耿 婕，那順朝克圖 ，叢麗華 ，樊精輝，趙春雨，薛培鳳

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110； 2.內(nèi)蒙古宇航人藥業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011517）

高效液相色譜法測(cè)定蒙成藥五味沙棘顆粒中梔子苷含量

耿 婕1，那順朝克圖1，叢麗華2，樊精輝2，趙春雨1，薛培鳳1

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110； 2.內(nèi)蒙古宇航人藥業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011517）

目的 建立測(cè)定蒙成藥五味沙棘顆粒中梔子苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 色譜柱為T(mén)hermo Scientific ODS－2 Hypersil柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為乙腈－0.5%磷酸，梯度洗脫，流速為 1 mL／min，柱溫為 25℃，進(jìn)樣量為20 L，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm。結(jié)果 梔子苷進(jìn)樣量在 0.144～1.44 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0.999 9），平均加樣回收率為 96.11%，RSD＝0.74%(n＝6)。結(jié)論 該方法操作便捷，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適用于測(cè)定蒙成藥五味沙棘顆粒中梔子苷的含量。

高效液相色譜法；五味沙棘顆粒；梔子苷；含量測(cè)定

五味沙棘顆粒由蒙古族清熱祛痰驗(yàn)方五味沙棘散經(jīng)劑型改革而來(lái)，由木香、甘草、白葡萄干、沙棘膏、梔子5味藥材組方，有清熱祛痰、止咳定喘功效，用于肺熱久咳、胸中滿(mǎn)悶、胸脅作痛、慢性支氣管炎見(jiàn)上述證候者[1－2]。原劑型五味沙棘散對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的炎性病變有顯著改善作用，對(duì)小鼠免疫功能有增強(qiáng)作用[3]，對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的肺部病變也有改善作用[4－6]。原劑型五味沙棘散的法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2010年版及2015年版《中國(guó)藥典（一部）》，含量測(cè)定項(xiàng)下均為高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其中木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯含量[7－8]。也有學(xué)者建立了測(cè)定其中梔子苷含量的HPLC法[9－11]。五味沙棘顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅為企業(yè)對(duì)該藥的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為制訂該蒙藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，課題組前期研究建立了測(cè)定其中異鼠李素含量的HPLC法[12]。梔子為本方之佐使藥，對(duì)該制劑的質(zhì)量具有重要作用，其主要有效成分梔子苷具有清肝利膽、消炎鎮(zhèn)痛等多種生物學(xué)效應(yīng)和廣泛的藥理作用[13－15]，但尚無(wú)關(guān)于該制劑中梔子苷含量測(cè)定方法的研究報(bào)道。為此，本研究中建立了測(cè)定五味沙棘顆粒中梔子苷含量的HPLC法，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供了科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）及 Empower色譜工作站（美國(guó) Waters公司）；Thermo Scientific ODS－2 Hypersil色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；KQ －250DA型數(shù)控超聲清洗器（250 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó) IKA公司）；AL204型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞典Mettler Toledo公司）；AB135－S型萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司）。

1.2 試藥

流動(dòng)相所用乙腈為色譜純（Fischer公司）；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；甲醇和磷酸均為分析純（天津市化學(xué)試劑三廠）；梔子苷對(duì)照品（純度≥98%，成都植標(biāo)純化生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為130527）；五味沙棘顆粒（批號(hào) 分別 為 20110102，20110201，20110401，20110701，20130201，20131101，規(guī)格均為每袋 6 g），缺梔子五味沙棘顆粒，均購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古宇航人藥業(yè)有限責(zé)任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific ODS－2 Hypersil色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 － 0.5% 磷酸，洗脫梯度見(jiàn)表 1；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；流速：1 mL ／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度變化

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取適量梔子苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加90%甲醇，制成梔子苷質(zhì)量濃度為0.422 g／L的溶液，微孔濾膜濾過(guò)，即得。

供試品溶液：取五味沙棘顆粒1.3 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加90%甲醇100 mL，密塞，超聲15 min，濾過(guò)，以相同甲醇洗滌藥渣及濾器，每次10 mL，洗滌3次，合并濾液及洗液，蒸干溶劑，用相同甲醇將殘?jiān)D(zhuǎn)溶至25 mL容量瓶中，定容，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按該制劑注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的處方和制備工藝制備缺梔子的五味沙棘顆粒，再按供試品溶液制備方法制備缺梔子的陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析。結(jié)果，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)的色譜峰，而陰性對(duì)照品溶液在此處無(wú)相應(yīng)色譜峰，色譜圖見(jiàn)圖1。表明陰性對(duì)照無(wú)干擾，本方法專(zhuān)屬性良好。

線性關(guān)系考察：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加90%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.072 g／L的梔子苷溶液，精密吸取 2，4，8，12，16，20 μL，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量 （X，μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1.4×106X＋25 973，r＝0.999 9（n＝6）。結(jié)果表明，梔子苷進(jìn)樣量在 0.144 ～ 1.44 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液，進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按2.2項(xiàng)下方法制備同一供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.22%（n＝6），表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取五味沙棘顆粒（批號(hào)為20110701）6份，按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算得梔子苷含量。結(jié)果平均含量為 0.649 9 mg／g，RSD為1.14%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別取五味沙棘顆粒（批號(hào)為20110701）6 份，各約 0.66g，精密稱(chēng)定，分別加入 0.422mg梔子苷對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算梔子苷的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取6批次五味沙棘顆粒各1.33 g，精密稱(chēng)定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算梔子苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 梔子苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 不同批次五味沙棘顆粒的含量測(cè)定結(jié)果（n＝6）

3 討論

3.1 提取方法和提取溶劑的選擇

本研究中采用單因素法對(duì)提取方法（超聲和回流）、提取溶劑（甲醇和乙醇）進(jìn)行考察，結(jié)果表明，超聲提取和回流提取的提取率無(wú)明顯差異，甲醇提取和乙醇提取無(wú)明顯差異，考慮到超聲提取更簡(jiǎn)單便捷，乙醇提取更環(huán)保安全，故選擇乙醇超聲提取。

3.2 提取工藝的優(yōu)化

本研究中以正交試驗(yàn)法 L9（33）對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察了提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)（50%，70%，90%）、用量（25，50，100 mL）以及提取時(shí)間（15，30，45 min）等關(guān)鍵因素，以提取率為主要依據(jù)，確定最佳提取工藝為加90%乙醇100 mL，超聲提取15 min。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)中對(duì)以乙腈－水，乙腈－0.5%磷酸、乙腈－1.0%磷酸和甲醇－0.5%磷酸為流動(dòng)相的色譜分離效果分別進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，以乙腈－0.5%磷酸為流動(dòng)相，分離效果較好，故選擇其為流動(dòng)相梯度洗脫。

經(jīng)以上選擇及優(yōu)化過(guò)程，本試驗(yàn)中建立了測(cè)定五味沙棘顆粒中梔子苷含量的HPLC法，為制訂和完善五味沙棘顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Content Determination of Geniposide in Wuweishaji Granules of M ongolian Patent Medicine by HPLC

Geng Jie1， Nashun Chaoketu1， Cong Lihua2， Fan Jinghui2， Zhao Chunyu1， Xue Peifeng1
（1.School of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot， Inner Mongolia， China 010110； 2.Inner Mongolia Yuhangren Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hohhot，Inner Mongolia，China 011517 ）

Objective To establish an HPLC method for determination of geniposide in Wuweishaji Granules.M ethods The chromatographic column was Thermo scientific ODS－2 Hypersil column （250 mm ×4.6 mm，5 μm），the mobile phase was acetonitrile －0.5% phosphoric acid，gradient elution，the flow rate was 1 mL ／min，the temperature was 25 ℃ ，the sample injection was 20 μL，and the detection wavelength was 237 nm.Results The geniposide showed good linear of 0.144 － 1.44 μg（ r＝ 0.999 9），the average recovery rate was 96.11% ，and theRSD was 0.74% （n ＝ 6）.Conclusion The method is convenient，accurate and reproducible.It is suitable for the determination of geniposide in Wuweishaji Granules of Mongolian patent medicine.

HPLC；Wuweishaji Granules；geniposide；content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)22－0021－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.22.007

內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”工程項(xiàng)目[內(nèi)組通字〔2014〕27號(hào)]。

耿婕，女，漢族，碩士研究生，研究方向?yàn)橹忻伤幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制，（電話(huà)）0471－6653178（電子信箱）gebi＿888＠ 163.com。

薛培鳳，女，漢族，博士研究生，教授，研究方向?yàn)橹忻伤幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制，（電話(huà)）0471－6653146（電子信箱）xpfdc＠ vip.sina.com。

2017－06－06；

2017－06－25)