可溶性淀粉。

1.2.6 發(fā)酵條件單因子篩選 采用最適培養(yǎng)基配方，對菌株ZDC-01的接菌量、溫度、轉(zhuǎn)速、起始pH值及裝液量等發(fā)酵條件繼續(xù)進行優(yōu)化。發(fā)酵基本條件為250mL三角瓶裝入100mL最適培養(yǎng)基，接種量2%，pH調(diào)至7.0，30℃，160r/min搖床恒溫振蕩培養(yǎng)48h，每處理重復(fù)3次，初始培養(yǎng)條件作對照，優(yōu)化1個因素時其他條件保持不變。接菌量分別按照1%、2%、3%、5%、8%的體積百分?jǐn)?shù)；發(fā)酵溫度分別設(shè)為25、28、30、37、42℃；轉(zhuǎn)速分別為160、180、200、220r/min；培養(yǎng)基起始pH分別調(diào)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；在250mL的三角瓶中分別裝入25、50、75、100mL發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化裝液量。

1.2.7 正交試驗設(shè)計 首先采用單因子試驗，在以上單因子試驗發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中得到的可溶性淀粉（A）、豆餅粉（B）、MgSO4.7H2O（C）進行3因素3水平的正交試驗。發(fā)酵條件優(yōu)化中得到的溫度（A）、轉(zhuǎn)速（B）、裝液量（C），進行3因素3水平的正交試驗。采用L9（33）正交表（表1）確定各因子的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基單因子篩選 當(dāng)可溶性淀粉含量為2.0%、3.0%、4.0%時，測得活菌數(shù)較多（圖1）；當(dāng)豆餅粉含量為2.0%、3.0%、4.0%時，測得活菌數(shù)較多（圖2）；當(dāng)MgSO4·7H2O的量為0.02%、0.03%、0.04%時，測得活菌數(shù)較多（圖3）。因此，選擇可溶性淀粉含量為2.0%、3.0%、4.0%，豆餅粉含量為2.0%、3.0%、4.0%，MgSO4·7H2O的量為0.02%、0.03%、0.04%這9個處理進行正交試驗。

2.3 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和條件

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果及分析 試驗方案設(shè)計及結(jié)果見表2。由表2的極差分析結(jié)果可知，各因素對菌株ZDC-01的活菌數(shù)的影響的主次順序為豆餅粉（因素B）>可溶性淀粉（因素A）>MgSO4·7H2O（因素C），通過直觀分析得到最佳組合為A3B3C1，即可溶性淀粉4.0%，豆餅粉4.0%，MgSO4·7H2O 0.02%。

2.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果及分析 試驗方案設(shè)計及結(jié)果見表4。由表4的極差分析結(jié)果可知，各因素對菌株ZDC-01活菌數(shù)影響的主次順序為裝液量（因素C）>轉(zhuǎn)速（因素B）>溫度（因素A），通過直觀分析得到最佳組合為A2B2C3，即溫度30℃、轉(zhuǎn)速180r/min、裝液量100mL/250mL。

2.3.3 生長曲線 地下芽孢桿菌ZDC-01的生長曲線如圖9所示。由圖9可知，發(fā)酵開始后的12～30h，菌株處于對數(shù)生長期，活菌數(shù)迅速增多；之后曲線平穩(wěn)，進入穩(wěn)定期；在培養(yǎng)的后期，菌株開始出現(xiàn)衰亡，部分菌株開始自溶；發(fā)酵培養(yǎng)到48h，達到生長最佳期，有效活菌數(shù)量達到38×109cfu/mL。因此，最佳發(fā)酵培養(yǎng)時間控制在48h較為合理。

2.4 驗證試驗 搖瓶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化后有效活菌數(shù)為38×109cfu/mL，優(yōu)化前的有效活菌數(shù)為23×109cfu/mL，優(yōu)化率為65.22%。經(jīng)過單因子篩選和正交試驗優(yōu)化后，菌株ZDC-01的有效活菌數(shù)明顯提升，優(yōu)化效率顯著。

3 討論與結(jié)論

芽孢桿菌作為生防菌，具有對人畜無害、不污染環(huán)境且其繁殖能力強、易于工業(yè)化生產(chǎn)等特點，其在生物肥料和生物農(nóng)藥開發(fā)領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種脂肽類抗菌物質(zhì)[15-17]，其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生主要受培養(yǎng)基的成分、發(fā)酵條件以及復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)機制的綜合影響[18]。不同培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件可顯著影響菌株代謝物質(zhì)的產(chǎn)量及生長[19]。（下轉(zhuǎn)93頁）（上接35頁）目前，微生物農(nóng)藥大多是以活菌制劑為主，發(fā)酵工藝不穩(wěn)定和活菌數(shù)不高是研究和生產(chǎn)中常見問題，因此生防菌株的發(fā)酵生產(chǎn)工藝是決定其能否被開發(fā)為生物農(nóng)藥的關(guān)鍵[20]。endprint

發(fā)酵工藝的優(yōu)化是微生物發(fā)酵產(chǎn)品成功實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)，本試驗通過使用單因子試驗法和正交試驗法對地下芽孢桿菌ZDC-01發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，以期獲得菌株ZDC-01的最佳發(fā)酵工藝，大幅度提高其生物發(fā)酵效率，為產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)及大面積推廣地下芽孢桿菌微生物菌劑提供理論依據(jù)。以活菌數(shù)為指標(biāo)，最終確定了菌株ZDC-01的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉2.0%，豆餅粉3.0%，葡萄糖0.5%，魚粉0.5%，K2HPO4 0.03%，CaCO3 0.5%，MgSO4·7H2O 0.03%，（NH4）2SO4 0.1%，NaCl 0.3%，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時間48h，接菌量3%，溫度30℃、起始pH為7.0、轉(zhuǎn)速200r/min、裝液量50mL/250mL，優(yōu)化后發(fā)酵液中的活菌數(shù)較優(yōu)化前提高65.22%，優(yōu)化效率十分顯著。

本研究對地下芽孢桿菌ZDC-01的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件僅進行了搖瓶發(fā)酵的初步研究，接下來需要進一步通過發(fā)酵罐放大試驗來驗證確定的發(fā)酵參數(shù)，從而更好地為其工業(yè)發(fā)酵并將該菌株用于植物病害的生物防治提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1]張立欽，吳甘霖.農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染防治與生物修復(fù)[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2005.

[2]向亞萍，陳志誼，羅楚平，等.芽孢桿菌的抑菌活性與其產(chǎn)脂肽類抗生素的相關(guān)性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（20）：4064-4076.

[3]王全，王占利，高同國，等.響應(yīng)面法對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）12-7產(chǎn)抗菌蛋白條件的優(yōu)化[J].棉花學(xué)報，2016，28（3）：283-290.

[4]王宏鵬，樓堅，陳麗春，等.芽孢桿菌HZ-16發(fā)酵產(chǎn)物中的環(huán)二肽類化學(xué)成分[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017，29（5）：783-786.

[5]權(quán)春善，王軍華，徐洪濤，等.一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究[J].微生物學(xué)報，2006，46（1）：7-12.

[6]WICHITRA L，PUNPEN H，SAMERCHAI C.Growth inhibitory properties of Bacillus subtilis strains and their metabolites against the green mold pathogen（Penicillium digitatum Sacc.）of citrus fruit[J].Postharvest Biology and Technology，2008，48（1）：113-121.

[7]SWAIN M R，RAY R C.Biocontrol and other beneficial activities of Bacillus subtilis isolated from cow dung microflora[J].Biosci Biotechnol Biochem，2009，164：121-130.

[8]牛燕燕，鄭彩娟.產(chǎn)生物活性物質(zhì)的海洋微生物研究概況[J].廣州化工，2013（10）：1-2+5.

[9]Prasanna，Habbu，jayanand，et al.Antimicrobial metabolites from marine microorganisms[J].中國天然藥物，2016（2）：101-116.

[10]關(guān)星葉，李紅權(quán)，肖勤.海洋天然活性物質(zhì)的藥用研究進展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2017，34（4）：332-336.

[11]陳香，唐彤彤，孫星，等.海洋短小枯草芽孢桿菌的鑒定及抑菌活性分析[J].微生物學(xué)雜志，2017，37（1）：7-13.

[12]張君，任鵬飛，田黎，等.海洋芽孢桿菌B-9987中抗MDR菌活性成分研究[J].中國海洋藥物，2016，（5）：45-49.

[13]石靈芳，姜明國，吳家法，等.海洋枯草芽孢桿菌UMBR1027產(chǎn)抑金黃色葡萄球菌活性蛋白分離鑒定及發(fā)酵條件進行優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2016，24（9）：1354-1363.

[14]沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2007：28-34.

[15]益生芽孢桿菌脂肽類抑菌成分的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析[J].動物營養(yǎng)學(xué)報，2017，29（4）：1191-1197.

[16]基于NRPS基因篩選鑒定產(chǎn)生環(huán)脂肽葡萄附生細菌的研究[J].食品工業(yè)科技，2017（12）：164-170.

[17]芽孢桿菌脂肽類抗生素的研究進展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（12）：2817-2820.

[18]馬桂珍，葛正華，劉兆善，等.海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[J].作物雜志，2013（3）：36-41.

[19]Rahman M S，Ano T，Shoda M.Second stage production of iturin A by induced germination of Bacillus subtilis RB14[J].Journal of Biotechnology，2006，125（4）：513-515.

[20]郭龍濤，邱思鑫，蔡學(xué)清，等.內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TB2 液體發(fā)酵條件的研究[J].熱帶作物學(xué)報，2010，31（2）：259-264.

（責(zé)編：張宏民）endprint