賀燕妮 ，范晴 ，張彤 ，杜凌波 ，朱瑞政 ，曾義斌 ，龐艷花 ，汪五清

（1．上海閔行區(qū)中心醫(yī)院，上海 201199；2．上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院，上海201499）

·論著·

斑禿患者Th17、Th22及其細(xì)胞因子水平的變化及意義

賀燕妮1，范晴2，張彤1，杜凌波1，朱瑞政1，曾義斌1，龐艷花1，汪五清1

（1．上海閔行區(qū)中心醫(yī)院，上海 201199；2．上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院，上海201499）

目的探討斑禿患者Th17、Th22及其細(xì)胞因子水平的變化及意義，從免疫學(xué)方面分析T淋巴細(xì)胞在是否在斑禿發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。方法隨機(jī)選取我院皮膚科于2016年1月—2016年10月收治的斑禿患者38例，為觀察組；隨機(jī)選取同期健康體檢者38例，為對(duì)照組，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17及Th22表達(dá)水平，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）－22及IL－17水平，比較2組受試者Th17、Th22及其細(xì)胞因子水平。結(jié)果觀察組血清Th17、Th22表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0．05）；觀察組 IL－22、IL－17 水平均高于對(duì)照組（P＜0．05）；脫發(fā)面積和 Th17、Th22 及其細(xì)胞因子表達(dá)水平均呈正相關(guān)（P＜0．05）。結(jié)論斑禿患者外周血中Th17、Th22及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平均高于健康對(duì)照者，本研究將為斑禿的診療與預(yù)后評(píng)估方面提供一定參考。

斑禿；Th17；Th22；白細(xì)胞介素－17；白細(xì)胞介素－22

斑禿（Alopecia areata，AA）是表現(xiàn)為局限性斑片狀脫發(fā),具有慢性炎癥性質(zhì)的疾病，容易復(fù)發(fā)，任何毛發(fā)部位均可受累，年輕人多發(fā)。目前本病病因不明，但研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病可能與神經(jīng)精神因素、免疫功能異常、內(nèi)分泌障礙和遺傳因素等相關(guān)[1]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，本病是以毛囊為靶器官，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病[2]。為進(jìn)一步探討Th17、Th22及其細(xì)胞因子在斑禿患者外周血中的表達(dá)及意義，本研究收集了斑禿患者與健康體檢者的血清進(jìn)行對(duì)比研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取我院皮膚科在2016年1月—2016年10月收治的斑禿患者38例，所有患者均符合《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，入選前2個(gè)月內(nèi)未接受全身皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑等藥物治療，均在患者的知情同意下進(jìn)行，并經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。無(wú)假性禿發(fā)、先天性禿發(fā)、孕婦、嚴(yán)重心腎功能疾病、精神病者。男20例，女18例，年齡 18～55 歲，平均（36．12±6．12）歲；12 例全禿者，26例局限性斑禿者。隨機(jī)選取同期至我院進(jìn)行體檢的健康者38例，通過(guò)體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常。男24例，女14例，年齡18～56歲，平均（37．21±6．05）歲。2 組在性別、年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），有可比性。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 儀器與試劑 FACS Calibur型流式細(xì)胞儀及配套試劑盒：美國(guó)BD公司；人白細(xì)胞介素（IL）－22 ELISA試劑盒以及人IL－17 ELISA試劑盒：上海博華生物科技有限公司。

1.2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng) 所有患者及體檢者于清晨空腹抽血，外周血加入用肝素鈉抗凝，離心，去除血漿后充分混勻；吸取4 mL淋巴細(xì)胞分離液置入10 mL的離心管內(nèi)，將離心管傾斜，沿離心管壁緩慢注入全血，盡量不讓血液進(jìn)入淋巴細(xì)胞分離液中。以1 700轉(zhuǎn)/min離心30 min后，取出離心管中間的白膜層，將其轉(zhuǎn)移至另1個(gè)離心管內(nèi)，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）充分混勻，以1 800轉(zhuǎn)/min離心15 min洗滌后，加入培養(yǎng)液，混勻。吸取200 μL細(xì)胞混懸液，裝入孵育板中，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)4 h。

1.2.3 Th17及Th22的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 4 h后取出孵育板，吸取細(xì)胞混懸液，裝入流式管，加入PBS緩沖液吹打混勻，以1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min，洗滌1遍。去除上清液，加入50 μL破膜劑，加入1μL的IL－17及IL－22的熒光標(biāo)記抗體，混勻，置于4℃冰箱內(nèi)保存，備用。24 h后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用 Flowjo（V7．6．2）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4 IL－17、IL－22酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 取足量酶標(biāo)包板，固定于框架上，設(shè)置3孔，分別為標(biāo)準(zhǔn)品孔（50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品）、待測(cè)樣本孔（40 μL 稀釋液+10 μL待測(cè)樣本）以及空白對(duì)照孔（不加任何物質(zhì)），置于恒溫箱中30 min。取出酶標(biāo)包板，待干燥后，加入稀釋后的洗滌液，1 min后，甩去洗滌液。除空白對(duì)照孔外，其余2孔各加入50 μL酶標(biāo)工作液，置于恒溫箱中30 min，再次洗板，每1孔內(nèi)各加入50 μL顯色劑A液以及50 μL顯色劑B液，均勻混合，置于恒溫箱中15 min。取出酶標(biāo)包板，每1孔內(nèi)加入50 μL終止液。采用450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔內(nèi)的吸光值。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并記錄2組受試者外周血中Th17、Th22 及 IL－17、IL－22 的表達(dá)水平，測(cè)定并計(jì)算患者的脫發(fā)面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Th17、Th22及其細(xì)胞因子的表達(dá)水平均采用（±s）表示，2個(gè)均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用一元線性回歸法分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Th17與Th22細(xì)胞水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果示，對(duì)照組和觀察組Th17細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞比例分別為（1．21±0．24）%和（2．98±0．87）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)圖 1。全禿患者和局限性斑禿者Th17占外周血CD4+T細(xì)胞比例分別為（3．64±2．32）%和（2．17±1．14）%，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)圖 2。對(duì)照組和觀察組Th22細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞比例分別為（1．48±0．28）%和（3．63±1．19）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。全禿患者和局限性斑禿者 Th17占外周血 CD4+T 細(xì)胞比例分別為（4．33±1．48）%和（3．11±1．12）%，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

2.2 外周血IL－22、IL－17的表達(dá)水平比較 觀察組患者外周血中IL－17及IL－22表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與局限性斑禿患者相比，全禿患者外周血中IL－22和IL－17水平進(jìn)一步升高（P＜0．05），見(jiàn)表 1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)斑禿患者和正常對(duì)照組外周血中Th17細(xì)胞所占比例變化

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)斑禿患者和正常對(duì)照組外周血中Th22細(xì)胞所占比例變化

表1 外周血IL-22、IL-17的表達(dá)水平比較

2.3 外周血 IL-17、IL-22、Th17、Th22 百分比與脫發(fā)面積的相關(guān)性 采用一元線性回歸分析法發(fā)現(xiàn)，觀察組外周血中IL-17與脫發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.432，P<0.05），IL-22 與脫發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.569，P<0.05）；Th17與脫發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.326，P<0.05）,Th22與脫發(fā)面積呈正相關(guān)（r=0.326，P<0.05）。

3 討論

現(xiàn)代研究認(rèn)為，斑禿是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的具有器官特異性的自身免疫性疾病，毛球周圍T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是其主要病理特征之一[3]。Th17細(xì)胞是最早由Park等[4]在自身免疫性腦脊髓炎和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞的亞群，此細(xì)胞亞群的分化與Th1和Th2細(xì)胞都不相同。Th17細(xì)胞可以特異性分泌 IL-6、IL-17、IL-21、IL-22 以及TGF-α等細(xì)胞因子，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。據(jù)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，斑禿患者病灶處毛囊周圍可找到IL-17浸潤(rùn)，提示斑禿的發(fā)生可能與毛囊周圍浸潤(rùn)的細(xì)胞產(chǎn)生了IL-17，引起自身免疫應(yīng)答有關(guān)[5-6]。Th22細(xì)胞,是最新發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群，其效應(yīng)與其他CD4+T細(xì)胞亞群相似。Th22細(xì)胞不僅能夠誘導(dǎo)其他細(xì)胞的分化，并且還參了與T細(xì)胞亞群的極化過(guò)程，調(diào)節(jié)自身免疫疾病的免疫應(yīng)答，參與皮膚病理狀態(tài)的發(fā)展。Th22細(xì)胞除主要分泌IL-22外，還可分泌 IL-10、IL-13、IL-26、TNF-α 等細(xì)胞因子，其主要功能是通過(guò)IL-22來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Th22細(xì)胞可誘導(dǎo)補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路途徑中的因子活化，啟動(dòng)補(bǔ)體應(yīng)答通路，可能具有促進(jìn)機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用。研究表明，Th22細(xì)胞參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展，如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、銀屑病等疾病[7]。通常Th22細(xì)胞與其他的細(xì)胞亞群可相互調(diào)控，從而使得機(jī)體處于相對(duì)平衡的狀態(tài)。

目前，對(duì)于斑禿患者的外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、TGF-β1等的研究較多，但對(duì)于Th17、Th22及其細(xì)胞因子水平在斑禿患者中的表達(dá)研究較少[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，斑禿患者的外周血中Th17、Th22細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)均高于對(duì)照組患者，且隨著患者病情的嚴(yán)重程度，表達(dá)亦增高，呈正相關(guān)。

綜上，斑禿患者外周血中Th17、Th22及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平均高于健康對(duì)照者，但這些因子的變化是原發(fā)因素還是繼發(fā)因素，尚待進(jìn)一步研究，本研究將為斑禿的診療與預(yù)后評(píng)估方面提供一定參考。

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Role of Th17 Cells,Th22 Cells and Their Relative Cytokines in the Pathogenesis of Alopecia Areata

He Yanni1,Fan Qing2,Zhang Tong1,Du Lingbo1,Zhu Ruizheng1,Pang Yanhua1,Wang Wuqing1
1.Shanghai Minhang District Central Hospital,Shanghai 201199,China;2.Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital South Campus,Shanghai 201499,China

ObjectiveIn order to determine the frequency of Th17 cells,Th22 cells and expression of their related cytokines in peripheral blood of patients with alopecia areata （AA）,and investigate their significance,as well as explore the role of T lymphocytes in the occurrence of AA．MethodsA total of 38 patients with AA were enrolled from our hospital from January 2016 to October 2016,and served as the case group．At the same time,38 healthy people were taken as the control group．Peripheral blood samples were obtained from these patients and controls．Flow cytometry was performed to determine the percentage of Th17 cells,Th22 cells,and enzyme－linked immunosorbent assay （ELISA）was used to measure serum levels of interleukin （IL）－22 and IL－17．ResultsCompared with the control group,the case group showed significant increasing percentages of Th17 cells,Th22 cells （P＜0．05）,as well as serum levels of IL－17 and IL－22（P＜0．05）．Conclusion Th17cells,Th22 cells and their related cytokines may participate in the occurrence,development and prognosis of AA．

Alopecia areata;Th17;Th22;Interleukin－17;Interleukin－22

R758．71

A

1672－0709（2017）05－0385－04

上海市閔行區(qū)自然科學(xué)研究課題（2015MHZ017）

汪五清，E－mail：wuqingw2006@sina．com

2016-09-08）