馬 迪 王桂清 張 賽

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

不同國槐根莖腐爛病鐮刀型致病菌的同工酶分析①

馬 迪 王桂清 張 賽

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對分離于聊城地區(qū)國槐根莖腐爛病的24個鐮刀菌菌株進(jìn)行了可溶性蛋白質(zhì)和同工酶電泳圖譜分析及聚類分析，明確了鐮刀菌生理分化的物質(zhì)基礎(chǔ).研究表明，鐮刀菌在可溶性蛋白質(zhì)和EST、SOD、PPO、POD等同工酶存在差異，不同菌株之間某些同工酶譜帶數(shù)和同一遷移率譜帶的亮度和色澤差異非常顯著，說明鐮刀菌不同種或同種不同菌株間的多態(tài)性可在同工酶水平上得到反映.研究還發(fā)現(xiàn)，同工酶的變化與鐮刀菌的種類以及侵染部位密切相關(guān).

鐮刀菌，可溶性蛋白質(zhì)，同工酶，聚類分析

傳統(tǒng)意義上，真菌主要根據(jù)菌落及繁殖器官的形態(tài)特征進(jìn)行分類.鐮孢菌由于生境復(fù)雜，其用于分類的許多形態(tài)特征指標(biāo)容易受培養(yǎng)基營養(yǎng)條件、光質(zhì)光強(qiáng)、溫濕度等環(huán)境條件影響，產(chǎn)生變異，從而導(dǎo)致形態(tài)分類較困難.同工酶研究即是在種和亞種水平上對真菌進(jìn)行鑒定的一種有效工具，也是對不同真菌進(jìn)行種間或種內(nèi)分析的一種有用手段[1]，技術(shù)成熟，應(yīng)用廣泛.本研究采用同工酶/可溶性蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)，對來源于聊城地區(qū)引起國槐根莖腐爛病的不同鐮刀菌菌株進(jìn)行分析，從蛋白質(zhì)和酶學(xué)水平上的多態(tài)性分析鐮刀菌生理分化的物質(zhì)基礎(chǔ)特征，為研究其生理生化特性、致病性分化等奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1．1 供試菌株

供試病原菌為引起國槐根莖腐爛病的鐮刀菌，來源于山東省聊城市不同街區(qū)、不同發(fā)病部位，經(jīng)單胞分離純化，共24個菌株.于PDA培養(yǎng)基25±1 ℃恒溫條件培養(yǎng)5 d，備用.

1．2 酶蛋白的制備與提取

自菌落邊緣，用直徑7 mm的打孔器打取菌片，接種于PA培養(yǎng)液中，每瓶15個菌片，于25±1 ℃120 rpm條件下振蕩培養(yǎng)6 d，抽濾獲取菌絲，蒸餾水沖洗3次，吸干水分備用.按王桂清等方法[2]提取酶蛋白， 1 g菌絲，加入5.0 mL0.l mol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0)，冰浴研磨，4 ℃2 000 rpm條件下離心20 min，上清液即為酶蛋白，置于-20 ℃冰箱備用.

1．3 蛋白質(zhì)及同工酶電泳凝膠染色

參照胡能書[3]方法制膠及非變性PAGE電泳.其中分離膠濃度7.5%，膠內(nèi)電壓90 V；濃縮膠濃度3%，膠內(nèi)電壓80 V.

可溶性蛋白質(zhì)(Soluble protein)、酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的染色分別參照李成文[4]、趙玉錦[5]、羅廣華[6]、褚西寧[7]和袁鳳杰[8]的方法.

1．4 電泳圖譜的聚類分析

測量凝膠圖譜中各譜帶的泳動距離，計(jì)算Rf 值.將電泳后獲得的每一條譜帶的有無作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，有酶帶記為“1”，無酶帶記為“0”，從而得到電泳的“0、1”矩陣，運(yùn)用NTSYS2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，生成24個鐮刀菌菌株可溶性蛋白和同工酶電泳聚類分析樹狀圖.

Rf 值的計(jì)算公式為

2 結(jié)果與分析

2．1 病菌可溶性蛋白質(zhì)和同工酶電泳圖譜分析

2．1．1 譜帶數(shù)量分析.引起國槐根莖腐爛病的24個鐮刀菌菌株的可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜如圖1所示.不同的鐮刀菌菌株在可溶性蛋白質(zhì)和同工酶電泳圖譜的譜帶數(shù)量上存在一定的差異：

可溶性蛋白質(zhì)(Soluble protein)標(biāo)記比較豐富，不同來源的24個鐮刀菌菌株共分離出了32條譜帶，其中供試菌株G1的譜帶最多，為24條，供試菌株J10-4的譜帶最少，為12條，譜帶在凝膠的上、中、下各部都有分布.共同譜帶有5條，Rf值分別為0.027，0.065，0.087，0.130和0.913，占所有譜帶的15.6%，特異性譜帶有27條，占所有譜帶的84.4%，說明，24個供試菌株在可溶性蛋白質(zhì)水平上差異較大，生理分化明顯.

酯酶(EST)電泳圖譜也是標(biāo)記最豐富的同工酶圖譜之一，供試菌株共分離出21條顏色較深且清晰可見的譜帶，其中共同譜帶3條，Rf值分別為0.096，0.277和0.511，占所有譜帶的14.3%，特異性譜帶18條，占所有譜帶的85.7%.同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同菌株譜帶數(shù)量差異較大，供試菌株J10-4和G1的譜帶最多，為11條，菌株J7-7、J7-2和J10-5的譜帶最少，為5條，譜帶在凝膠的上、中、下各部都有分布.

超氧化物歧化酶(SOD)同工酶的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖譜(圖1)顯示，供試菌株SOD同工酶電泳產(chǎn)生的條帶數(shù)遠(yuǎn)少于可溶性蛋白和EST，不同來源的24個鐮刀菌菌株共分離出了10條清晰透明的SOD譜帶，其中供試菌株J7-3的譜帶最多，為8條，供試菌株J7-2的譜帶最少，為2條，譜帶主要分布在凝膠的中部.共同譜帶2條，Rf值分別為0.333和0.479，占所有譜帶的20%；特異性譜帶8條，占比80%.多數(shù)菌株的譜帶數(shù)在3-5條之間，有一定的相似性.

病菌多酚氧化酶(PPO)電泳結(jié)果(圖1)顯示，供試菌株共分離出11條PPO譜帶，無共同譜帶，均為特異性譜帶.其中供試菌株J7-3的譜帶最多，為6條，菌株G4-3沒有譜帶，菌株G4-2、G5-3、G5-4、J9-4、J10-3和J10-4都只有1條PPO譜帶，主要分布在凝膠的中上部.

過氧化物酶(POD)同工酶譜帶數(shù)很少，僅4條，且沒有共同譜帶，均為特異性譜帶.其中供試菌株J10-4的譜帶最多，為2條(Rf1=0.056，Rf3=0.222)；菌株G3在Rf2=0.167處、G6在Rf3=0.222處、G5-2在Rf4=0.264處和G4-1、G4-2、G5-4、J7-3、J9-2、J9-3、J9-4和J10-5在Rf1=0.056處各有1條POD譜帶；其余12個菌株沒有譜帶，主要分布在凝膠上部.

2．1．2 譜帶顏色分析.從電泳圖譜(圖1)可以看出，不同鐮刀菌菌株的可溶性蛋白和同工酶譜帶不僅在數(shù)量上有差異，而且相同譜帶的顏色和寬度也存在差異，說明酶帶活性不同，酶帶越寬、顏色越深，酶帶活性越高.如菌株G5-4和J7-1.兩者在可溶性蛋白質(zhì)(Soluble protein)圖譜中Rf8=0.065處和在酯酶(EST)圖譜中Rf5=0.096處的譜帶顏色明顯不同，J7-1的明顯比G5-4的深，即該處菌株J7-1的酶帶活性比G5-4的高；再如SOD酶，24個菌株在Rf9=0.479處的共同譜帶顏色和寬度明顯不同，菌株J7-7、G5-1和G5-2的譜帶明顯比其它菌株的深且寬，即這些菌株在該處的酶帶活性高.

圖1 不同鐮刀菌可溶性蛋白質(zhì)和同工酶電泳圖譜注：圖譜從左到右依次為供試菌株G1、G2、J7-7、G4-3、G5-3、G6、G3、G4-1、G4-2、G5-1、G5-2、G5-4、J7-1、J7-2、J7-3、J7-5、J8、J9-1、J9-2、J9-3、J9-4、J10-3、J10-4、J10-5.

2．2 病菌同工酶水平上的聚類分析

根據(jù)可溶性蛋白及EST、SOD、POD和PPO 4種同工酶譜帶，運(yùn)用NTSYS軟件得出聚類樹狀圖(圖2).從圖中可以看出供試菌株的相似系數(shù)在0.60-0.93之間，說明24個鐮刀菌菌株可溶性蛋白及4種同工酶譜帶存在多樣性.以相似系數(shù)67%為閾值，可將供試菌株分為5個組(如表1)，第Ⅰ組只包括菌株G1；第Ⅱ組包括菌株G2和J7-7；第Ⅲ組包括菌株G4-3和G6；第Ⅳ組比較大，包括G5-3、G4-2、G5-1、G5-2、G5-4、G3和G4-1共7個菌株，這7個菌株又可以相似系數(shù)72.5%為閾值分為3個亞組，其中菌株G5-3、G4-2和G5-1為一亞組，菌株G5-2和G5-4為一亞組，菌株G3和G4-1為一亞組；第Ⅴ組最大，包括12個菌株，即J7-1、J7-2、J7-5、J8-1、J9-1、J9-2、J10-3、J9-3、J9-4、J7-3、J10-5和J10-4，12個菌株又可根據(jù)相似系數(shù)83.5%為閾值分為4個亞組，其中菌株7-1和7-2為一個亞組，菌株7-5、8-1、9-1、9-2、10-3、9-3和9-4為一個亞組，菌株7-3和10-5為一個亞組，菌株10-4為一個亞組.

圖2 不同鐮刀菌菌株可溶性蛋白及4種同工酶水平上的聚類分析

形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果[9]表明，第Ⅳ組和第Ⅴ組的19個菌株均為腐皮鐮刀菌(F.solani)，而在同工酶分組中卻分屬兩組，第Ⅳ組中的7個菌株均分離于國槐根部(菌株號以G開頭)，而第Ⅴ組中的12個菌株則分離于國槐莖部(菌株號以J開頭).說明可溶性蛋白和同工酶聚類分組既與病原菌種類有關(guān)，又與同種病菌不同菌株的分離部位密切相關(guān).

表1不同鐮刀菌菌株的分組結(jié)果

組號菌株號ⅠG1ⅡG2、J7?7ⅢG4?3、G6ⅣG5?3、G4?2、G5?1、G5?2、G5?4、G3、G4?1ⅤJ7?1、J7?2、J7?5、J8?1、J9?1、J9?2、J10?3、J9?3、J9?4、J7?3、J10?5、J10?4

3 結(jié)論與討論

3．1 國槐根莖腐爛病鐮刀型致病菌在同工酶水平上存在多態(tài)性

同工酶作為一類蛋白質(zhì)，普遍存在于生物的同一種屬或同一個體的不同組織，甚至同一組織、同一細(xì)胞中，同工酶的研究已經(jīng)成為形態(tài)遺傳學(xué)的重要內(nèi)容.本試驗(yàn)通過對國槐根莖腐爛病鐮刀型致病菌可溶性蛋及EST、SOD、POD和PPO的PAGE電泳，結(jié)果表明，供試菌株產(chǎn)生了大量的條帶，表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性；電泳譜帶相似系數(shù)為62%以上，說明可溶性蛋白和同工酶圖譜具有屬、種的特異性；供試菌株不僅在可溶性蛋白質(zhì)和同工酶的譜帶數(shù)量上存在差異，而且同一遷移率的譜帶在色澤深度和亮度上也存在明顯不同，說明供試菌株在酶活性方面也存在分化性或多態(tài)性，該研究與Huss等學(xué)者[10～12]的研究結(jié)果相一致.紋枯病菌、核盤菌、辣椒疫霉菌等在可溶性蛋白質(zhì)和同工酶水平上也存在多態(tài)性[13-15]，說明可溶性蛋白質(zhì)和同工酶已在多種病原菌生理分化中作為輔助鑒別的生化標(biāo)記.

3．2 酶學(xué)聚類分析結(jié)果與鐮刀菌的種類和侵染部位密切關(guān)系

根據(jù)可溶性蛋白及EST、SOD、POD和PPO四種同工酶進(jìn)行電泳，聚類分析結(jié)果表明，不同的鐮刀菌種類分屬于不同的組；19個腐皮鐮刀菌菌株分屬于兩個不同的組，第Ⅳ組中的7個腐皮鐮刀菌菌株均分離于國槐根部(菌株號以G開頭)，而第Ⅴ組中的12個腐皮鐮刀菌菌株則分離于國槐莖部(菌株號以J開頭)，說明酶學(xué)聚類分組與同種病菌不同菌株的分離部位有密切的關(guān)系.鐮刀菌種類和侵染國槐不同部位的腐皮鐮刀菌在酶學(xué)性質(zhì)方面存在差異，這種差異可能會導(dǎo)致致病性或致病機(jī)理方面的差異.陳偉群[16]研究表明，可溶性蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)可以明確地將不同鏈格孢菌屬Alternaria菌株鑒定到種級水平.鄒慶道[17]、車建美等[18]研究表明，同一寄主來源的禾谷鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的基因表達(dá)均存在一定的差異，存在分離部位分化現(xiàn)象.作為基因表達(dá)的產(chǎn)物，酶能夠從分子水平上間接地反映生物間的遺傳變異.同工酶電泳技術(shù)以生化表現(xiàn)型反映基因型，已成為真菌親緣關(guān)系研究的一項(xiàng)重要輔助手段，在菌物分類和鑒定中得到了充分的應(yīng)用.

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TheIsozymeAnalysisofDifferentFusariumsp.CausingChineseScholartreeRootRotDisease

MA Di WANG Gui-qing ZHANG Sai

(School of Agronomy，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China)

24Fusariumstrains of Chinese scholartree root rot pathogen collected from Shandong province Liaocheng area were clustered based on their soluble protein and isozyme profiles obtained through native PAGE in order to base physiologically the pathogen differentiation at protein or isozyme level. A significant diversity ofFusariumwas found in terms of spectrum change of soluble protein and isozyme including EST, SOD, PPO and POD among those strains, and the obvious difference in the numbers of bands and activities of bands with the same Rf value were also detected. These data strongly supported that isozyme polymorphism could be indicators to reveal the pathogen diversity. The results also showed that the changes of isozyme were closely related to the species and the infection site ofFusarium.

Fusariumsp.，soluble protein，isozyme，cluster analysis

2017-05-10

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2012CL17)，聊城市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GJH10)資助

王桂清，E-mail：wangguiqing@lcu.edu.cn.

S792.26;Q939.5

A

1672-6634(2017)03-0064-05